Microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia

Técnica de imagen basada en fluorescencia

La microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia o FLIM es una técnica de obtención de imágenes basada en las diferencias en la tasa de decaimiento exponencial de la emisión de fotones de un fluoróforo de una muestra. Se puede utilizar como técnica de obtención de imágenes en microscopía confocal , microscopía de excitación de dos fotones y tomografía multifotónica.

La vida útil de la fluorescencia (FLT) del fluoróforo, en lugar de su intensidad, se utiliza para crear la imagen en FLIM. La vida útil de la fluorescencia depende del microambiente local del fluoróforo, lo que evita cualquier medición errónea en la intensidad de la fluorescencia debido al cambio en el brillo de la fuente de luz, la intensidad de la luz de fondo o el blanqueamiento fotográfico limitado. Esta técnica también tiene la ventaja de minimizar el efecto de la dispersión de fotones en capas gruesas de muestra. Al depender del microambiente, las mediciones de la vida útil se han utilizado como un indicador de pH , ^[1] viscosidad ^{[2] y} concentración de especies químicas . ^{[3] [4]}

Duración de la vida de la fluorescencia

Un fluoróforo excitado por un fotón caerá al estado fundamental con una cierta probabilidad basada en las tasas de desintegración a través de una serie de vías de desintegración diferentes (radiativas y/o no radiactivas). Para observar fluorescencia, una de estas vías debe ser mediante la emisión espontánea de un fotón. En la descripción del conjunto , la fluorescencia emitida decaerá con el tiempo según

${\displaystyle I(t)=I_{0}e^{-t/\tau }}$

dónde

${\displaystyle {\frac {1}{\tau }}=\sum k_{i}}$.

En lo anterior, es el tiempo, es el tiempo de vida de la fluorescencia, es la fluorescencia inicial en , y son las tasas para cada vía de desintegración, al menos una de las cuales debe ser la tasa de desintegración de la fluorescencia . Más importante aún, el tiempo de vida, es independiente de la intensidad inicial y de la luz emitida. Esto se puede utilizar para realizar mediciones no basadas en la intensidad en la detección química. ^[5] ${\displaystyle t}$ ${\displaystyle \tau }$ ${\displaystyle I_{0}}$ ${\displaystyle t=0}$ ${\displaystyle k_{i}}$ ${\displaystyle k_{f}}$ ${\displaystyle \tau }$

Medición

Las imágenes de vida útil de fluorescencia producen imágenes con la intensidad de cada píxel determinada por , lo que permite ver el contraste entre materiales con diferentes tasas de desintegración de la fluorescencia (incluso si esos materiales fluorescen exactamente en la misma longitud de onda) y también produce imágenes que muestran cambios en otras vías de desintegración, como en las imágenes FRET . ${\displaystyle \tau }$

Iluminación pulsada

La duración de la fluorescencia se puede determinar en el dominio del tiempo mediante el uso de una fuente pulsada. Cuando una población de fluoróforos se excita con un pulso de luz ultracorto o delta , la fluorescencia resuelta en el tiempo decaerá exponencialmente como se describió anteriormente. Sin embargo, si el pulso de excitación o la respuesta de detección son amplios, la fluorescencia medida, d(t), no será puramente exponencial. La función de respuesta instrumental, IRF(t), se convolucionará o combinará con la función de decaimiento, F(t).

${\displaystyle {d}(t)={IRF}(t)\otimes {F}(t)}$

La respuesta instrumental de la fuente, el detector y la electrónica se puede medir, generalmente a partir de la luz de excitación dispersa. La recuperación de la función de decaimiento (y sus correspondientes tiempos de vida) plantea desafíos adicionales, ya que la división en el dominio de frecuencia tiende a producir mucho ruido cuando el denominador está cerca de cero.

PCTC

El conteo de fotones individuales correlacionado en el tiempo ( TCSPC ) se emplea generalmente porque compensa las variaciones en la intensidad de la fuente y las amplitudes de los pulsos de fotones individuales. Utilizando un equipo TCSPC comercial, se puede registrar una curva de decaimiento de fluorescencia con una resolución temporal de hasta 405 fs. ^{[ cita requerida ] [6]} El histograma de decaimiento de fluorescencia registrado obedece a las estadísticas de Poisson que se consideran para determinar la bondad del ajuste durante el ajuste. Más específicamente, TCSPC registra los tiempos en los que los fotones individuales son detectados por un detector rápido de fotón único (normalmente un tubo fotomultiplicador ( PMT ) o un fotodiodo de avalancha de fotón único (SPAD)) con respecto al pulso láser de excitación. Los registros se repiten para múltiples pulsos láser y después de suficientes eventos registrados, uno puede construir un histograma de la cantidad de eventos en todos estos puntos de tiempo registrados. Este histograma puede luego ajustarse a una función exponencial que contiene la función de decaimiento de vida exponencial de interés, y el parámetro de vida puede extraerse en consecuencia. Los sistemas PMT multicanal con 16 ^[7] a 64 elementos están disponibles comercialmente, mientras que los sistemas FLIM de diodo de avalancha de fotón único CMOS (SPAD)-TCSPC recientemente demostrados pueden ofrecer una cantidad aún mayor de canales de detección y opciones adicionales de bajo costo. ^[8]

