El término glicosintasa se refiere a una clase de proteínas que han sido diseñadas para catalizar la formación de un enlace glicosídico . Las glicosintasas se derivan de enzimas glicosidasas , que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos. [2] Tradicionalmente se formaban a partir de la retención de glicosidasa mediante la mutación del aminoácido nucleofílico del sitio activo (generalmente un aspartato o glutamato ) a un pequeño aminoácido no nucleofílico (generalmente alanina o glicina ). Los enfoques más modernos utilizan la evolución dirigida para detectar sustituciones de aminoácidos que mejoran la actividad de la glicosintasa. [3]
Dos descubrimientos condujeron al desarrollo de enzimas glicosintasas. La primera fue que un cambio del nucleófilo del sitio activo de una glicosidasa de un carboxilato a otro aminoácido dio como resultado una proteína plegada adecuadamente que no tenía actividad hidrolasa . [4]
El segundo descubrimiento fue que algunas enzimas glicosidasas podían catalizar la hidrólisis de fluoruros de glicosilo que tenían la configuración anomérica incorrecta . [5] Las enzimas experimentaron una reacción de transglucosidación para formar un disacárido , que luego fue un sustrato para la actividad hidrolasa.
La primera glicosintasa reportada fue un mutante de Agrobacterium sp. β-glucosidasa/galactosidasa en la que el nucleófilo glutamato 358 se mutó a alanina mediante mutagénesis dirigida al sitio . [6] Cuando se incubó con fluoruros de α-glicosilo y un azúcar aceptor, se descubrió que catalizaba la reacción de transglucosidación sin ninguna hidrólisis. Esta glicosintasa se utilizó para sintetizar una serie de productos di y trisacáridos con rendimientos entre 64% y 92%.
El mecanismo de una glicosintasa es similar a la reacción de hidrólisis de las glicosidasas retenedoras, excepto que no se forma ningún intermediario enzimático covalente. La mutación del nucleófilo del sitio activo a un aminoácido no nucleófilo previene la formación de un intermedio covalente. Se requiere un donante de glicosilo activado con un buen grupo saliente anomérico (a menudo un flúor). El grupo saliente es desplazado por un alcohol del azúcar aceptor ayudado por el aminoácido base general del sitio activo de la enzima.
La primera glicosintasa fue una exoglicosidasa de retención que catalizó la formación de glucósidos de glucosa y galactosa con enlaces β 1-4 . Desde entonces, las enzimas glicosintasas se han ampliado para incluir mutantes de endoglicosidasa , [7] así como mutantes de glicosidasa inversora. [8] Los sustratos de la glicosintasa incluyen glucosa, galactosa, manosa , xilosa y ácido glucurónico . [9] Los métodos modernos para preparar glicosintasa utilizan la evolución dirigida para introducir modificaciones que mejoran la función de las enzimas. Este proceso estuvo disponible gracias al desarrollo de filtros de alto rendimiento para la actividad de la glicosintasa.
Las glicosintasas han sido útiles para la preparación de oligosacáridos ; sin embargo, su uso adolece de ciertas limitaciones. En primer lugar, la glicosintasa sólo se puede utilizar para sintetizar enlaces glicosídicos para los cuales existe una glicosidasa conocida. Esta glicosidasa también debe convertirse primero en glicosintasa, lo que no siempre es posible. En segundo lugar, el producto de la reacción de la glicosintasa es a menudo un mejor sustrato para la glicosintasa que el material de partida, lo que da como resultado la formación de múltiples productos de longitudes variables. Finalmente, las glicosintasas son específicas para el azúcar donante, pero a menudo tienen una especificidad vaga para el azúcar aceptor. Esto puede dar como resultado una regioselectividad diferente según el aceptor, lo que da como resultado productos con diferentes enlaces glicosídicos. Un ejemplo es el Agrobacterium sp. β-glucosintasa, que forma un β-1,4-glucósido con glucosa como aceptor, pero forma un β-1,3-glucósido con xilosa como aceptor.