La espectroscopia ultravioleta (UV) o espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-VIS) [1] [2] [3] se refiere a la espectroscopia de absorción o espectroscopia de reflectancia en parte del ultravioleta y en las regiones visibles adyacentes completas del espectro electromagnético . [2] Al ser relativamente económica y fácil de implementar, esta metodología se usa ampliamente en diversas aplicaciones aplicadas y fundamentales. El único requisito es que la muestra absorba en la región UV-Vis, es decir, que sea un cromóforo . La espectroscopia de absorción es complementaria a la espectroscopia de fluorescencia . Los parámetros de interés, además de la longitud de onda de medición, son la absorbancia (A), la transmitancia (%T) o la reflectancia (%R), y su cambio con el tiempo. [4] [5]
Un espectrofotómetro UV-vis es un instrumento analítico que mide la cantidad de luz ultravioleta (UV) y visible que absorbe una muestra. Es una técnica ampliamente utilizada en química, bioquímica y otros campos para identificar y cuantificar compuestos en una variedad de muestras. [6]
Los espectrofotómetros UV-vis funcionan haciendo pasar un haz de luz a través de la muestra y midiendo la cantidad de luz que se absorbe en cada longitud de onda. La cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentración del compuesto absorbente en la muestra.
La mayoría de las moléculas e iones absorben energía en el rango ultravioleta o visible, es decir, son cromóforos . El fotón absorbido excita un electrón en el cromóforo a orbitales moleculares de mayor energía, dando lugar a un estado excitado . [7] Para los cromóforos orgánicos, se suponen cuatro tipos posibles de transiciones: π–π*, n–π*, σ–σ* y n–σ*. Los complejos de metales de transición suelen estar coloreados (es decir, absorben la luz visible) debido a la presencia de múltiples estados electrónicos asociados con orbitales d no completamente llenos. [5]
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UV/Vis se puede utilizar para monitorear cambios estructurales en el ADN. [8]
La espectroscopia UV/Vis se utiliza habitualmente en química analítica para la determinación cuantitativa de diversos analitos o muestras, como iones de metales de transición , compuestos orgánicos altamente conjugados y macromoléculas biológicas. El análisis espectroscópico se realiza habitualmente en soluciones, pero también se pueden estudiar sólidos y gases.
La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración de las especies absorbentes en la solución y a la longitud del camino. [9] Por lo tanto, para una longitud de trayectoria fija, se puede utilizar la espectroscopía UV/Vis para determinar la concentración del absorbente en una solución. Es necesario saber con qué rapidez cambia la absorbancia con la concentración. Esto puede tomarse de referencias (tablas de coeficientes de extinción molar ), o más exactamente, determinarse a partir de una curva de calibración .
Se puede utilizar un espectrofotómetro UV/Vis como detector para HPLC . La presencia de un analito da una respuesta que se supone es proporcional a la concentración. Para obtener resultados precisos, la respuesta del instrumento al analito desconocido debe compararse con la respuesta a un estándar; esto es muy similar al uso de curvas de calibración. La respuesta (p. ej., altura del pico) para una concentración particular se conoce como factor de respuesta .
Las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlaces en una molécula determinada y son valiosas para determinar los grupos funcionales dentro de una molécula. Las reglas de Woodward-Fieser , por ejemplo, son un conjunto de observaciones empíricas utilizadas para predecir λmax , la longitud de onda de la absorción UV/Vis más intensa, para compuestos orgánicos conjugados como dienos y cetonas . Sin embargo, el espectro por sí solo no es una prueba específica para una muestra determinada. La naturaleza del disolvente, el pH de la solución, la temperatura, las altas concentraciones de electrolitos y la presencia de sustancias que interfieren pueden influir en el espectro de absorción. Las variaciones experimentales, como el ancho de la rendija (ancho de banda efectivo) del espectrofotómetro, también alterarán el espectro. Para aplicar la espectroscopía UV/Vis al análisis, estas variables deben controlarse o contabilizarse para identificar las sustancias presentes. [10]
El método se utiliza con mayor frecuencia de forma cuantitativa para determinar las concentraciones de una especie absorbente en solución, utilizando la ley de Beer-Lambert : [11]
donde A es la absorbancia medida (formalmente adimensional pero generalmente informada en unidades de absorbancia (AU) [12] ), es la intensidad de la luz incidente en una longitud de onda determinada , es la intensidad transmitida, L la longitud del camino a través de la muestra y c la concentración de las especies absorbentes. Para cada especie y longitud de onda, ε es una constante conocida como absortividad molar o coeficiente de extinción. Esta constante es una propiedad molecular fundamental en un disolvente determinado, a una temperatura y presión particulares, y tiene unidades de .
