En los campos de la histología , la patología y la biología celular , la fijación es la preservación de los tejidos biológicos de la descomposición debida a la autólisis o la putrefacción . Termina cualquier reacción bioquímica en curso y también puede aumentar la resistencia mecánica o la estabilidad de los tejidos tratados. La fijación de tejidos es un paso crítico en la preparación de secciones histológicas, su objetivo general es preservar las células y los componentes de los tejidos y hacerlo de tal manera que permita la preparación de secciones delgadas y teñidas. Esto permite la investigación de la estructura de los tejidos, que está determinada por las formas y tamaños de macromoléculas (dentro y alrededor de las células) como las proteínas y los ácidos nucleicos .
Al realizar su función protectora, los fijadores desnaturalizan las proteínas por coagulación, mediante la formación de compuestos aditivos o mediante una combinación de procesos de coagulación y aditivos. Un compuesto que se añade químicamente a las macromoléculas estabiliza la estructura de forma más eficaz si es capaz de combinarse con partes de dos macromoléculas diferentes, un efecto conocido como reticulación. La fijación de tejido se realiza por varias razones. Una de ellas es matar el tejido para evitar la descomposición post mortem (autólisis y putrefacción). [1] La fijación preserva el material biológico ( tejido o células ) lo más cerca posible de su estado natural en el proceso de preparación del tejido para su examen. Para lograrlo, normalmente se deben cumplir varias condiciones.
En primer lugar, un fijador suele actuar para desactivar las biomoléculas intrínsecas (en particular las enzimas proteolíticas ) que, de lo contrario, digieren o dañan la muestra.
En segundo lugar, un fijador normalmente protege una muestra de daños extrínsecos. Los fijadores son tóxicos para la mayoría de los microorganismos comunes ( bacterias en particular) que pueden existir en una muestra de tejido o que de otra manera podrían colonizar el tejido fijado. Además, muchos fijadores alteran químicamente el material fijado para hacerlo menos apetecible (ya sea indigerible o tóxico) para los microorganismos oportunistas.
Por último, los fijadores suelen alterar las células o los tejidos a nivel molecular para aumentar su resistencia mecánica o estabilidad. Esta mayor resistencia y rigidez puede ayudar a preservar la morfología (forma y estructura) de la muestra a medida que se procesa para su posterior análisis.
Incluso la fijación más cuidadosa altera la muestra e introduce artefactos que pueden interferir con la interpretación de la ultraestructura celular. Un ejemplo destacado es el mesosoma bacteriano , que se pensaba que era un orgánulo en bacterias grampositivas en la década de 1970, pero que luego se demostró mediante nuevas técnicas desarrolladas para la microscopía electrónica que era simplemente un artefacto de la fijación química. [2] [3] La estandarización de la fijación y otros procedimientos de procesamiento de tejidos tiene en cuenta esta introducción de artefactos, al establecer qué procedimientos introducen qué tipo de artefactos. Los investigadores que saben qué tipos de artefactos esperar con cada tipo de tejido y técnica de procesamiento pueden interpretar con precisión las secciones con artefactos o elegir técnicas que minimicen los artefactos en áreas de interés.
La fijación suele ser la primera etapa de un proceso de varios pasos para preparar una muestra de material biológico para su análisis microscópico u otro. Por lo tanto, la elección del fijador y del protocolo de fijación puede depender de los pasos de procesamiento adicionales y de los análisis finales que se planifiquen. Por ejemplo, la inmunohistoquímica utiliza anticuerpos que se unen a una proteína diana específica. La fijación prolongada puede enmascarar químicamente estos objetivos y evitar la unión de los anticuerpos. En estos casos, se suele utilizar un método de "fijación rápida" que utiliza formalina fría durante unas 24 horas. También se puede utilizar metanol (100 %) para una fijación rápida, y ese tiempo puede variar según el material biológico. Por ejemplo, las células de cáncer de mama humano MDA-MB 231 se pueden fijar durante solo 3 minutos con metanol frío (-20 °C). Para los estudios de localización de enzimas, los tejidos deben fijarse previamente de forma ligera o bien fijarse posteriormente una vez que se haya formado el producto de la actividad enzimática.
Generalmente existen tres tipos de procesos de fijación dependiendo de la muestra que se necesite fijar.
