La inmunohistoquímica (IHC) es una forma de inmunotinción . Implica el proceso de identificación selectiva de antígenos (proteínas) en células y tejidos, aprovechando el principio de que los anticuerpos se unen específicamente a antígenos en tejidos biológicos . Albert Hewett Coons , Ernest Berliner , Norman Jones y Hugh J. Creech fueron los primeros en desarrollar la inmunofluorescencia en 1941. Esto condujo al desarrollo posterior de la inmunohistoquímica. [1] [2]
La tinción inmunohistoquímica se usa ampliamente en el diagnóstico de células anormales como las que se encuentran en los tumores cancerosos . En algunas células cancerosas se expresan determinados antígenos tumorales que permiten detectarlos. La inmunohistoquímica también se utiliza ampliamente en la investigación básica, para comprender la distribución y localización de biomarcadores y proteínas expresadas diferencialmente en diferentes partes de un tejido biológico. [3]
La IHC se puede realizar en tejido fijado e incluido en parafina , pero también en tejido criopreservado (congelado). Según la forma en que se conserva el tejido, existen diferentes pasos para preparar el tejido para la IHC, pero el método general incluye una fijación adecuada, recuperación del antígeno, incubación con anticuerpo primario y luego incubación con anticuerpo secundario. [4] [5]
La fijación del tejido es importante para preservar el tejido y mantener la morfología celular. La fórmula de fijación, la proporción de fijador con respecto al tejido y el tiempo en el fijador afectarán el resultado. La solución de fijación (fijador) suele ser formalina tampón neutra (NBF) al 10%. El tiempo normal de fijación es de 24 horas a temperatura ambiente. La proporción de fijador a tejido varía de 1:1 a 1:20. Una vez fijado el tejido, se puede incrustar en cera de parafina. [4] [5]
Para las secciones congeladas, la fijación generalmente se realiza después de la sección si no se van a probar nuevos anticuerpos. Luego se puede utilizar acetona o NBF. [5]
La sección de la muestra de tejido se realiza mediante un microtomo. Para el tejido incluido en parafina, el espesor normal es de 4 μm y para las secciones congeladas, de 4 a 6 μm. [5] El grosor de las secciones cortadas es importante y es un factor importante en la IHC. Si comparas una sección de tejido cerebral que mide 4 μm con una sección que mide 7 μm, es posible que algo de lo que ves en la sección de 7 μm de espesor falte en la sección de 4 μm. Esto muestra la importancia de métodos detallados relacionados con esta metodología. [6] Los tejidos incluidos en parafina deben desparafinarse para eliminar toda la parafina sobre y alrededor de la muestra de tejido en xileno o un buen sustituto, seguido de alcohol. [7]
A veces es necesaria la recuperación de antígenos para que los epítopos del tejido sean accesibles. Los epítopos son los sitios de unión de los anticuerpos que se utilizan para visualizar el objetivo y pueden quedar enmascarados debido a la fijación. La fijación del tejido puede provocar la formación de puentes de metileno o la reticulación de grupos amino, de modo que los epítopos ya no estén disponibles. La forma más común de realizar la recuperación de antígenos es con la recuperación de epitopos inducida por calor (HIER). Esto se puede hacer de diferentes maneras, por ejemplo usando horno microondas, autoclaves, placas calefactoras o baños de agua. Para las secciones congeladas, la recuperación del antígeno generalmente no es necesaria, pero para la sección congelada que se ha fijado en acetona o NBF, la recuperación del antígeno puede mejorar la señal de IHC. [5]
La unión no específica de anticuerpos puede provocar una tinción de fondo. Aunque los anticuerpos se unen a epítopos específicos, también pueden unirse parcial o débilmente a sitios de proteínas no específicas que son similares al sitio de unión de la proteína diana. Al incubar el tejido con suero normal aislado de la especie en la que se produjo el anticuerpo secundario, se puede reducir la tinción de fondo. También es posible utilizar tampones de bloqueo universales disponibles comercialmente. Otros tampones de bloqueo comunes incluyen suero normal, leche en polvo descremada, BSA o gelatina. [4] [5] La actividad enzimática endógena también puede causar tinción de fondo, pero puede reducirse si el tejido se trata con peróxido de hidrógeno. [4]
Después de preparar la muestra, el objetivo se puede visualizar utilizando anticuerpos marcados con compuestos fluorescentes, metales o enzimas. Existen métodos directos e indirectos para etiquetar la muestra. [5] [8]
Los anticuerpos utilizados para la detección pueden ser policlonales o monoclonales. Los anticuerpos policlonales se elaboran utilizando animales como cobayas, conejos, ratones, ratas o cabras. Al animal se le inyecta el antígeno de interés y se desencadena una respuesta inmune. Los anticuerpos pueden aislarse del suero completo del animal. La producción de anticuerpos policlonales dará como resultado una mezcla de diferentes anticuerpos y reconocerá múltiples epítopos. Los anticuerpos monoclonales se elaboran inyectando al animal el antígeno de interés y luego aislando una célula B productora de anticuerpos, generalmente del bazo. Luego, la célula productora de anticuerpos se fusiona con una línea celular cancerosa. Esto hace que los anticuerpos muestren especificidad por un solo epítopo. [9]
