La microscopía de imágenes de fluorescencia durante toda la vida o FLIM es una técnica de imágenes basada en las diferencias en la tasa de desintegración exponencial de la emisión de fotones de un fluoróforo de una muestra. Puede utilizarse como técnica de imágenes en microscopía confocal , microscopía de excitación de dos fotones y tomografía multifotónica.
La vida útil de la fluorescencia (FLT) del fluoróforo, en lugar de su intensidad, se utiliza para crear la imagen en FLIM. La vida útil de la fluorescencia depende del microambiente local del fluoróforo, lo que excluye cualquier medición errónea de la intensidad de la fluorescencia debido al cambio en el brillo de la fuente de luz, la intensidad de la luz de fondo o el fotoblanqueo limitado. Esta técnica también tiene la ventaja de minimizar el efecto de la dispersión de fotones en capas gruesas de muestra. Al depender del microambiente, las mediciones de vida útil se han utilizado como indicador de pH , [1] viscosidad [2] y concentración de especies químicas . [3] [4]
Un fluoróforo excitado por un fotón caerá al estado fundamental con una cierta probabilidad basada en las tasas de desintegración a través de varias vías de desintegración diferentes (radiativas y/o no radiativas). Para observar la fluorescencia, una de estas vías debe ser por emisión espontánea de un fotón. En la descripción del conjunto , la fluorescencia emitida decaerá con el tiempo según
dónde
En lo anterior, es el tiempo, es la vida útil de la fluorescencia, es la fluorescencia inicial en y son las velocidades para cada vía de desintegración, al menos una de las cuales debe ser la velocidad de desintegración de la fluorescencia . Más importante aún, la vida útil es independiente de la intensidad inicial y de la luz emitida. Esto se puede utilizar para realizar mediciones no basadas en la intensidad en la detección química. [5]
Las imágenes de fluorescencia durante toda la vida producen imágenes con la intensidad de cada píxel determinada por , lo que permite ver el contraste entre materiales con diferentes tasas de decadencia de fluorescencia (incluso si esos materiales fluorescen exactamente a la misma longitud de onda), y también produce imágenes que muestran cambios en otras vías de desintegración, como en las imágenes FRET .
La vida útil de la fluorescencia se puede determinar en el dominio del tiempo utilizando una fuente pulsada. Cuando una población de fluoróforos se excita mediante un pulso de luz ultracorto o delta , la fluorescencia resuelta en el tiempo decaerá exponencialmente como se describió anteriormente. Sin embargo, si el pulso de excitación o la respuesta de detección es amplia, la fluorescencia medida, d(t), no será puramente exponencial. La función de respuesta instrumental, IRF(t), se convolucionará o combinará con la función de caída, F(t).
La respuesta instrumental de la fuente, el detector y la electrónica se puede medir, generalmente a partir de luz de excitación dispersa. Recuperar la función de caída (y los tiempos de vida correspondientes) plantea desafíos adicionales, ya que la división en el dominio de la frecuencia tiende a producir mucho ruido cuando el denominador está cerca de cero.