Método de compuerta

La excitación por pulsos todavía se utiliza en este método. Antes de que el pulso llegue a la muestra, parte de la luz se refleja en un espejo dicroico y es detectada por un fotodiodo que activa un generador de retardo que controla un intensificador óptico controlado (GOI) que se encuentra frente al detector CCD. El GOI solo permite la detección durante la fracción de tiempo en que está abierto después del retardo. Por lo tanto, con un generador de retardo ajustable, se puede recolectar la emisión de fluorescencia después de múltiples tiempos de retardo que abarcan el rango de tiempo de la descomposición de la fluorescencia de la muestra. ^{[9] [10]} En los últimos años, las cámaras CCD intensificadas integradas ingresaron al mercado. Estas cámaras constan de un intensificador de imágenes, un sensor CCD y un generador de retardo integrado. Las cámaras ICCD con tiempos de activación más cortos de hasta 200 ps y pasos de retardo de 10 ps permiten una resolución FLIM de subnanosegundos. En combinación con un endoscopio, esta técnica se utiliza para el diagnóstico intraoperatorio de tumores cerebrales. ^[11]

Modulación de fase

La duración de la fluorescencia se puede determinar en el dominio de frecuencia mediante un método de modulación de fase. El método utiliza una fuente de luz pulsada o modulada a alta frecuencia (hasta 500 MHz), como un LED, un láser de diodo o una fuente de onda continua combinada con un modulador electroóptico o un modulador acústico-óptico . La fluorescencia se (a.) demodula y (b.) desplaza en fase; ambas cantidades están relacionadas con los tiempos de decaimiento característicos del fluoróforo. Además, se modularán los componentes y de las ondas sinusoidales de excitación y fluorescencia, y la duración se puede determinar a partir de la relación de modulación de estos componentes y. Por lo tanto, se pueden determinar 2 valores para la duración a partir del método de modulación de fase. Las duraciones se determinan a través de procedimientos de ajuste de estos parámetros experimentales. Una ventaja del dominio de frecuencia FLIM basado en PMT o en cámara es su rápida adquisición de imágenes de duración, lo que lo hace adecuado para aplicaciones como la investigación de células vivas. ^[12]

Análisis

El objetivo del algoritmo de análisis es extraer la curva de decaimiento pura a partir del decaimiento medido y estimar la duración de vida. Esto último se logra generalmente ajustando funciones exponenciales simples o múltiples. Se han desarrollado diversos métodos para resolver este problema. La técnica más utilizada es la reconvolución iterativa de mínimos cuadrados, que se basa en la minimización de la suma ponderada de los residuos. En esta técnica, las curvas de decaimiento exponencial teóricas se convolucionan con la función de respuesta del instrumento, que se mide por separado, y el mejor ajuste se encuentra mediante el cálculo iterativo de los residuos para diferentes entradas hasta que se encuentra un mínimo. Para un conjunto de observaciones de la señal de fluorescencia en el intervalo de tiempo i, la estimación de la duración de vida se lleva a cabo mediante la minimización de: ${\displaystyle d({{t}_{i}})}$

${\displaystyle {{\chi }^{2}}=\sum \limits _{i}{{\left[{{d}_{i}}({{t}_{i}})-{{d}_{0i}}({{t}_{i}},a,\tau )\right]}^{2}}}$

Además de las dificultades experimentales, incluida la función de respuesta del instrumento dependiente de la longitud de onda, el tratamiento matemático del problema de deconvolución iterativa no es sencillo y es un proceso lento que en los primeros días de FLIM lo hacía impráctico para un análisis píxel por píxel. Los métodos que no se ajustan son atractivos porque ofrecen una solución muy rápida para la estimación de la vida útil. Una de las técnicas principales y sencillas en esta categoría es el método de determinación rápida de la vida útil (RLD). RLD calcula las vidas útiles y sus amplitudes directamente dividiendo la curva de decaimiento en dos partes de igual ancho t. El análisis se realiza integrando la curva de decaimiento en intervalos de tiempo iguales t: ${\displaystyle \delta }$ ${\displaystyle \delta }$

${\displaystyle {\begin{matrix}{{D}_{0}}=\sum \limits _{i=1}^{K/2}{{{I}_{i}}\delta t}&{{D}_{1}}=\sum \limits _{i=K/2}^{K}{{{I}_{i}}\delta t}\\\end{matrix}}}$

Ii es la señal registrada en el canal i y K es el número de canales. La duración se puede estimar mediante:

${\displaystyle \tau =\delta t/\ln({{D}_{0}}/{{D}_{1}})}$

Para desintegraciones multiexponenciales, esta ecuación proporciona la vida útil promedio. Este método se puede ampliar para analizar desintegraciones biexponenciales. Una desventaja importante de este método es que no puede tener en cuenta el efecto de la respuesta del instrumento y, por este motivo, la parte inicial de las curvas de desintegración medidas debe ignorarse en los análisis. Esto significa que se descarta parte de la señal y se reduce la precisión para estimar vidas útiles cortas.

