Un kodecito (ko•de•cyte) es una célula viva que ha sido modificada (codificada) mediante la incorporación de una o más construcciones función-espaciador-lípidos (construcciones FSL) [1] [2] [3] para obtener una nueva o nueva función biológica, química o tecnológica. La célula es modificada por la cola lipídica de la construcción FSL que se incorpora a la membrana bilípida de la célula.
Todos los kodecitos conservan su vitalidad y funcionalidad normales mientras obtienen la nueva función de las construcciones FSL insertadas. La combinación de dispersabilidad en medios biocompatibles , incorporación espontánea en las membranas celulares y aparente baja toxicidad hace que las construcciones de FSL sean adecuadas como herramientas de investigación y para el desarrollo de nuevas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas .
La tecnología
Analogía estructural de un girasol con modelos de llenado de espacios de construcciones FSL seleccionadas. Las dos construcciones de FSL de la izquierda son péptidos de FSL basados en espaciadores de oligoglicina parcialmente carboximetilada (CMG2) con lípidos de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE). Las construcciones tercera y cuarta son FSL- biotina basada en CMG pero con lípidos DOPE y esterol (derivado del ácido δ-oxicarbonilaminovalérico del colesterol ), respectivamente. La construcción FSL final es un trisacárido típico, conjugado mediante un espaciador O(CH2 ) 3NH a un derivado adipato activado del diacillípido DOPE.
Las construcciones de Kode FSL constan de tres componentes; [3] [4] un resto funcional (F), un espaciador (S) y un lípido (L).
Aunque los kodecitos se crean modificando células naturales, son diferentes de las células naturales. Por ejemplo, las construcciones FSL, influenciadas por la composición de la cola lipídica, son móviles lateralmente en la membrana y algunas construcciones FSL también pueden agruparse debido a las características del grupo funcional (F). [1] Como las construcciones FSL están ancladas en la membrana a través de una cola lipídica (L), se cree que no participan en la transducción de señales , pero pueden diseñarse para actuar como agonistas o antagonistas del evento de unión inicial. Las construcciones de FSL no atravesarán activamente la membrana plasmática, pero pueden ingresar a la célula mediante invaginación de la membrana y endocitosis. [7]
La "codificación" de las células es estable (sujeta a la tasa de renovación de los componentes de la membrana). Las construcciones de FSL permanecerán en la membrana de las células inactivas (por ejemplo, glóbulos rojos) durante toda la vida de la célula, siempre que se almacenen en medios libres de lípidos. [7] En la circulación periférica se observa que las construcciones FSL se pierden de los codecitos de glóbulos rojos a una velocidad de aproximadamente el 1% por hora. [9] [19] La dosis inicial de "koding" y el nivel mínimo requerido para la detección determinan durante cuánto tiempo se puede controlar la presencia de "kodecytes" en la circulación. Para los "kodecitos" de sangre roja, se ha demostrado en pequeños mamíferos una monitorización fiable de la presencia de los "kodecitos" durante hasta 3 días después de la administración intravenosa. [9]
El espaciador (S) de una construcción FSL se ha seleccionado de modo que tenga una reactividad cruzada insignificante con los anticuerpos séricos, de modo que se puedan utilizar kodecitos con suero sin diluir. Al aumentar la longitud del espaciador FSL de 1,9 a 7,2 nm, se ha demostrado que la sensibilidad puede mejorarse al doble en ensayos de kodecitos basados en aglutinación de glóbulos rojos. Sin embargo, aumentar aún más el tamaño del espaciador de 7,2 a 11,5 nm no dio como resultado ninguna mejora adicional. [1]
Una membrana plasmática modificada con construcciones FSL (por analogía con el girasol), creando una membrana de kodecitos.
Vídeo de tecnología
Para ver un vídeo sencillo que explica cómo funciona la tecnología Kode, haga clic en el siguiente enlace: https://www.youtube.com/watch?v=TIbjAl5KYpA
Metodología
Preparación de kodecitos. Simplemente mezcle las células con una solución de FSL (que contenga 1 o más FSL) e incube durante 10 a 120 minutos a 37 °C (o a temperaturas tan bajas como 4 °C). Las construcciones se incorporarán espontáneamente a la membrana y no se requieren pasos adicionales.