El conteo de fotón único correlacionado con el tiempo ( TCSPC ) generalmente se emplea porque compensa las variaciones en la intensidad de la fuente y las amplitudes del pulso de fotón único. Utilizando equipos TCSPC comerciales se puede registrar una curva de caída de la fluorescencia con una resolución temporal de hasta 405 fs. [ cita necesaria ] [6] El histograma de caída de fluorescencia registrado obedece a las estadísticas de Poisson , que se consideran para determinar la bondad del ajuste durante el ajuste. Más específicamente, TCSPC registra los tiempos en los que los fotones individuales son detectados por un detector rápido de fotón único (normalmente un tubo fotomultiplicador ( PMT ) o un fotodiodo de avalancha de fotón único (SPAD)) con respecto al pulso del láser de excitación. Las grabaciones se repiten para múltiples pulsos láser y después de suficientes eventos registrados, se puede construir un histograma del número de eventos en todos estos puntos de tiempo registrados. Luego, este histograma se puede ajustar a una función exponencial que contiene la función de disminución exponencial de la vida útil de interés y, en consecuencia, se puede extraer el parámetro de vida útil. Se encuentran disponibles comercialmente sistemas PMT multicanal con 16 [7] a 64 elementos, mientras que los sistemas CMOS de diodo de avalancha de fotón único (SPAD) -TCSPC FLIM recientemente demostrados pueden ofrecer un número aún mayor de canales de detección y opciones adicionales de bajo costo. [8]
En este método todavía se utiliza la excitación por impulsos. Antes de que el pulso llegue a la muestra, parte de la luz es reflejada por un espejo dicroico y es detectada por un fotodiodo que activa un generador de retardo que controla un intensificador óptico controlado (GOI) que se encuentra frente al detector CCD. El Gobierno de la India solo permite la detección durante la fracción de tiempo en que está abierto después del retraso. Por lo tanto, con un generador de retardo ajustable, se puede recolectar la emisión de fluorescencia después de múltiples tiempos de retardo que abarcan el rango de tiempo de la disminución de la fluorescencia de la muestra. [9] [10] En los últimos años entraron en el mercado cámaras CCD intensificadas integradas. Estas cámaras constan de un intensificador de imagen, un sensor CCD y un generador de retardo integrado. Las cámaras ICCD con tiempos de activación más cortos de hasta 200 ps y pasos de retardo de 10 ps permiten una resolución FLIM de menos de nanosegundos. En combinación con un endoscopio, esta técnica se utiliza para el diagnóstico intraoperatorio de tumores cerebrales. [11]
La vida útil de la fluorescencia se puede determinar en el dominio de la frecuencia mediante un método de modulación de fase. El método utiliza una fuente de luz pulsada o modulada a alta frecuencia (hasta 500 MHz), como un LED, un láser de diodo o una fuente de onda continua combinada con un modulador electroóptico o un modulador acústico-óptico . La fluorescencia se (a.) se demodula y (b.) se desplaza de fase; ambas cantidades están relacionadas con los tiempos de desintegración característicos del fluoróforo. Además, se modularán los componentes y de las ondas sinusoidales de excitación y fluorescencia, y la vida útil se puede determinar a partir de la relación de modulación de estos componentes y. Por lo tanto, se pueden determinar dos valores para la vida útil mediante el método de modulación de fase. La vida útil se determina mediante procedimientos de ajuste de estos parámetros experimentales. Una ventaja de FLIM en el dominio de frecuencia basado en PMT o en cámara es su rápida adquisición de imágenes durante su vida útil, lo que lo hace adecuado para aplicaciones como la investigación de células vivas. [12]
El objetivo del algoritmo de análisis es extraer la curva de desintegración pura a partir de la desintegración medida y estimar la vida útil. Esto último generalmente se logra ajustando funciones exponenciales simples o múltiples. Se han desarrollado una variedad de métodos para resolver este problema. La técnica más utilizada es la reconvolución iterativa de mínimos cuadrados que se basa en la minimización de la suma ponderada de los residuos. En esta técnica, las curvas teóricas de caída exponencial se complican con la función de respuesta del instrumento, que se mide por separado, y el mejor ajuste se encuentra mediante el cálculo iterativo de los residuos para diferentes entradas hasta encontrar un mínimo. Para un conjunto de observaciones de la señal de fluorescencia en el intervalo de tiempo i, la estimación del tiempo de vida se lleva a cabo minimizando:
Además de las dificultades experimentales, incluida la función de respuesta del instrumento dependiente de la longitud de onda, el tratamiento matemático del problema de deconvolución iterativa no es sencillo y es un proceso lento que en los primeros días de FLIM lo hacía poco práctico para un análisis píxel por píxel. Los métodos de no ajuste son atractivos porque ofrecen una solución muy rápida para la estimación de la vida útil. Una de las técnicas más importantes y sencillas de esta categoría es el método de determinación rápida de la vida útil (RLD). RLD calcula la vida útil y sus amplitudes directamente dividiendo la curva de caída en dos partes de igual ancho t. El análisis se realiza integrando la curva de decaimiento en intervalos de tiempo iguales t:
Ii es la señal grabada en el i-ésimo canal y K es el número de canales. La vida útil se puede estimar utilizando:
Para desintegraciones multiexponenciales, esta ecuación proporciona la vida útil promedio. Este método se puede ampliar para analizar desintegraciones biexponenciales. Un inconveniente importante de este método es que no puede tener en cuenta el efecto de respuesta del instrumento y, por esta razón, la primera parte de las curvas de caída medidas deben ignorarse en los análisis. Esto significa que parte de la señal se descarta y la precisión para estimar tiempos de vida cortos disminuye.