La absorbancia y la extinción ε a veces se definen en términos del logaritmo natural en lugar del logaritmo de base 10.
La ley de Beer-Lambert es útil para caracterizar muchos compuestos, pero no es una relación universal para la concentración y absorción de todas las sustancias. A veces se encuentra una relación polinómica de segundo orden entre absorción y concentración [13] para moléculas muy grandes y complejas, como los tintes orgánicos ( naranja de xilenol o rojo neutro , por ejemplo). [14] [15]
La espectroscopia UV-Vis también se utiliza en la industria de los semiconductores para medir el espesor y las propiedades ópticas de películas delgadas en una oblea. Los espectrómetros UV-Vis se utilizan para medir la reflectancia de la luz y pueden analizarse mediante las ecuaciones de dispersión de Forouhi-Bloomer para determinar el índice de refracción ( ) y el coeficiente de extinción ( ) de una película determinada en todo el rango espectral medido. [dieciséis]
La ley de Beer-Lambert tiene supuestos implícitos que deben cumplirse experimentalmente para que se aplique; de lo contrario existe la posibilidad de que se produzcan desviaciones de la ley. [14] Por ejemplo, la composición química y el entorno físico de la muestra pueden alterar su coeficiente de extinción. Por lo tanto, las condiciones químicas y físicas de una muestra de prueba deben coincidir con las mediciones de referencia para que las conclusiones sean válidas. En todo el mundo, farmacopeas como las farmacopeas estadounidense (USP) y europea (Ph. Eur.) exigen que los espectrofotómetros funcionen de acuerdo con requisitos regulatorios estrictos que abarcan factores como la luz parásita [17] y la precisión de la longitud de onda. [18]
El ancho de banda espectral de un espectrofotómetro es el rango de longitudes de onda que el instrumento transmite a través de una muestra en un momento dado. [19] Está determinado por la fuente de luz, el monocromador , su ancho físico de rendija y dispersión óptica y el detector del espectrofotómetro. El ancho de banda espectral afecta la resolución y precisión de la medición. Un ancho de banda espectral más estrecho proporciona mayor resolución y precisión, pero también requiere más tiempo y energía para escanear todo el espectro. Un ancho de banda espectral más amplio permite un escaneo más rápido y sencillo, pero puede dar como resultado una resolución y precisión más bajas, especialmente para muestras con picos de absorción superpuestos. Por lo tanto, elegir un ancho de banda espectral apropiado es importante para obtener resultados confiables y precisos.
Es importante tener una fuente de radiación monocromática para que la luz incidente en la celda de muestra mejore la linealidad de la respuesta. [14] Cuanto más cerca esté el ancho de banda de ser monocromático (unidad de transmisión de longitud de onda), más lineal será la respuesta. El ancho de banda espectral se mide como el número de longitudes de onda transmitidas a la mitad de la intensidad máxima de la luz que sale del monocromador.
El mejor ancho de banda espectral que se puede lograr es una especificación del espectrofotómetro UV, y caracteriza cuán monocromática puede ser la luz incidente. Si este ancho de banda es comparable (o superior) al ancho del pico de absorción del componente de la muestra, entonces el coeficiente de extinción medido no será exacto. En las mediciones de referencia, el ancho de banda del instrumento (ancho de banda de la luz incidente) se mantiene por debajo del ancho de los picos espectrales. Cuando se mide un material de prueba, el ancho de banda de la luz incidente también debe ser suficientemente estrecho. La reducción del ancho de banda espectral reduce la energía pasada al detector y, por lo tanto, requerirá un tiempo de medición más prolongado para lograr la misma relación señal-ruido.