Las construcciones de FSL, cuando están en solución ( solución salina ) y en contacto, se incorporarán espontáneamente a las membranas celulares. [20] La metodología implica simplemente preparar una solución de construcciones FSL en el rango de 1 a 1000 μg / mL , y la concentración utilizada determina la cantidad de antígeno presente en el kodecito. La capacidad de controlar los niveles de antígeno en el exterior de un kodecito ha permitido la fabricación de sistemas de sensibilidad de control de calidad [2] y kits de enseñanza serológica que incorporan toda la gama de reacciones de aglutinación serológica. [21] La concentración real dependerá de la construcción y de la cantidad de construcción requerida en la membrana. Se agrega una parte de la solución FSL a una parte de las células (hasta 100 % de suspensión ) y se incuban a una temperatura establecida dentro del rango de 4 a 37 °C (39 a 99 °F), dependiendo de la compatibilidad de temperatura de las células. siendo modificado. Cuanto mayor sea la temperatura, más rápida será la velocidad de inserción de FSL en la membrana. Para los glóbulos rojos, la incubación durante 2 horas a 37 °C logra una inserción de FSL >95 % y se logra al menos un 50 % de inserción en 20 minutos. En general, para la inserción de FSL basadas en carbohidratos en glóbulos rojos, la incubación durante 4 horas a temperatura ambiente o 20 horas a 4 °C es similar a una hora a 37 °C. [20] No es necesario lavar los kodecitos resultantes; sin embargo, esta opción debe considerarse si se utiliza un exceso de construcción FSL en el "proceso de codificación".
Los kodecitos también se pueden crear in vivo mediante inyección de construcciones directamente en la circulación. [19] Sin embargo, este proceso modificará todas las células en contacto con las construcciones y generalmente requerirá significativamente más construcciones que la preparación in vitro , ya que las construcciones FSL se asociarán preferentemente con lípidos libres. [19]
La creación in vivo de kodecitos no está dirigida y las construcciones FSL se insertarán en todas las células de forma no específica, pero pueden mostrar preferencia por algunos tipos de células.
Los análisis serológicos de diagnóstico [4] , incluida la citometría de flujo [5] y la microscopía electrónica de barrido, generalmente no pueden detectar una diferencia entre los "kodecitos" y las células no modificadas. Sin embargo, en comparación con las células naturales, parece haber una diferencia entre las reactividades de los anticuerpos IgM e IgG cuando el grupo funcional (F) es un antígeno peptídico monomérico. Los anticuerpos IgM parecen reaccionar mal con los kodecitos elaborados con péptidos FSL. [10] [17] Además, las construcciones FSL pueden tener un antígeno/epítopo restringido y pueden no reaccionar con un anticuerpo monoclonal a menos que la construcción FSL y el anticuerpo monoclonal sean complementarios. [10] [17]
Los kodecitos se pueden estudiar utilizando técnicas histológicas estándar. Los kodecitos se pueden fijar después de la "codificación" sujeto a que el resto funcional (F) de la construcción FSL sea compatible con el fijador. Sin embargo, se requieren tejidos liofilizados o liofilizados fijados con formalina porque las construcciones FSL basadas en lípidos (y otros glicolípidos) se lixiviarán de los "kodecitos" en muestras embebidas en parafina durante las etapas de desparafinación. [20]
Nomenclatura
Las membranas codificadas se describen por la construcción y la concentración de FSL (en μg / mL ) utilizada para crearlas. [20] Por ejemplo, los kodecitos creados con una solución de 100 μg/ml de FSL-A se denominarían kodecitos A100. Si se utilizaron múltiples construcciones de FSL, entonces la definición se amplía en consecuencia, por ejemplo, los kodecitos A100+B300 se crean con una solución que contiene una solución de 100 μg/mL de FSL-A y una solución de 300 μg/mL de FSL-B. El símbolo "+" se utiliza para separar las mezclas de construcciones, por ejemplo, A100+B300. Si las concentraciones de FSL son constantes, entonces se puede eliminar el componente μg/mL de la terminología, por ejemplo, A kodecytes. Alternativamente, construcciones no relacionadas, como FSL-A y FSL-biotina, crearán codecitos de biotina A+, etc. Si se utilizan diferentes células en el mismo estudio, se recomienda incluir el tipo de célula en el nombre, por ejemplo, kodecitos RBC A100 frente a kodecitos WBC A100. , o kodecitos de plaquetas A100, etc.
Aplicaciones
La tecnología Kode se ha utilizado para la modificación in vitro de embriones murinos , espermatozoides , peces cebra , células epiteliales / endometriales y glóbulos rojos [3] [4] [5] [8] [11] [12] [22] para crear sistemas de control de calidad celular, [2] [3] [10] kits serológicos (enseñanza), [21] [23] expresión de antígenos raros , agregar marcadores infecciosos a las células, [3] [13] [18] adhesión/interacción celular modificada /separación/inmovilización, [3] [7] [9] y etiquetado. [5] [8] También se ha infundido por vía intravascular para la modificación in vivo de las células sanguíneas y la neutralización de anticuerpos circulantes [3] [19] [24] y para obtener imágenes in vivo de los kodecitos circulantes de la médula ósea en el pez cebra. [25] Las construcciones Kode FSL también se han aplicado a superficies no biológicas como celulosa modificada, papel, [22] sílice, polímeros, fibras naturales, vidrio y metales y se ha demostrado que son ultrarrápidos en el etiquetado de estas superficies. [3] [26]
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