La espectroscopia láser ultrarrápida es una categoría de técnicas espectroscópicas que utilizan láseres de pulsos ultracortos para el estudio de la dinámica en escalas de tiempo extremadamente cortas ( de attosegundos a nanosegundos ). Se utilizan diferentes métodos para examinar la dinámica de los portadores de carga, átomos y moléculas. Se han desarrollado muchos procedimientos diferentes que abarcan diferentes escalas de tiempo y rangos de energía de fotones; a continuación se enumeran algunos métodos comunes.
En general, la dinámica en la escala de tiempo de femtosegundos es demasiado rápida para medirla electrónicamente. La mayoría de las mediciones se realizan empleando una secuencia de pulsos de luz ultracortos para iniciar un proceso y registrar su dinámica. El ancho temporal (duración) de los pulsos de luz debe estar en la misma escala que la dinámica que se va a medir o incluso ser más corta.
Los láseres de zafiro de titanio son láseres ajustables que emiten luz roja e infrarroja cercana (700 nm-1100 nm). Los osciladores láser de zafiro de titanio utilizan cristales de zafiro dopado con titanio como medio de ganancia y bloqueo de modo de lente Kerr para lograr pulsos de luz de subpicosegundos. Los pulsos típicos del oscilador de zafiro de titanio tienen una energía de nJ y tasas de repetición de 70-100 MHz. La amplificación de pulsos chirpeado a través de la amplificación regenerativa se puede utilizar para lograr energías de pulso más altas. Para la amplificación, los pulsos láser del oscilador de zafiro de titanio primero deben estirarse en el tiempo para evitar daños a la óptica, y luego se inyectan en la cavidad de otro láser donde los pulsos se amplifican a una tasa de repetición menor. Los pulsos amplificados regenerativamente se pueden amplificar aún más en un amplificador de múltiples pasos. Después de la amplificación, los pulsos se recomprimen a anchos de pulso similares a los anchos de pulso originales.
Un láser de colorante es un láser de cuatro niveles que utiliza un colorante orgánico como medio de ganancia. Al ser bombeado por un láser con una longitud de onda fija, debido a los distintos tipos de colorante que se utilizan, los distintos láseres de colorante pueden emitir haces con distintas longitudes de onda. El diseño de láser de anillo es el que se utiliza con mayor frecuencia en un sistema de láser de colorante. Además, los elementos de sintonización, como una rejilla de difracción o un prisma, suelen incorporarse en la cavidad. Esto permite que solo la luz en un rango de frecuencia muy estrecho resuene en la cavidad y se emita como emisión láser. El amplio rango de sintonización, la alta potencia de salida y el funcionamiento pulsado o de onda continua hacen que el láser de colorante sea particularmente útil en muchos estudios físicos y químicos.
Un láser de fibra se genera generalmente a partir de un diodo láser . Luego, el diodo láser acopla la luz en una fibra donde quedará confinada. Se pueden lograr diferentes longitudes de onda con el uso de fibra dopada. La luz de bombeo del diodo láser excitará un estado en la fibra dopada que luego puede disminuir en energía, lo que hace que se emita una longitud de onda específica. Esta longitud de onda puede ser diferente de la de la luz de bombeo y más útil para un experimento en particular.
Los pulsos ópticos ultrarrápidos se pueden utilizar para generar pulsos de rayos X de múltiples maneras. Un pulso óptico puede excitar un pulso de electrones a través del efecto fotoeléctrico , y la aceleración a través de un alto potencial proporciona a los electrones energía cinética. Cuando los electrones golpean un objetivo, generan rayos X característicos y radiación de frenado . Un segundo método es a través del plasma inducido por láser. Cuando una luz láser de muy alta intensidad incide sobre un objetivo, arranca electrones del objetivo creando una nube de plasma con carga negativa. La fuerte fuerza de Coulomb debido al material ionizado en el centro de la nube acelera rápidamente los electrones de regreso a los núcleos que quedaron atrás. Al colisionar con los núcleos, se emiten rayos X de frenado y de emisión característicos. Este método de generación de rayos X dispersa fotones en todas las direcciones, pero también genera pulsos de rayos X de picosegundos .