La fijación por calor se utiliza para la fijación de organismos unicelulares, más comúnmente bacterias y arqueas . Los organismos se mezclan típicamente con agua o solución salina fisiológica que ayuda a distribuir uniformemente la muestra. Una vez diluida, la muestra se extiende sobre un portaobjetos de microscopio . Esta muestra de bacterias diluida se conoce comúnmente como frotis después de colocarse en un portaobjetos. Después de que un frotis se haya secado a temperatura ambiente, el portaobjetos se agarra con pinzas o una pinza de ropa y se pasa por la llama de un mechero Bunsen varias veces para matar por calor y adherir el organismo al portaobjetos. También se puede utilizar un dispositivo de microincineración . Después del calentamiento, las muestras generalmente se tiñen y luego se toman imágenes con un microscopio. [4] La fijación por calor generalmente preserva la morfología general, pero no las estructuras internas. El calor desnaturaliza la enzima proteolítica y previene la autólisis. La fijación por calor no se puede utilizar en el método de tinción capsular, ya que la fijación por calor encogerá o destruirá la cápsula ( glicocáliz ) y no se puede ver en las tinciones. [5]
La inmersión se puede utilizar para fijar muestras histológicas, desde una sola célula hasta un organismo entero. La muestra de tejido se sumerge en una solución fijadora durante un período de tiempo determinado. La solución fijadora debe tener un volumen al menos 10 veces mayor que el volumen del tejido. [6] Para que la fijación sea exitosa, el fijador debe difundirse por todo el tejido, por lo que se debe considerar el tamaño y la densidad del tejido, así como el tipo de fijador. Esta es una técnica común para aplicaciones celulares, pero también se puede utilizar para tejidos más grandes. El uso de una muestra más grande significa que debe sumergirse durante más tiempo para que el fijador llegue al tejido más profundo. [7]
La perfusión es el paso de líquido a través de los vasos sanguíneos o canales naturales de un órgano u organismo. En la fijación de tejido mediante perfusión, el fijador se bombea al sistema circulatorio, generalmente a través de una aguja insertada en el ventrículo izquierdo . Esto se puede hacer mediante guía ecográfica o abriendo la cavidad torácica del sujeto. [8] El fijador se inyecta en el corazón con un volumen de inyección que coincide con el gasto cardíaco típico. Utilizando el sistema circulatorio innato, el fijador se distribuye por todo el cuerpo y el tejido no muere hasta que se fija. Cuando se utiliza este método, también se debe agregar un puerto de drenaje en algún lugar del sistema circulatorio para tener en cuenta la adición del volumen del fijador y el tampón, esto generalmente se hace en la aurícula derecha . El fijador se bombea al sistema circulatorio hasta que ha reemplazado toda la sangre. El uso de la perfusión tiene la ventaja de preservar la morfología, [9] pero las desventajas son que el sujeto muere y el volumen de fijador necesario para organismos más grandes es alto, lo que potencialmente aumenta los costos. Es posible disminuir el volumen de líquido necesario para realizar una fijación por perfusión cerrando las arterias que irrigan tejidos que no son de interés para la investigación en cuestión. La fijación por perfusión se utiliza habitualmente para obtener imágenes de tejidos cerebrales, pulmonares y renales en roedores, y también se utiliza para realizar autopsias en seres humanos. [7] [10]
En los procesos de fijación por inmersión y por perfusión se utilizan fijadores químicos para conservar las estructuras en un estado (tanto química como estructuralmente) lo más parecido posible al tejido vivo. Para ello se necesita un fijador químico.
Los fijadores de reticulación actúan creando enlaces químicos covalentes entre las proteínas del tejido. Esto ancla las proteínas solubles al citoesqueleto y le otorga rigidez adicional al tejido. La preservación de la estructura citoesquelética transitoria o fina, como las contracciones durante las ondas de diferenciación embrionaria, se logra mejor mediante un pretratamiento con microondas antes de la adición de un fijador de reticulación. [11] [12]
El fijador más comúnmente utilizado en histología es el formaldehído . Por lo general, se utiliza como formalina tamponada neutra al 10% (NBF), es decir, aproximadamente 3,7%–4,0% de formaldehído en tampón de fosfato, pH 7. Dado que el formaldehído es un gas a temperatura ambiente, se utiliza formalina (gas formaldehído disuelto en agua (~37% p/v)) para preparar el primer fijador. El formaldehído fija el tejido mediante la reticulación de las proteínas, principalmente los residuos del aminoácido básico lisina . Sus efectos son reversibles con el exceso de agua y evita la pigmentación con formalina. El paraformaldehído también se utiliza comúnmente y se despolimeriza de nuevo a formalina cuando se calienta, lo que también lo convierte en un fijador eficaz. Otros beneficios del paraformaldehído incluyen el almacenamiento a largo plazo y la buena penetración en los tejidos. Es particularmente bueno para las técnicas de inmunohistoquímica. El vapor de formaldehído también se puede utilizar como fijador para frotis celulares.