El coeficiente de extinción de un analito en solución cambia gradualmente con la longitud de onda. Un pico (una longitud de onda donde la absorbancia alcanza un máximo) en la curva de absorbancia frente a la longitud de onda, es decir, el espectro UV-VIS, es donde la tasa de cambio de absorbancia con la longitud de onda es la más baja. [14] Por lo tanto, las mediciones cuantitativas de un soluto generalmente se realizan utilizando una longitud de onda alrededor del pico de absorbancia, para minimizar las imprecisiones producidas por errores en la longitud de onda, debido al cambio del coeficiente de extinción con la longitud de onda.
La luz parásita [20] en un espectrofotómetro UV es cualquier luz que llega a su detector y que no es de la longitud de onda seleccionada por el monocromador. Esto puede deberse, por ejemplo, a la dispersión de la luz dentro del instrumento o a reflejos de superficies ópticas.
La luz parásita puede causar errores significativos en las mediciones de absorbancia, especialmente en absorbancias altas, porque la luz parásita se agregará a la señal detectada por el detector, aunque no sea parte de la longitud de onda realmente seleccionada. El resultado es que la absorbancia medida e informada será menor que la absorbancia real de la muestra.
La luz parásita es un factor importante, ya que determina la pureza de la luz utilizada para el análisis. El factor más importante que lo afecta es el nivel de luz parásita del monocromador . [14]
Normalmente, un detector utilizado en un espectrofotómetro UV-VIS es de banda ancha; responde a toda la luz que le llega. Si una cantidad significativa de luz que pasa a través de la muestra contiene longitudes de onda que tienen coeficientes de extinción mucho más bajos que el nominal, el instrumento informará una absorbancia incorrectamente baja. Cualquier instrumento llegará a un punto en el que un aumento en la concentración de la muestra no dará como resultado un aumento en la absorbancia informada, porque el detector simplemente responde a la luz parásita. En la práctica, la concentración de la muestra o la longitud del camino óptico deben ajustarse para colocar la absorbancia desconocida dentro de un rango que sea válido para el instrumento. A veces se desarrolla una función de calibración empírica, utilizando concentraciones conocidas de la muestra, para permitir mediciones en la región donde el instrumento se está volviendo no lineal.
Como guía aproximada, un instrumento con un solo monocromador normalmente tendría un nivel de luz parásita correspondiente a aproximadamente 3 unidades de absorbancia (AU), lo que haría que las mediciones por encima de aproximadamente 2 AU sean problemáticas. Un instrumento más complejo con un monocromador doble tendría un nivel de luz parásita correspondiente a unas 6 AU, lo que permitiría medir un rango de absorbancia mucho más amplio.
En concentraciones suficientemente altas, las bandas de absorción se saturarán y mostrarán un aplanamiento de la absorción. El pico de absorción parece aplanarse porque ya se está absorbiendo cerca del 100% de la luz. La concentración a la que esto ocurre depende del compuesto particular que se esté midiendo. Una prueba que se puede utilizar para comprobar este efecto es variar la longitud del recorrido de la medición. En la ley de Beer-Lambert, variar la concentración y la longitud del camino tiene un efecto equivalente: diluir una solución por un factor de 10 tiene el mismo efecto que acortar la longitud del camino por un factor de 10. Si hay celdas de diferentes longitudes de camino disponibles, las pruebas si esta relación es cierta es una forma de juzgar si se está produciendo un aplanamiento de la absorción.
Las soluciones que no son homogéneas pueden mostrar desviaciones de la ley de Beer-Lambert debido al fenómeno de aplanamiento de la absorción. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando la sustancia absorbente se encuentra dentro de partículas en suspensión. [21] [22] Las desviaciones serán más notables en condiciones de baja concentración y alta absorbancia. La última referencia describe una forma de corregir esta desviación.
Algunas soluciones, como el cloruro de cobre (II) en agua, cambian visualmente a una determinada concentración debido al cambio de condiciones alrededor del ion coloreado (el ion de cobre divalente). Para el cloruro de cobre (II), esto significa un cambio de azul a verde, [23] lo que significaría que las mediciones monocromáticas se desviarían de la ley de Beer-Lambert.