Para realizar mediciones espectroscópicas precisas, es necesario conocer varias características del pulso láser; la duración del pulso, la energía del pulso, la fase espectral y la forma espectral son algunas de ellas. [1] La información sobre la duración del pulso se puede determinar mediante mediciones de autocorrelación o mediante correlación cruzada con otro pulso bien caracterizado. Los métodos que permiten una caracterización completa de los pulsos incluyen la activación óptica resuelta en frecuencia (FROG) y la interferometría de fase espectral para la reconstrucción directa del campo eléctrico (SPIDER).
La conformación de pulsos consiste en modificar los pulsos de la fuente de una manera bien definida, incluida la manipulación de la amplitud, la fase y la duración del pulso. Para amplificar la intensidad del pulso, generalmente se emplea la amplificación de pulsos chirriantes , que incluye un extensor de pulsos, un amplificador y un compresor. No cambiará la duración o la fase del pulso durante la amplificación. La compresión de pulsos (acortamiento de la duración del pulso) se logra primero chirriando el pulso en un material no lineal y ampliando el espectro, con el siguiente compresor para la compensación de chirridos . En este caso, generalmente se utiliza un compresor de fibra. Los formadores de pulsos generalmente se refieren a moduladores ópticos que aplican transformadas de Fourier a un haz láser. Dependiendo de qué propiedad de la luz se controle, los moduladores se denominan moduladores de intensidad, moduladores de fase, moduladores de polarización, moduladores de luz espacial. Dependiendo del mecanismo de modulación, los moduladores ópticos se dividen en moduladores acústico-ópticos, moduladores electro-ópticos, moduladores de cristal líquido, etc. Cada uno está dedicado a diferentes aplicaciones. [2]
La generación de armónicos altos (HHG, por sus siglas en inglés) es un proceso no lineal en el que la radiación láser intensa se convierte de una frecuencia fija a armónicos altos de esa frecuencia mediante la ionización y la recolisión de un electrón. Fue observada por primera vez en 1987 por McPherson et al., quienes generaron con éxito una emisión armónica de hasta el orden 17 a 248 nm en gas neón. [3] La HHG se observa al enfocar un pulso ultrarrápido de alta intensidad y cercano al infrarrojo en un gas noble a intensidades de 10 13 –10 14 W/cm 2 y genera pulsos coherentes en la región XUV a rayos X suaves (100–1 nm) del espectro. Es realizable a escala de laboratorio (sistemas de sobremesa) a diferencia de las grandes instalaciones de láser de electrones libres.
La generación de armónicos elevados en los átomos se entiende bien en términos del modelo de tres pasos (ionización, propagación y recombinación). Ionización: el campo láser intenso modifica el potencial de Coulomb del átomo, el electrón atraviesa la barrera y se ioniza. Propagación: el electrón libre se acelera en el campo láser y gana impulso. Recombinación: cuando el campo se invierte, el electrón se acelera de nuevo hacia el progenitor iónico y libera un fotón con una energía muy alta. [4]
Los diferentes experimentos de espectroscopia requieren diferentes longitudes de onda de excitación o de sonda. Por esta razón, las técnicas de conversión de frecuencia se utilizan comúnmente para extender el espectro operativo de las fuentes de luz láser existentes. Las técnicas de conversión más extendidas se basan en el uso de cristales con no linealidad de segundo orden para realizar una amplificación paramétrica o una mezcla de frecuencias . La mezcla de frecuencias funciona superponiendo dos haces de longitudes de onda iguales o diferentes para generar una señal que es un armónico más alto o la frecuencia de la suma de los dos primeros. La amplificación paramétrica superpone un haz de sonda débil con un haz de bombeo de mayor energía en un cristal no lineal de modo que el haz débil se amplifica y la energía restante sale como un nuevo haz llamado inactivo. Este enfoque tiene la capacidad de generar pulsos de salida que son más cortos que los de entrada. Se han implementado diferentes esquemas de este enfoque. Algunos ejemplos son el oscilador paramétrico óptico (OPO), el amplificador paramétrico óptico (OPA) y el amplificador paramétrico no colineal (NOPA).