Otro aldehído popular para la fijación es el glutaraldehído . Funciona de manera similar al formaldehído, causando la deformación de las hélices α de las proteínas. Sin embargo, el glutaraldehído es una molécula más grande que el formaldehído, y por lo tanto penetra las membranas más lentamente. En consecuencia, la fijación de glutaraldehído en muestras de tejido más gruesas puede ser difícil; esto se puede solucionar reduciendo el tamaño de la muestra de tejido. Una de las ventajas de la fijación con glutaraldehído es que puede ofrecer un producto fijado más rígido o estrechamente unido: su mayor longitud y dos grupos aldehído le permiten "unir" y unir pares más distantes de moléculas de proteína. Provoca cambios rápidos e irreversibles, es muy adecuado para la microscopía electrónica, funciona bien a 4 °C y proporciona el mejor detalle citoplasmático y nuclear general. Sin embargo, no es ideal para la tinción inmunohistoquímica.
Algunos protocolos de fijación requieren una combinación de formaldehído y glutaraldehído para que sus respectivas concentraciones se complementen.
Estos fijadores de reticulación, especialmente el formaldehído, tienden a preservar la estructura secundaria de las proteínas y también pueden preservar la mayor parte de la estructura terciaria .
Los fijadores precipitantes (o desnaturalizantes ) actúan reduciendo la solubilidad de las moléculas de proteínas y, a menudo, alterando las interacciones hidrofóbicas que dan a muchas proteínas su estructura terciaria. La precipitación y agregación de proteínas es un proceso muy diferente de la reticulación que se produce con los fijadores de aldehído.
Los fijadores precipitantes más comunes son el etanol y el metanol . Se utilizan comúnmente para fijar cortes y frotis congelados. También se utiliza acetona y se ha demostrado que produce una mejor conservación histológica que los cortes congelados cuando se emplea en la técnica de acetona metilbenzoato xileno (AMEX).
El metanol, el etanol y la acetona, que desnaturalizan las proteínas, rara vez se utilizan solos para fijar bloqueos, a menos que se estudien ácidos nucleicos.
El ácido acético es un desnaturalizante que a veces se utiliza en combinación con otros fijadores precipitantes, como el AFA de Davidson. [13] Se sabe que los alcoholes, por sí solos, causan una contracción y endurecimiento considerables del tejido durante la fijación, mientras que el ácido acético solo se asocia con la hinchazón del tejido; la combinación de los dos puede dar como resultado una mejor preservación de la morfología del tejido .
Los fijadores oxidantes pueden reaccionar con las cadenas laterales de las proteínas y otras biomoléculas, lo que permite la formación de enlaces cruzados que estabilizan la estructura tisular. Sin embargo, provocan una desnaturalización importante a pesar de preservar la estructura celular fina y se utilizan principalmente como fijadores secundarios.
El tetróxido de osmio se utiliza a menudo como fijador secundario cuando se preparan muestras para microscopía electrónica . (No se utiliza para microscopía óptica, ya que penetra muy mal en secciones gruesas de tejido).
El dicromato de potasio , el ácido crómico y el permanganato de potasio se utilizan en ciertas preparaciones histológicas específicas.
Los mercuriales, como el B-5 y el fijador de Zenker, tienen un mecanismo desconocido que aumenta el brillo de la tinción y proporciona un excelente detalle nuclear. A pesar de ser rápidos, los mercuriales penetran poco y producen encogimiento del tejido. Su mejor aplicación es para la fijación de tejidos hematopoyéticos y reticuloendoteliales. Tenga en cuenta también que, dado que contienen mercurio, se debe tener cuidado con su eliminación.
Los picratos penetran bien en el tejido y reaccionan con las histonas y las proteínas básicas para formar picratos cristalinos con aminoácidos y precipitar todas las proteínas. Es un buen fijador para el tejido conectivo, conserva bien el glucógeno y extrae lípidos para dar resultados superiores al formaldehído en la inmunotinción de hormonas biógenas y polipeptídicas. Sin embargo, causa una pérdida de basófilos a menos que la muestra se lave completamente después de la fijación.
El efecto de protección de solventes orgánicos mediado por el tampón de ácido hepes-glutámico (HOPE) proporciona una morfología similar a la formalina, una excelente conservación de antígenos proteicos para inmunohistoquímica e histoquímica enzimática, buenos rendimientos de ARN y ADN y ausencia de proteínas reticuladas.