Los factores anteriores contribuyen a la incertidumbre de medición de los resultados obtenidos con la espectrofotometría UV/Vis . Si se utiliza la espectrofotometría UV/Vis en el análisis químico cuantitativo, los resultados se ven afectados además por fuentes de incertidumbre que surgen de la naturaleza de los compuestos y/o soluciones que se miden. Estos incluyen interferencias espectrales causadas por la superposición de bandas de absorción, decoloración del color de las especies absorbentes (causada por descomposición o reacción) y posible falta de coincidencia de composición entre la muestra y la solución de calibración. [24]
El instrumento utilizado en la espectroscopia ultravioleta-visible se llama espectrofotómetro UV/Vis . Mide la intensidad de la luz después de pasar a través de una muestra ( ) y la compara con la intensidad de la luz antes de pasar a través de la muestra ( ). La relación se llama transmitancia y generalmente se expresa como porcentaje (%T). La absorbancia , , se basa en la transmitancia:
El espectrofotómetro UV-visible también se puede configurar para medir la reflectancia. En este caso, el espectrofotómetro mide la intensidad de la luz reflejada por una muestra ( ) y la compara con la intensidad de la luz reflejada por un material de referencia ( ) (como un azulejo blanco). La relación se llama reflectancia y generalmente se expresa como porcentaje (%R).
Las partes básicas de un espectrofotómetro son una fuente de luz, un soporte para la muestra, una rejilla de difracción o un prisma a modo de monocromador para separar las diferentes longitudes de onda de la luz y un detector. La fuente de radiación suele ser un filamento de tungsteno (300 a 2500 nm), una lámpara de arco de deuterio , que es continua sobre la región ultravioleta (190 a 400 nm), una lámpara de arco de xenón , que es continua de 160 a 2000 nm; o más recientemente, diodos emisores de luz (LED) [4] para las longitudes de onda visibles. El detector suele ser un tubo fotomultiplicador , un fotodiodo , una matriz de fotodiodos o un dispositivo de carga acoplada (CCD). Los detectores de fotodiodo único y los tubos fotomultiplicadores se utilizan con monocromadores de escaneo, que filtran la luz de modo que solo la luz de una única longitud de onda llegue al detector a la vez. El monocromador de barrido mueve la rejilla de difracción para "pasar a través" de cada longitud de onda, de modo que su intensidad pueda medirse en función de la longitud de onda. Los monocromadores fijos se utilizan con CCD y conjuntos de fotodiodos. Como ambos dispositivos constan de muchos detectores agrupados en matrices de una o dos dimensiones, pueden recolectar luz de diferentes longitudes de onda en diferentes píxeles o grupos de píxeles simultáneamente.
Un espectrofotómetro puede ser de haz simple o de doble haz . En un instrumento de haz único (como el Spectronic 20 ), toda la luz pasa a través de la celda de muestra. debe medirse retirando la muestra. Este fue el diseño más antiguo y todavía se usa comúnmente tanto en laboratorios docentes como industriales.
En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra. Se utiliza un haz como referencia; el otro haz atraviesa la muestra. La intensidad del haz de referencia se toma como 100 % de transmisión (o 0 absorbancia) y la medida mostrada es la relación de las dos intensidades del haz. Algunos instrumentos de doble haz tienen dos detectores (fotodiodos) y la muestra y el haz de referencia se miden al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos haces pasan a través de un interruptor de haz , que bloquea un haz a la vez. El detector alterna entre medir el haz de muestra y el haz de referencia en sincronismo con el helicóptero. También puede haber uno o más intervalos oscuros en el ciclo de la picadora. En este caso, las intensidades de haz medidas se pueden corregir restando la intensidad medida en el intervalo de oscuridad antes de tomar la relación.