Este método es típico de los experimentos de "bombeo-sonda", donde se utiliza un láser pulsado para excitar los electrones en un material (como una molécula o un sólido semiconductor) desde sus estados fundamentales a estados excitados de mayor energía . Se utiliza una fuente de luz de sondeo, normalmente una lámpara de arco de xenón o un pulso láser de banda ancha creado por generación de supercontinuo , para obtener un espectro de absorción del compuesto en varios momentos después de su excitación. A medida que las moléculas excitadas absorben la luz de la sonda, se excitan aún más a estados aún más altos o se las induce a regresar al estado fundamental de forma radiativa a través de una emisión estimulada . Después de pasar a través de la muestra, la luz de la sonda no absorbida continúa hasta un fotodetector, como una matriz de fotodiodos de avalancha o una cámara CMOS , y los datos se procesan para generar un espectro de absorción del estado excitado. Dado que todas las moléculas o sitios de excitación en la muestra no experimentarán la misma dinámica simultáneamente, este experimento debe llevarse a cabo muchas veces (donde cada "experimento" proviene de un solo par de interacciones de pulso láser de sonda y bomba), y los datos deben promediarse para generar espectros con intensidades y picos precisos. Debido a que el fotoblanqueo y otras reacciones fotoquímicas o fototérmicas pueden ocurrir en las muestras, este método requiere evaluar estos efectos midiendo la misma muestra en el mismo lugar muchas veces con diferentes intensidades de bomba y sonda. La mayoría de las veces, las muestras líquidas se agitan durante la medición, lo que hace que la cinética de tiempo relativamente largo sea difícil de medir debido al flujo y la difusión. A diferencia del recuento de fotones individuales correlacionados con el tiempo (TCSPC), esta técnica se puede llevar a cabo en muestras no fluorescentes. También se puede realizar en muestras no transmisivas en una geometría de reflexión.
La absorción transitoria ultrarrápida puede utilizar casi cualquier luz de sonda, siempre que la sonda tenga una longitud de onda o un conjunto de longitudes de onda pertinentes. Un monocromador y un tubo fotomultiplicador en lugar del conjunto de fotodiodos de avalancha permiten la observación de una única longitud de onda de sonda y, por lo tanto, permiten sondear la cinética de desintegración de las especies excitadas. El propósito de esta configuración es tomar mediciones cinéticas de especies que de otro modo no serían radiactivas y, específicamente, es útil para observar especies que tienen poblaciones de vida corta y no fosforescentes dentro de la variedad de tripletes como parte de su trayectoria de desintegración. El láser pulsado en esta configuración se utiliza tanto como fuente de excitación primaria como señal de reloj para las mediciones ultrarrápidas. Aunque es laborioso y requiere mucho tiempo, la posición del monocromador también se puede cambiar para permitir que se construyan perfiles de desintegración de absorbancia, en última instancia con el mismo efecto que el método anterior.