Para las estrategias de detección inmunohistoquímica, los anticuerpos se clasifican como reactivos primarios o secundarios. Los anticuerpos primarios se generan contra un antígeno de interés y normalmente no están conjugados (sin marcar). Los anticuerpos secundarios se generan contra inmunoglobulinas de las especies de anticuerpos primarios. El anticuerpo secundario generalmente se conjuga con una molécula conectora, como la biotina, que luego recluta moléculas informadoras, o el anticuerpo secundario en sí se une directamente a la molécula informadora. [8]
El método directo es un método de tinción de un solo paso e implica que un anticuerpo marcado reaccione directamente con el antígeno en secciones de tejido. Si bien esta técnica utiliza solo un anticuerpo y, por lo tanto, es simple y rápida, la sensibilidad es menor debido a la poca amplificación de la señal, en contraste con los enfoques indirectos. [8]
El método indirecto implica un anticuerpo primario no marcado que se une al antígeno diana en el tejido. Luego se añade como segunda capa un anticuerpo secundario, que se une al anticuerpo primario. Como se mencionó, el anticuerpo secundario debe generarse contra el anticuerpo IgG de la especie animal en la que se generó el anticuerpo primario. Este método es más sensible que las estrategias de detección directa debido a la amplificación de la señal debido a la unión de varios anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. [8]
El método indirecto, además de su mayor sensibilidad, también tiene la ventaja de que sólo es necesario generar una cantidad relativamente pequeña de anticuerpos secundarios conjugados (marcados) estándar. Por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado generado contra IgG de conejo es útil con cualquier anticuerpo primario generado en conejo. Esto es particularmente útil cuando un investigador está marcando más de un anticuerpo primario, ya sea debido a la selección policlonal que produce una serie de anticuerpos primarios para un antígeno singular o cuando hay interés en múltiples antígenos. Con el método directo, sería necesario marcar cada anticuerpo primario para cada antígeno de interés. [8]
Las moléculas informadoras varían según la naturaleza del método de detección, siendo las más comunes la detección cromogénica y fluorescente. En inmunohistoquímica cromogénica, un anticuerpo se conjuga con una enzima, como el fosfato alcalino (AP) y la peroxidasa de rábano picante (HRP), que puede catalizar una reacción productora de color en presencia de un sustrato cromogénico como la diaminobencidina (DAB). [4] El producto coloreado se puede analizar con un microscopio óptico común. [10] En la inmunofluorescencia, el anticuerpo se etiqueta con un fluoróforo , como isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), acetato de aminometil cumarina (AMCA) o cianina5 (Cy5). También se utilizan habitualmente fluorocromos sintéticos de Alexa Fluors. [10] [11] Los fluorocromos se pueden visualizar mediante un microscopio de fluorescencia o confocal. [10]
Para los métodos de detección cromogénica y fluorescente, el análisis densitométrico de la señal puede proporcionar datos semicuantitativos y totalmente cuantitativos, respectivamente, para correlacionar el nivel de la señal informadora con el nivel de expresión o localización de proteínas. [5]
Después de la tinción inmunohistoquímica del antígeno diana, a menudo se aplica otra tinción. La contratinción proporciona un contraste que ayuda a que la tinción primaria se destaque y facilita el examen de la morfología del tejido. También ayuda con la orientación y visualización de la sección del tejido. Generalmente se utiliza hematoxilina. [5] [12]
En las técnicas inmunohistoquímicas existen varios pasos previos a la tinción final del tejido que pueden provocar diversos problemas. Puede ser una fuerte tinción de fondo, una tinción débil del antígeno diana y la presencia de artefactos. Es importante optimizar la calidad de los anticuerpos y las técnicas de IHC. [13] La biotina endógena, las enzimas informadoras o la reactividad cruzada de anticuerpos primarios/secundarios son causas comunes de una fuerte tinción de fondo. [8] [10] La tinción débil o ausente puede deberse a una fijación inexacta del tejido o a niveles bajos de antígeno. Estos aspectos de la preparación de tejidos IHC y la tinción de anticuerpos deben abordarse sistemáticamente para identificar y superar los problemas de tinción. [4] [5]
