La desintegración del ARNm mediada por sinsentidos ( NMD ) es una vía de vigilancia que existe en todos los eucariotas . Su función principal es reducir los errores en la expresión génica eliminando las transcripciones del ARNm que contienen codones de terminación prematuros . [1] La traducción de estos ARNm aberrantes podría, en algunos casos, conducir a una ganancia de función perjudicial o a una actividad dominante negativa de las proteínas resultantes. [2]
La NMD se describió por primera vez en células humanas y en levaduras casi simultáneamente en 1979. Esto sugirió una amplia conservación filogenética y un papel biológico importante de este intrigante mecanismo. [3] La NMD se descubrió cuando se advirtió que las células a menudo contienen concentraciones inesperadamente bajas de ARNm que se transcriben a partir de alelos que llevan mutaciones sin sentido . [4] Las mutaciones sin sentido codifican un codón de terminación prematuro que hace que la proteína se acorte. La proteína truncada puede ser funcional o no, dependiendo de la gravedad de lo que no se traduce. En genética humana, la NMD tiene la posibilidad no solo de limitar la traducción de proteínas anormales, sino que ocasionalmente puede causar efectos perjudiciales en mutaciones genéticas específicas. [5]
La NMD funciona para regular numerosas funciones biológicas en una amplia gama de células, incluida la plasticidad sináptica de las neuronas que puede dar forma al comportamiento adulto. [6]
Si bien muchas de las proteínas involucradas en la NMD no se conservan entre especies, en Saccharomyces cerevisiae (levadura), hay tres factores principales en la NMD: UPF1 , UPF2 y UPF3 ( UPF3A y UPF3B en humanos), que conforman el núcleo conservado de la vía de la NMD. [7] Los tres factores son elementos que actúan en trans, llamados proteínas de desplazamiento del marco de lectura hacia arriba (UPF). En los mamíferos, UPF2 y UPF3 son parte del complejo de unión exón-exón (EJC) unido al ARNm después del empalme junto con otras proteínas, eIF4AIII, MLN51 y el heterodímero Y14/MAGOH, que también funcionan en la NMD. La fosforilación de UPF1 está controlada por las proteínas SMG-1, SMG-5, SMG-6 y SMG-7.
El proceso de detección de transcripciones aberrantes ocurre durante la traducción del ARNm. Un modelo popular para la detección de transcripciones aberrantes en mamíferos sugiere que durante la primera ronda de traducción, el ribosoma elimina los complejos de unión exón-exón unidos al ARNm después de que se produce el empalme. Si después de esta primera ronda de traducción, alguna de estas proteínas permanece unida al ARNm, se activa la NMD. Los complejos de unión exón-exón ubicados aguas abajo de un codón de terminación no se eliminan de la transcripción porque el ribosoma se libera antes de alcanzarlos. La terminación de la traducción conduce al ensamblaje de un complejo compuesto por UPF1, SMG1 y los factores de liberación, eRF1 y eRF3, en el ARNm. Si se deja un EJC en el ARNm porque la transcripción contiene un codón de terminación prematuro, entonces UPF1 entra en contacto con UPF2 y UPF3, lo que desencadena la fosforilación de UPF1. En los vertebrados, la ubicación del último complejo de unión de exones en relación con el codón de terminación generalmente determina si la transcripción se someterá a NMD o no. Si el codón de terminación está aguas abajo o dentro de aproximadamente 50 nucleótidos del complejo de unión de exones final, entonces la transcripción se traduce normalmente. Sin embargo, si el codón de terminación está más allá de aproximadamente 50 nucleótidos aguas arriba de cualquier complejo de unión de exones, entonces la transcripción es regulada negativamente por NMD. [8] El UPF1 fosforilado luego interactúa con SMG-5, SMG-6 y SMG-7, que promueven la desfosforilación de UPF1. Se cree que SMG-7 es el efector de terminación en NMD, ya que se acumula en P-bodies , que son sitios citoplasmáticos para la descomposición del ARNm. Tanto en levaduras como en células humanas, la principal vía para la descomposición del ARNm se inicia con la eliminación de la tapa 5' seguida de la degradación por XRN1, una enzima exorribonucleasa. La otra vía por la cual se degrada el ARNm es por desadenilación de 3' a 5'.