Los datos de las mediciones UTA suelen ser espectros de absorción reconstruidos secuenciados a lo largo del tiempo de retardo entre la bomba y la sonda. Cada espectro se asemeja a un perfil de absorción de estado estable normal de la muestra después del tiempo de retardo de la excitación con la resolución temporal convolucionada a partir de las resoluciones temporales de la bomba y la sonda. La longitud de onda de excitación es cegada por el láser de la bomba y recortada. El resto de los espectros suelen tener algunas bandas, como la absorción del estado fundamental, la absorción del estado excitado y la emisión estimulada. En condiciones normales, los ángulos de la emisión están orientados aleatoriamente y no se detectan en la geometría de absorción. Pero en la medición UTA, la emisión estimulada se asemeja al efecto láser, está muy orientada y se detecta. Muchas veces, esta emisión se superpone con las bandas de absorción y necesita ser deconvolucionada para el análisis cuantitativo. [5] La relación y correlación entre estas bandas se puede visualizar utilizando el análisis de correlación bidimensional espectroscópico clásico . [6]
La espectroscopia fotoelectrónica con resolución temporal y la espectroscopia fotoelectrónica de dos fotones (2PPE) combinan un esquema de bombeo-sonda con fotoemisión con resolución angular. Se utiliza un primer pulso láser para excitar un material, un segundo pulso láser ioniza el sistema. Luego se detecta la energía cinética de los electrones de este proceso mediante diversos métodos, como el mapeo de energía, las mediciones del tiempo de vuelo , etc. Como se indicó anteriormente, el proceso se repite muchas veces, con diferentes retrasos de tiempo entre el pulso de la sonda y el pulso de bombeo. Esto crea una imagen de cómo se relaja la molécula con el tiempo. Una variación de este método analiza los iones positivos creados en este proceso y se denomina espectroscopia fotoiónica con resolución temporal (TRPIS).
Utilizando los mismos principios iniciados por los experimentos de RMN 2D , es posible la espectroscopia óptica o infrarroja multidimensional utilizando pulsos ultrarrápidos. Diferentes frecuencias pueden investigar varios procesos moleculares dinámicos para diferenciar entre ensanchamiento de línea no homogéneo y homogéneo , así como identificar el acoplamiento entre las transiciones espectroscópicas medidas. Si dos osciladores están acoplados entre sí, ya sea vibraciones intramoleculares o acoplamiento electrónico intermolecular, la dimensionalidad agregada resolverá las respuestas anarmónicas no identificables en los espectros lineales. Una secuencia de pulsos 2D típica consiste en un pulso inicial para bombear el sistema a una superposición coherente de estados, seguido de un segundo pulso conjugado de fase que empuja al sistema a un estado excitado no oscilante y, finalmente, un tercer pulso que lo convierte nuevamente a un estado coherente que produce un pulso medible. [7] Luego, se puede registrar un espectro de frecuencia 2D al trazar la transformada de Fourier del retraso entre el primer y el segundo pulso en un eje, y la transformada de Fourier del retraso entre un pulso de detección en relación con el tercer pulso productor de señal en el otro eje. La espectroscopia 2D es un ejemplo de un experimento de mezcla de cuatro ondas , y el vector de onda de la señal será la suma de los tres vectores de onda incidentes utilizados en la secuencia de pulsos. Existen espectroscopias multidimensionales en variantes infrarrojas [8] y visibles, así como combinaciones que utilizan diferentes regiones de longitud de onda.
La mayoría de las técnicas de obtención de imágenes ultrarrápidas son variaciones de los experimentos estándar de bombeo-sonda. Algunas técnicas comúnmente utilizadas son la obtención de imágenes por difracción de electrones, [9] la microscopía con compuerta de Kerr, [10] la obtención de imágenes con pulsos de electrones ultrarrápidos [11] y la obtención de imágenes de terahercios . [12] Esto es particularmente cierto en la comunidad biomédica, donde las técnicas seguras y no invasivas para el diagnóstico son siempre de interés. La obtención de imágenes de terahercios se ha utilizado recientemente para identificar áreas de caries en el esmalte dental y obtener imágenes de las capas de la piel. Además, ha demostrado ser capaz de distinguir con éxito una región de carcinoma de mama del tejido sano. [12] Otra técnica llamada microscopía amplificada codificada en el tiempo en serie ha demostrado tener la capacidad de detectar incluso antes cantidades traza de células cancerosas en la sangre. [13] Otras aplicaciones no biomédicas incluyen la obtención de imágenes ultrarrápidas alrededor de las esquinas o a través de objetos opacos.
