La cromatografía de capa fina de alto rendimiento ( HPTLC ) funciona como una extensión de la cromatografía de capa fina (TLC), ofreciendo robustez, simplicidad, velocidad y eficiencia en el análisis cuantitativo de compuestos. [1] Esta técnica analítica basada en TLC mejora la resolución de los compuestos para el análisis cuantitativo. Algunas de estas mejoras implican el empleo de placas de TLC de mayor calidad con tamaños de partículas más finos en la fase estacionaria, lo que conduce a una mejor resolución. [2] Además, la separación se puede refinar aún más mediante el desarrollo repetido de placas utilizando un dispositivo de desarrollo múltiple. Como resultado, la HPTLC proporciona una resolución superior y un límite de detección (LOD) más bajo. [3]
Ventajas de HPTLC: [1]
La HPTLC comprende tres modos: modo lineal, modo circular y modo anticircular. Entre estos modos, el modo anticircular se destaca como el más rápido en teoría y en la práctica dentro del ámbito de la HPTLC. Este modo logra la separación al permitir que la fase móvil ingrese a la capa de la placa con precisión a lo largo de una trayectoria circular externa, después de lo cual fluye hacia el centro a una velocidad casi constante. Este enfoque maximiza la capacidad de muestra mientras minimiza el consumo de tiempo, capa y fase móvil, lo que lo convierte en la técnica HPTLC más rentable. La trayectoria de puntos estrechos exclusiva de la HPTLC anticircular facilita la cuantificación automatizada. En comparación con los modos lineal y circular, el modo anticircular demuestra una separación superior y una sensibilidad significativamente mayor, especialmente con valores de Rf más altos. [2]
Para iniciar la HPTLC, se debe determinar una fase estacionaria para separar los diferentes compuestos dentro de una mezcla. Alrededor del 90% de todas las separaciones farmacéuticas se realizan en gel de sílice de fase normal; sin embargo, se pueden utilizar otras fases estacionarias como la alúmina para muestras con compuestos disociantes y la celulosa para compuestos iónicos. [4] El método HPTLC de fase inversa (metodología similar a la TLC de fase inversa) se utiliza para compuestos con alta polaridad. Después de la selección de la fase estacionaria, las placas generalmente se lavan con metanol y se secan en un horno para eliminar el exceso de disolvente. [5]
La selección de la fase móvil es uno de los procesos más importantes de la HPTLC y sigue un proceso de "prueba y error". Sin embargo, el sistema " PRISMA " se mantiene como una guía para encontrar la fase móvil óptima. [1] La fase móvil depende de la capacidad de absorción de la fase estacionaria y de la composición del compuesto de interés. [5] El compuesto se prueba primero con soluciones como éter dietílico , etanol , diclorometano , cloroformo para la HPTLC en fase normal, o soluciones como metanol , acetonitrilo y tetrahidrofurano para la HPTLC en fase inversa. A continuación, se analizan los factores de retardo ( R f) de los compuestos con el disolvente seleccionado y se elige el disolvente que da el R f más alto para que sea la fase móvil del compuesto. A continuación, se prueba la fuerza del disolvente móvil frente al hexano (para la HPTLC normal) y el agua (para la HPTLC en fase inversa) para determinar la necesidad de ajuste. [5] [6]
Los dispositivos HPTLC notables, como el Linomat 5 y el Automatic TLC Sampler 4 (ATS 4) de CAMAG, funcionan de manera muy similar al tener la técnica de aplicación de muestra automatizada por "pulverización". [4] [5] Esta técnica automatizada de "pulverización" es útil para superar la incertidumbre en el tamaño y la posición de las gotas cuando la muestra se aplica a la placa de TLC a mano. Además, la automatización proporciona alta resolución y bandas estrechas ya que el solvente se evapora inmediatamente cuando la muestra hace contacto con la placa. [4] Un enfoque de la automatización ha sido el uso de dispositivos piezoeléctricos e impresoras de inyección de tinta para aplicar la muestra. [7] Alternativamente, el Nanomat 4 y el ATS 4 de CAMAG se operan manualmente donde la muestra se aplica mediante una aplicación puntual utilizando una pipeta capilar. [4] [5]
Tras la detección cromatográfica, las placas HPTLC suelen revelarse en cámaras de doble canal saturadas con papel de filtro para obtener resultados óptimos. [5] [6] Sin embargo, también se utilizan cámaras de fondo plano y cámaras de desarrollo horizontales para compuestos específicos. Un mecanismo general para el dispositivo HPTLC es el siguiente. [5] Se coloca un papel de filtro ajustado en el canal trasero de la cámara y la fase móvil se vierte a través del canal trasero para asegurar la absorción completa del disolvente del papel de filtro. A continuación, la cámara se inclina a ~45° para que ambos canales tengan el mismo volumen de disolvente y se deja reposar para que se equilibre durante ~20 minutos. [5] Finalmente, la placa HPTLC se coloca en la cámara para revelar. Entre cada lectura de muestra, se cambian la fase móvil y el papel de filtro para garantizar los mejores resultados.
La capacidad de puntos (análoga a la capacidad de pico en HPLC ) se puede aumentar revelando la placa con dos solventes diferentes, utilizando cromatografía bidimensional . [8] El procedimiento comienza con el desarrollo de una placa cargada con muestra con el primer solvente. Después de retirarla, la placa se gira 90° y se revela con un segundo solvente.
La cromatografía HPTLC se utiliza ampliamente en diversos campos, como la industria farmacéutica, la química clínica, la química forense, la bioquímica, la cosmetología, el análisis de alimentos y fármacos, el análisis medioambiental y más, gracias a sus numerosas ventajas. Se distingue por ser el único método cromatográfico capaz de presentar resultados en forma de imágenes y ofrece simplicidad, rentabilidad, análisis paralelo de muestras, gran capacidad de muestreo, resultados rápidos y la opción de utilizar múltiples métodos de detección.
El equipo de investigación de Le Roux evaluó la HPTLC para determinar los niveles séricos de salbutamol en ensayos clínicos y concluyó que es un método adecuado para analizar muestras de suero. [3]
La HPTLC también se ha utilizado con éxito en la separación de varias subclases de lípidos, con resultados reproducibles y prometedores obtenidos para 20 subclases de lípidos diferentes. Se han publicado numerosos informes relacionados con estudios de medicina clínica en varias revistas. Como resultado, la HPTLC ahora se recomienda encarecidamente para el análisis de fármacos en suero y otros tejidos. [7]