Una de las características interesantes del teorema de convolución es que la integral de la convolución es el producto de los factores que forman la integral. Existen algunas técnicas que funcionan en el espacio transformado y que explotan esta propiedad para recuperar la curva de desintegración pura a partir de la curva medida. Se han utilizado las transformaciones de Laplace y Fourier junto con la expansión de Laguerre-Gauss para estimar la vida útil en el espacio transformado. Estos enfoques son más rápidos que los métodos basados en deconvolución, pero adolecen de problemas de truncamiento y muestreo. Además, la aplicación de métodos como la expansión de Laguerre-Gauss es matemáticamente complicada. En los métodos de Fourier, la vida útil de una única curva de caída exponencial viene dada por:
Dónde:
y n es el número armónico y T es el rango de tiempo total de detección.
FLIM se ha utilizado principalmente en biología como método para detectar fotosensibilizadores en células y tumores, así como FRET en casos en los que las imágenes radiométricas son difíciles. La técnica se desarrolló a finales de los años 1980 y principios de los 1990 (Método de activación: Bugiel et al. 1989. König 1989, [13] Modulación de fase: Lakowicz et al. 1992, [14] [15] ) antes de aplicarse más ampliamente en el finales de los años 1990. En cultivo celular, se ha utilizado para estudiar la señalización y el tráfico del receptor de EGF [16] . [17] El FLIM en el dominio del tiempo (tdFLIM) también se ha utilizado para mostrar la interacción de ambos tipos de proteínas de filamentos intermedios nucleares, láminas A y B1 en distintos homopolímeros en la envoltura nuclear, que interactúan aún más entre sí en estructuras de orden superior. [18] Las imágenes FLIM son particularmente útiles en neuronas, donde la dispersión de la luz por el tejido cerebral es problemática para las imágenes radiométricas. [19] En las neuronas, las imágenes FLIM que utilizan iluminación pulsada se han utilizado para estudiar las proteínas de la familia Ras , [20] CaMKII , Rac y Ran [21] . FLIM se ha utilizado en tomografía clínica multifotónica para detectar células cancerosas intradérmicas, así como compuestos farmacéuticos y cosméticos.
Más recientemente, FLIM también se ha utilizado para detectar flavanoles en células vegetales. [22]
El FLIM multifotónico se utiliza cada vez más para detectar la autofluorescencia de las coenzimas como marcadores de cambios en el metabolismo de los mamíferos. [23] [24]
Dado que la vida útil de la fluorescencia de un fluoróforo depende de procesos tanto radiativos (es decir, fluorescencia) como no radiativos (es decir, extinción, FRET), la transferencia de energía de la molécula donante a la molécula aceptora disminuirá la vida útil del donante. Por tanto, las mediciones FRET utilizando FLIM pueden proporcionar un método para discriminar entre los estados/ambientes del fluoróforo. [25] A diferencia de las mediciones FRET basadas en intensidad, las mediciones FRET basadas en FLIM también son insensibles a la concentración de fluoróforos y, por lo tanto, pueden filtrar artefactos introducidos por variaciones en la concentración y la intensidad de emisión en toda la muestra.
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