La conversión ascendente de femtosegundos es una técnica de bombeo-sonda que utiliza una óptica no lineal para combinar la señal de fluorescencia y la señal de la sonda para crear una señal con una nueva frecuencia a través de la conversión ascendente de fotones , que se detecta posteriormente. La sonda escanea los tiempos de retardo después de que la bomba excita la muestra, generando un gráfico de intensidad a lo largo del tiempo. [14]
Los procesos ultrarrápidos se encuentran en toda la biología. Hasta la llegada de los métodos de femtosegundos, muchos de los mecanismos de dichos procesos eran desconocidos. [15] [16] Algunos ejemplos de estos incluyen la fotoisomerización cis-trans del cromóforo de rodopsina retinal , la dinámica del estado excitado y de la población del ADN y los procesos de transferencia de carga en los centros de reacción fotosintética. [16] La dinámica de la transferencia de carga en los centros de reacción fotosintética tiene una relación directa con la capacidad del hombre para desarrollar tecnología de recolección de luz, mientras que la dinámica del estado excitado del ADN tiene implicaciones en enfermedades como el cáncer de piel . [17] [18] Los avances en los métodos de femtosegundos son cruciales para la comprensión de los fenómenos ultrarrápidos en la naturaleza.
La fotodisociación es una reacción química en la que un compuesto químico se descompone por acción de los fotones. Se define como la interacción de uno o más fotones con una molécula diana. Cualquier fotón con suficiente energía puede afectar a los enlaces químicos de un compuesto químico, como la luz visible, la luz ultravioleta, los rayos X y los rayos gamma. La técnica de sondeo de reacciones químicas se ha aplicado con éxito a las disociaciones unimoleculares. La posibilidad de utilizar una técnica de femtosegundos para estudiar reacciones bimoleculares a nivel de colisión individual se complica por las dificultades de sincronización espacial y temporal. Una forma de superar este problema es mediante el uso de complejos de Van der Waals de cúmulos moleculares débilmente enlazados. Las técnicas de femtosegundos no se limitan a la observación de las reacciones químicas, sino que incluso pueden aprovecharse para influir en el curso de la reacción. Esto puede abrir nuevos canales de relajación o aumentar el rendimiento de ciertos productos de reacción.
A diferencia de los pulsos de attosegundos y femtosegundos, la duración de los pulsos en la escala de tiempo de nanosegundos es lo suficientemente lenta como para ser medida a través de medios electrónicos. Las cámaras de rayas traducen el perfil temporal de los pulsos en un perfil espacial; es decir, los fotones que llegan al detector en diferentes momentos llegan a diferentes lugares del detector.
El conteo de fotones individuales correlacionados con el tiempo (TCSPC) se utiliza para analizar la relajación de las moléculas desde un estado excitado a un estado de menor energía. Dado que varias moléculas en una muestra emitirán fotones en diferentes momentos después de su excitación simultánea, se debe pensar que la descomposición tiene una cierta tasa en lugar de ocurrir en un momento específico después de la excitación. La configuración experimental se ajusta para detectar 1 fotón por cada 100 pulsos de excitación. En otras palabras, se detecta menos de un fotón emitido por pulso láser y el proceso se repite varias veces para obtener un valor promedio. Mide la diferencia de tiempo entre el pulso de excitación y la detección del fotón, también llamada ancho de tiempo (Δt). La curva de descomposición de la fluorescencia se obtiene trazando el tiempo medido en el eje x y el número de fotones detectados en el eje y. Sin embargo, es difícil monitorear simultáneamente múltiples moléculas. En cambio, se registran eventos individuales de excitación-relajación y luego se promedian para generar la curva. [19]