Además del papel bien reconocido de la NMD en la eliminación de transcripciones aberrantes, existen transcripciones que contienen intrones dentro de sus regiones no traducidas 3' (UTR). [9] Se predice que estos mensajes son objetivos de la NMD, pero ellos (por ejemplo, la proteína asociada al citoesqueleto regulada por la actividad, conocida como Arc) pueden desempeñar funciones biológicas cruciales, lo que sugiere que la NMD puede tener roles fisiológicamente relevantes. [9]
La NMD es un mecanismo celular que degrada los ARNm que contienen codones de terminación prematura (PTC), que pueden surgir de mutaciones. Los análisis exhaustivos de conjuntos de datos genéticos y de expresión génica a gran escala han permitido la identificación sistemática de las complejas reglas que rigen la eficiencia de la NMD y la cuantificación de su importancia relativa y el tamaño del efecto. [10] Esto reveló que la eficiencia de la NMD para reconocer y degradar estas transcripciones defectuosas está influenciada por varias características moleculares:
Aunque la degradación del ARNm mediada por codones sin sentido reduce los codones sin sentido, pueden producirse mutaciones que provoquen diversos problemas de salud y enfermedades en los seres humanos. Puede producirse una mutación dominante negativa o perjudicial con ganancia de función si se traducen codones de terminación prematura (sin sentido). La NMD se está haciendo cada vez más evidente en la forma en que modifica las consecuencias fenotípicas debido a la amplia forma en que controla la expresión génica. Por ejemplo, el trastorno sanguíneo beta talasemia se hereda y es causado por mutaciones dentro de la región ascendente del gen de la β-globina. [11] Un individuo que porta solo un alelo afectado no tendrá niveles o tendrá niveles extremadamente bajos del ARNm de la β-globina mutante. Puede producirse una forma aún más grave de la enfermedad llamada talasemia intermedia o talasemia de "cuerpos de inclusión". En lugar de niveles reducidos de ARNm, una transcripción mutante produce cadenas β truncadas, lo que a su vez conduce a un fenotipo clínico en el heterocigoto. [11] Las mutaciones de desintegración mediadas por sinsentido también pueden contribuir al síndrome de Marfan . Este trastorno es causado por mutaciones en el gen de la fibrilina 1 (FBN1) y es el resultado de una interacción negativa dominante entre el gen de la fibrilina-1 mutante y el de tipo salvaje. [11]
La NMD desempeña un papel en la regulación de antígenos inmunogénicos derivados del cambio de marco de lectura. Las mutaciones por cambio de marco de lectura a menudo resultan en la producción de proteínas aberrantes que pueden ser reconocidas como neoantígenos por el sistema inmunológico, particularmente en células cancerosas. [12] Sin embargo, las mutaciones por cambio de marco de lectura a menudo conducen a la traducción de un PTC fuera de marco de lectura que puede activar la NMD para degradar estos ARNm mutantes antes de que se traduzcan en proteínas, reduciendo así la presentación de estos péptidos potencialmente inmunogénicos en la superficie celular a través de moléculas de HLA de clase I. Esta modulación de la inmunogenicidad significa que los neoantígenos derivados del cambio de marco de lectura solo contribuyen a la respuesta a la inhibición del punto de control inmunológico si surgen de mutaciones en partes del genoma que no son reconocidas por la NMD. [13]
Esta vía tiene un efecto significativo en la forma en que se traducen los genes, restringiendo la cantidad de expresión génica. Todavía es un campo nuevo en genética, pero su papel en la investigación ya ha llevado a los científicos a descubrir numerosas explicaciones para la regulación génica. El estudio de la descomposición mediada por genes sin sentido ha permitido a los científicos determinar las causas de ciertas enfermedades hereditarias y la compensación de dosis en mamíferos.