En un instrumento de haz único, primero se debe medir la cubeta que contiene sólo un disolvente. Mettler Toledo desarrolló un espectrofotómetro de haz único que permite realizar mediciones rápidas y precisas en el rango UV/VIS. La fuente de luz consiste en una lámpara de destellos de xenón para las regiones de longitud de onda ultravioleta (UV), así como visible (VIS) e infrarrojo cercano, que cubre un rango espectral de 190 a 1100 nm. Los destellos de la lámpara se enfocan en una fibra de vidrio que dirige el haz de luz hacia una cubeta que contiene la solución de muestra. El haz pasa a través de la muestra y los componentes de la muestra absorben longitudes de onda específicas. La luz restante se recoge después de la cubeta mediante una fibra de vidrio y se conduce a un espectrógrafo. El espectrógrafo consta de una rejilla de difracción que separa la luz en diferentes longitudes de onda y un sensor CCD para registrar los datos, respectivamente. De este modo se mide todo el espectro simultáneamente, lo que permite una grabación rápida. [25]
Las muestras para espectrofotometría UV/Vis suelen ser líquidas, aunque también se puede medir la absorbancia de gases e incluso de sólidos. Las muestras normalmente se colocan en una celda transparente , conocida como cubeta . Las cubetas suelen tener forma rectangular, normalmente con un ancho interno de 1 cm. (Este ancho se convierte en la longitud del camino, , en la ley de Beer-Lambert). Los tubos de ensayo también se pueden usar como cubetas en algunos instrumentos. El tipo de recipiente de muestra utilizado debe permitir que la radiación pase sobre la región espectral de interés. Las cubetas más utilizadas están hechas de sílice fundida o vidrio de cuarzo de alta calidad porque son transparentes en las regiones ultravioleta, visible e infrarroja cercana. Las cubetas de vidrio y plástico también son comunes, aunque el vidrio y la mayoría de los plásticos absorben los rayos UV, lo que limita su utilidad a las longitudes de onda visibles. [4]
También se han fabricado instrumentos especializados. Estos incluyen conectar espectrofotómetros a telescopios para medir los espectros de características astronómicas. Los microespectrofotómetros UV-visible consisten en un microscopio UV-visible integrado con un espectrofotómetro UV-visible.
A menudo, un espectrofotómetro más sofisticado puede producir directamente un espectro completo de absorción en todas las longitudes de onda de interés. En instrumentos más simples, la absorción se determina una longitud de onda a la vez y luego el operador la compila en un espectro. Eliminando la dependencia de la concentración, se puede determinar el coeficiente de extinción (ε) en función de la longitud de onda.
La espectroscopia UV-visible de muestras microscópicas se realiza integrando un microscopio óptico con óptica UV-visible, fuentes de luz blanca, un monocromador y un detector sensible como un dispositivo de carga acoplada (CCD) o un tubo fotomultiplicador (PMT). Como sólo está disponible un camino óptico, se trata de instrumentos de haz único. Los instrumentos modernos son capaces de medir espectros UV-visibles tanto en reflectancia como en transmisión de áreas de muestreo a escala micrométrica. Las ventajas de utilizar estos instrumentos es que pueden medir muestras microscópicas pero también pueden medir los espectros de muestras más grandes con alta resolución espacial. Como tales, se utilizan en el laboratorio forense para analizar colorantes y pigmentos en fibras textiles individuales, [26] virutas de pintura microscópicas [27] y el color de fragmentos de vidrio. También se utilizan en ciencia de materiales e investigación biológica y para determinar el contenido energético de la roca madre de carbón y petróleo midiendo la reflectancia de vitrinita . Los microespectrofotómetros se utilizan en las industrias de semiconductores y microóptica para controlar el espesor de películas delgadas una vez depositadas. En la industria de los semiconductores, se utilizan porque las dimensiones críticas de los circuitos son microscópicas. Una prueba típica de una oblea semiconductora implicaría la adquisición de espectros de muchos puntos en una oblea con o sin patrón. El espesor de las películas depositadas puede calcularse a partir del patrón de interferencia de los espectros. Además, se puede utilizar espectrofotometría ultravioleta-visible para determinar el espesor, junto con el índice de refracción y el coeficiente de extinción de películas delgadas. [16] Luego se puede generar y utilizar un mapa del espesor de la película en toda la oblea para fines de control de calidad. [28]
UV/Vis se puede aplicar para caracterizar la velocidad de una reacción química . Es ilustrativa la conversión de los isómeros amarillo-naranja y azul del ditizonato de mercurio. Este método de análisis se basa en el hecho de que la concentración es linealmente proporcional a la concentración. De la misma manera se permite la determinación de equilibrios entre cromóforos. [29] [30]
A partir del espectro de gases en combustión, es posible determinar la composición química de un combustible, la temperatura de los gases y la relación aire-combustible. [31]
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