Esta técnica analiza la diferencia de tiempo entre la excitación de la molécula de muestra y la liberación de energía en forma de otro fotón. Si se repite este proceso muchas veces se obtendrá un perfil de desintegración. Se pueden utilizar láseres pulsados o LED como fuente de excitación. Una parte de la luz pasa a través de la muestra y la otra a los componentes electrónicos como señal de "sincronización". La luz emitida por la molécula de muestra pasa a través de un monocromador para seleccionar una longitud de onda específica. Luego, la luz se detecta y amplifica mediante un tubo fotomultiplicador (PMT). La señal de luz emitida, así como la señal de luz de referencia, se procesan mediante un discriminador de fracción constante (CFD) que elimina la fluctuación de tiempo. Después de pasar por el CFD, el pulso de referencia activa un circuito convertidor de tiempo a amplitud (TAC). El TAC carga un condensador que retendrá la señal hasta el siguiente pulso eléctrico. En el modo TAC inverso, la señal de "sincronización" detiene el TAC. A continuación, estos datos se procesan mediante un convertidor analógico a digital (ADC) y un analizador multicanal (MCA) para obtener una salida de datos. Para asegurarse de que la desintegración no esté sesgada hacia los fotones que llegan temprano, la tasa de conteo de fotones se mantiene baja (generalmente menos del 1 % de la tasa de excitación). [20]
Este pulso eléctrico se produce después de que el segundo pulso láser excita la molécula a un estado de mayor energía, y finalmente se emite un fotón desde una sola molécula al regresar a su estado original. Por lo tanto, cuanto más tiempo tarda una molécula en emitir un fotón, mayor es el voltaje del pulso resultante. El concepto central de esta técnica es que solo se necesita un solo fotón para descargar el condensador. Por lo tanto, este experimento debe repetirse muchas veces para recopilar el rango completo de retrasos entre la excitación y la emisión de un fotón. Después de cada prueba, una computadora precalibrada convierte el voltaje enviado por el TAC en un tiempo y registra el evento en un histograma del tiempo desde la excitación. Dado que la probabilidad de que ninguna molécula se haya relajado disminuye con el tiempo, surge una curva de decaimiento que luego puede analizarse para averiguar la tasa de decaimiento del evento. [21]
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Tres curvas están asociadas con la intensidad de decaimiento observada en un experimento de decaimiento de fluorescencia: los datos medidos, la función de respuesta del instrumento (IRF) y el decaimiento calculado. La IRF, que representa el perfil de tiempo más corto que el instrumento puede detectar, sirve como referencia para deconvolucionar con precisión los datos medidos. Esto permite una determinación más precisa del tiempo de decaimiento de la fluorescencia al tener en cuenta la respuesta inherente del sistema. Como el término lo indica, esta curva ilustra la respuesta del instrumento a una muestra con una vida útil cero. Por lo general, se utilizan soluciones de dispersión diluidas, como Ludox ( sílice coloidal ) y dióxido de titanio para recopilar la curva. La intensidad medida indica el número de fotones detectados dentro de un intervalo de tiempo determinado, mientras que la curva de decaimiento calculada, también conocida como curva ajustada, representa la convolución de la IRF con la función de respuesta al impulso. [22] [23]
Un factor de complicación importante es que muchos procesos de desintegración involucran múltiples estados de energía y, por lo tanto, múltiples constantes de velocidad. Aunque el análisis de mínimos cuadrados no lineales generalmente puede detectar las diferentes constantes de velocidad, determinar los procesos involucrados es a menudo muy difícil y requiere la combinación de múltiples técnicas ultrarrápidas. Aún más complicada es la presencia de cruces entre sistemas y otros procesos no radiativos en una molécula. Un factor limitante de esta técnica es que se limita al estudio de los estados de energía que resultan en la desintegración fluorescente. La técnica también se puede utilizar para estudiar la relajación de los electrones desde la banda de conducción a la banda de valencia en semiconductores. [24] [25]
La TCSPC tiene amplias aplicaciones en espectroscopia de fluorescencia , microscopía ( FLIM ) y tomografía óptica. A lo largo de los años, esta técnica ha ganado una atención significativa para estudiar la descomposición de la fluorescencia de varias clases de moléculas, incluida la descomposición de la fluorescencia de residuos en sistemas biológicos. La modulación de la fluorescencia de la muestra biológica proporciona una mejor comprensión del sistema complejo. La TCSPC se usa ampliamente para estudiar la descomposición de la intensidad de las proteínas fluorescentes verdes (GFP), los agregados de clorofila en hexano, [26] las proteínas que contienen un solo aminoácido fluorescente y los dinucleótidos (FAD). [27] También se utiliza para estudiar el ancho de banda en semiconductores . [28]
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