Los métodos para eliminar la tinción de fondo incluyen la dilución de los anticuerpos primarios o secundarios, cambiar el tiempo o la temperatura de incubación y usar un sistema de detección diferente o un anticuerpo primario diferente. El control de calidad debe incluir como mínimo un tejido que se sabe que expresa el antígeno como control positivo y controles negativos de tejido que se sabe que no expresa el antígeno, así como el tejido de prueba sondeado de la misma manera con omisión del anticuerpo primario (o mejor , absorción del anticuerpo primario). [4]
La IHC es una excelente técnica de detección y tiene la enorme ventaja de poder mostrar exactamente dónde se encuentra una determinada proteína dentro del tejido examinado. También es una forma eficaz de examinar los tejidos. Esto la ha convertido en una técnica ampliamente utilizada en neurociencia , que permite a los investigadores examinar la expresión de proteínas dentro de estructuras cerebrales específicas. Su principal desventaja es que, a diferencia de las técnicas de inmunotransferencia en las que la tinción se compara con una escala de peso molecular , es imposible demostrar en IHC que la tinción se corresponde con la proteína de interés. Por este motivo, los anticuerpos primarios deben estar bien validados mediante Western Blot o procedimiento similar. La técnica se usa aún más ampliamente en patología quirúrgica diagnóstica para inmunofenotipado de tumores (por ejemplo, inmunotinción para e-cadherina para diferenciar entre DCIS (carcinoma ductal in situ: tinción positiva) y LCIS (carcinoma lobulillar in situ: no se tiñe positivo) [14] ). Más recientemente, las técnicas inmunohistoquímicas han sido útiles en el diagnóstico diferencial de múltiples formas de carcinomas de glándulas salivales, cabeza y cuello. [15]
La diversidad de marcadores IHC utilizados en el diagnóstico de patología quirúrgica es sustancial. Muchos laboratorios clínicos de hospitales terciarios tendrán menús de más de 200 anticuerpos utilizados como biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y predicción. Ejemplos de algunos marcadores de uso común incluyen:
En el cáncer se alteran diversas vías moleculares y algunas de las alteraciones pueden abordarse en la terapia contra el cáncer. La inmunohistoquímica se puede utilizar para evaluar qué tumores tienen probabilidades de responder a la terapia, detectando la presencia o niveles elevados de la diana molecular.
La biología tumoral permite una serie de objetivos intracelulares potenciales. Muchos tumores dependen de hormonas. La presencia de receptores hormonales se puede utilizar para determinar si un tumor potencialmente responde a la terapia antihormonal. Una de las primeras terapias fue el antiestrógeno tamoxifeno , utilizado para tratar el cáncer de mama. Estos receptores hormonales pueden detectarse mediante inmunohistoquímica. [18] Imatinib , un inhibidor de la tirosina quinasa intracelular , fue desarrollado para tratar la leucemia mielógena crónica , una enfermedad caracterizada por la formación de una tirosina quinasa anormal específica. Imitanib ha demostrado ser eficaz en tumores que expresan otras tirosina quinasas, en particular KIT. La mayoría de los tumores del estroma gastrointestinal expresan KIT, que puede detectarse mediante inmunohistoquímica. [19]
Muchas proteínas que según la inmunohistoquímica han demostrado estar altamente reguladas en estados patológicos son objetivos potenciales para terapias que utilizan anticuerpos monoclonales . Los anticuerpos monoclonales, debido a su tamaño, se utilizan contra objetivos de la superficie celular. Entre los objetivos sobreexpresados se encuentran miembros de la familia EGFR , proteínas transmembrana con un dominio receptor extracelular que regula una tirosina quinasa intracelular. [20] De estos, HER2/neu (también conocido como Erb-B2) fue el primero en desarrollarse. La molécula se expresa altamente en una variedad de tipos de células cancerosas, sobre todo en el cáncer de mama. Como tal, los anticuerpos contra HER2/neu han sido aprobados por la FDA para el tratamiento clínico del cáncer bajo el nombre de medicamento Herceptin . Existen pruebas inmunohistoquímicas disponibles comercialmente, Dako HercepTest, Leica Biosystems Oracle [21] y Ventana Pathway. [22]
De manera similar, EGFR (HER-1) se sobreexpresa en una variedad de cánceres, incluidos los de cabeza, cuello y colon. La inmunohistoquímica se utiliza para determinar los pacientes que pueden beneficiarse de anticuerpos terapéuticos como Erbitux (cetuximab). [23] Los sistemas comerciales para detectar EGFR mediante inmunohistoquímica incluyen Dako pharmDx.
La inmunohistoquímica también se puede utilizar para un perfil de proteínas más general, siempre que haya disponibilidad de anticuerpos validados para inmunohistoquímica. El Atlas de proteínas humanas muestra un mapa de la expresión de proteínas en órganos y tejidos humanos normales. La combinación de inmunohistoquímica y microarrays de tejidos proporciona patrones de expresión de proteínas en una gran cantidad de tipos de tejidos diferentes. La inmunohistoquímica también se utiliza para elaborar perfiles de proteínas en las formas más comunes de cáncer humano. [24] [25]