El gen de la proopiomelanocortina (POMC) se expresa en el hipotálamo, en la glándula pituitaria. Produce una variedad de péptidos y hormonas biológicamente activos y sufre un procesamiento postraduccional específico del tejido para producir una variedad de péptidos biológicamente activos que producen hormona adrenocorticotrópica (ACTH), b-endorfina y hormonas estimulantes de los melanocitos a, b y c (MSH). [ cita requerida ] Estos péptidos luego interactúan con diferentes receptores de melanocortina (MCR) y están involucrados en una amplia gama de procesos que incluyen la regulación del peso corporal (MC3R y MC4R), la esteroidogénesis suprarrenal (MC2R) y la pigmentación del cabello (MC1R). [14] Publicado en la Asociación Británica de Dermatólogos en 2012, La falta de fenotipo de cabello rojo en un niño obeso del norte de África homocigoto para una nueva mutación nula de POMC mostró una evaluación del ARN de descomposición mediada por sinsentido en un análisis químico del pigmento del cabello. Descubrieron que la inactivación de la mutación del gen POMC produce obesidad, insuficiencia suprarrenal y pelo rojo. Esto se ha observado tanto en humanos como en ratones. En este experimento describieron a un niño de 3 años de Roma, Italia. Era una fuente de atención porque tenía la enfermedad de Addison y obesidad de aparición temprana. Recolectaron su ADN y lo amplificaron usando PCR. El análisis de secuenciación reveló una única sustitución homocigótica que determina un codón de terminación. Esto causó una proteína aberrante y la secuencia de aminoácidos correspondiente indicó la posición exacta del nucleótido homocigótico. La sustitución se localizó en el exón 3 y la mutación sin sentido en el codón 68. Los resultados de este experimento sugieren firmemente que la ausencia de pelo rojo en pacientes no europeos con obesidad de aparición temprana y deficiencia hormonal no excluye la aparición de mutaciones POMC. [14] Al secuenciar el ADN de los pacientes, descubrieron que esta nueva mutación tiene una colección de síntomas debido a una vía de vigilancia de la descomposición del ARNm mediada por sin sentido que funciona mal.
Se ha demostrado que la vía de desintegración del ARNm mediada por sinsentidos participa en la compensación de la dosis del cromosoma X en mamíferos. En eucariotas superiores con cromosomas sexuales dimórficos, como los humanos y las moscas de la fruta, los machos tienen un cromosoma X , mientras que las hembras tienen dos. Estos organismos han desarrollado un mecanismo que compensa no solo la diferente cantidad de cromosomas sexuales entre los dos sexos, sino también las diferentes proporciones X/autosoma. [15] En este estudio de todo el genoma, los científicos descubrieron que los genes autosómicos tienen más probabilidades de sufrir una desintegración mediada por sinsentidos que los genes ligados al cromosoma X. Esto se debe a que la NMD afina los cromosomas X y se demostró inhibiendo la vía. Los resultados fueron que la expresión génica equilibrada entre la expresión génica de X y autosómica se redujo en un 10-15% sin importar el método de inhibición. La vía NMD está sesgada hacia la depresión de la expresión de poblaciones más grandes o genes autosómicos que los ligados al cromosoma X. En conclusión, los datos respaldan la opinión de que el acoplamiento del empalme alternativo y la NMD es un medio generalizado de regulación de la expresión genética. [15]
Las implicaciones de la NMD son significativas al diseñar experimentos CRISPR-Cas9, particularmente aquellos dirigidos a la inactivación de genes. [16] CRISPR-Cas9 introduce roturas de doble cadena que pueden conducir a inserciones o deleciones (indels), que a menudo resultan en mutaciones de cambio de marco y PTC. Si estos PTC están ubicados en regiones que desencadenan la NMD, los ARNm resultantes se degradarán rápidamente, lo que llevará a una inactivación génica efectiva. Sin embargo, si los PTC están en regiones que evaden la NMD, los ARNm mutantes pueden traducirse en proteínas truncadas, lo que potencialmente conserva la función parcial y conduce a una inactivación génica incompleta. [13] [17] Por lo tanto, comprender e incorporar las reglas de la NMD en el diseño de ARN guía simples (sgRNA) es esencial para lograr los resultados deseados en los experimentos CRISPR-Cas9. Herramientas como NMDetective [13] pueden predecir la probabilidad de activación de NMD en función de la ubicación de los PTC, lo que ayuda al diseño de estrategias de edición genética más efectivas.