Una de las características interesantes del teorema de convolución es que la integral de la convolución es el producto de los factores que componen la integral. Existen algunas técnicas que funcionan en el espacio transformado y que aprovechan esta propiedad para recuperar la curva de decaimiento pura a partir de la curva medida. Se han utilizado las transformaciones de Laplace y de Fourier junto con la expansión de Gauss de Laguerre para estimar la duración de vida en el espacio transformado. Estos enfoques son más rápidos que los métodos basados ​​en la deconvolución, pero sufren problemas de truncamiento y muestreo. Además, la aplicación de métodos como la expansión de Gauss de Laguerre es matemáticamente complicada. En los métodos de Fourier, la duración de vida de una única curva de decaimiento exponencial viene dada por:

${\displaystyle \tau ={\frac {1}{n\omega }}{\frac {{A}_{n}}{{B}_{n}}}}$

Dónde:

${\displaystyle {\begin{matrix}{{A}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\sin(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF(t)\sin(n\omega t)}}}={\frac {\omega \tau }{1+{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&{{B}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\cos(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF\cos(n\omega t)}}}={\frac {1}{1+n{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&\omega ={\frac {2\pi }{T}}\\\end{matrix}}}$

y n es el número armónico y T es el rango de tiempo total de detección.

Aplicaciones

FLIM se ha utilizado principalmente en biología como un método para detectar fotosensibilizadores en células y tumores, así como FRET en casos en los que la obtención de imágenes raciométricas es difícil. La técnica se desarrolló a finales de los años 1980 y principios de los años 1990 (método Gating: Bugiel et al. 1989. König 1989, ^[13] Modulación de fase: Lakowicz et al. 1992, ^{[14] [15]} ) antes de aplicarse más ampliamente a finales de los años 1990. En cultivos celulares, se ha utilizado para estudiar la señalización del receptor de EGF ^[16] y el tráfico. ^[17] El FLIM de dominio temporal (tdFLIM) también se ha utilizado para mostrar la interacción de ambos tipos de proteínas de filamento intermedio nuclear láminas A y B1 en homopolímeros distintos en la envoltura nuclear, que interactúan además entre sí en estructuras de orden superior. ^[18] La obtención de imágenes FLIM es particularmente útil en neuronas, donde la dispersión de la luz por el tejido cerebral es problemática para la obtención de imágenes raciométricas. ^[19] En neuronas, la obtención de imágenes FLIM mediante iluminación pulsada se ha utilizado para estudiar las proteínas de la familia Ras , ^[20] CaMKII , Rac y Ran ^[21] . La obtención de imágenes FLIM se ha utilizado en la tomografía multifotónica clínica para detectar células cancerosas intradérmicas, así como compuestos farmacéuticos y cosméticos.

Más recientemente, FLIM también se ha utilizado para detectar flavonoles en células vegetales. ^[22]

Coenzimas autofluorescentesNAD(P)HyMODA

La FLIM multifotón se utiliza cada vez más para detectar la autofluorescencia de las coenzimas como marcadores de cambios en el metabolismo de los mamíferos. ^{[23] [24]}

Imágenes FRET

Dado que la vida útil de la fluorescencia de un fluoróforo depende tanto de procesos radiativos (es decir, fluorescencia) como no radiativos (es decir, extinción, FRET), la transferencia de energía de la molécula donante a la molécula aceptora disminuirá la vida útil del donante. Por lo tanto, las mediciones FRET utilizando FLIM pueden proporcionar un método para discriminar entre los estados/entornos del fluoróforo. ^[25] A diferencia de las mediciones FRET basadas en la intensidad, las mediciones FRET basadas en FLIM también son insensibles a la concentración de fluoróforos y, por lo tanto, pueden filtrar los artefactos introducidos por variaciones en la concentración y la intensidad de emisión en la muestra.

Véase también

• Enfoque fasorial para la duración de la fluorescencia y la obtención de imágenes espectrales

Referencias

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Enlaces externos

• Imágenes de vida útil en estado excitado por fluorescencia
• Herramientas de análisis espectral y de duración de vida en ImageJ: http://spechron.com Archivado el 11 de marzo de 2013 en Wayback Machine
• Microscopía de imágenes de fluorescencia de duración limitada
• Principio de TCSPC FLIM (Becker&Hickl GmbH)