La cromatografía en columna quiral [1] [2] es una variante de la cromatografía en columna que se emplea para la separación de compuestos quirales, es decir, enantiómeros , en mezclas como racematos o compuestos relacionados. La fase estacionaria quiral (CSP) está formada por un soporte, generalmente a base de sílice, sobre el que se une o inmoviliza un reactivo quiral o una macromolécula con numerosos centros quirales. [3]
La fase estacionaria quiral se puede preparar uniendo un compuesto quiral a la superficie de un soporte aquiral como el gel de sílice . Por ejemplo, una clase de las fases estacionarias quirales más utilizadas tanto en cromatografía líquida como en cromatografía de fluidos supercríticos se basa en oligosacáridos [4] como la amilosa, la celulosa o la ciclodextrina (en particular con β-ciclodextrina, una molécula de siete anillos de azúcar) inmovilizada en gel de sílice.
El principio también se puede aplicar a la fabricación de columnas de HPLC monolíticas [5] o columnas de cromatografía de gases [6] o columnas de cromatografía de fluidos supercríticos [7] .
La fase estacionaria quiral, CSP, puede interactuar de forma diferente con dos enantiómeros, mediante un proceso conocido como reconocimiento quiral. El reconocimiento quiral depende de varias interacciones, como la unión de hidrógeno , la interacción π-π , el apilamiento dipolar , la formación de complejos de inclusión , la interacción estérica, hidrofóbica y electrostática , las interacciones de transferencia de carga , las interacciones iónicas, etc., entre el analito y la CSP, para formar complejos diastereoméricos transitorios in situ.
La mayoría de los tipos de fases estacionarias se pueden clasificar como tipo Pirkle (tipo cepillo), [8] [9] basadas en proteínas, [10] basadas en ciclodextrinas, [11] carbohidratos basados en polímeros (CSP basados en polisacáridos), [12] antibióticos macrocíclicos, [13] éteres corona quirales, [14] polímeros impresos, [15] etc.
Las fases estacionarias quirales de tipo cepillo o tipo Pirkle [16] [17] también se denominan columnas de donante-aceptor π-π. Según algunos modelos teóricos, la separación en estas CSP se basa en una unión de tres puntos entre el soluto y el ligando quiral unido en la superficie de la fase estacionaria. Estas interacciones pueden ser de naturaleza atractiva o repulsiva, dependiendo de las propiedades mutuas. Las columnas Pirkle discriminan los enantiómeros mediante la unión de un enantiómero con la fase estacionaria quiral, formando así un complejo diastereomérico a través de enlaces π-π, enlaces de hidrógeno, interacciones estéricas y/o apilamiento dipolar. Las CSP de Pirkle se pueden clasificar en tres clases: [18]
(i) π- aceptor de electrones
(ii) π- donante de electrones
(iii) donante de electrones π-aceptor de electrones π.
Una fase estacionaria quiral basada en proteínas se basa en gel de sílice, sobre el cual se inmoviliza o une una proteína. [19] La proteína se basa en muchos centros quirales, por lo tanto, el mecanismo de interacción quiral entre la proteína y los analitos involucra muchas interacciones, como interacciones hidrofóbicas y electrostáticas, enlaces de hidrógeno e interacciones de transferencia de carga, que pueden contribuir al reconocimiento quiral. Las interacciones hidrofóbicas entre la proteína y el analito se ven afectadas por el porcentaje de materia orgánica en la fase móvil. A medida que aumenta el contenido orgánico, disminuye la retención en columnas basadas en proteínas.
Los polisacáridos naturales forman la base de un grupo importante de columnas diseñadas para la separación quiral. Los principales polisacáridos son celulosa , amilosa , quitosano , dextrano , xilano , curdlano e inulina . [20] La fase estacionaria basada en polisacáridos tiene una alta capacidad de carga, muchos centros quirales y una estereoquímica complicada, y se puede utilizar para la separación de una amplia gama de compuestos.
Las fases estacionarias quirales basadas en polisacáridos tienen una amplia aplicación debido a su alta eficiencia de separación, selectividad, sensibilidad y reproducibilidad en condiciones normales y de fase inversa, así como a su amplia aplicabilidad para compuestos estructuralmente diversificados. [21] El mecanismo de interacción quiral en la fase estacionaria quiral basada en polisacáridos aún no se ha dilucidado. Sin embargo, se cree que las siguientes interacciones desempeñan un papel en la retención: [22]
(i) Interacciones de enlaces de hidrógeno del analito quiral polar con grupos carbamato en el CSP;
(ii) interacciones π-π entre grupos fenilo en el CSP y grupos aromáticos del soluto;
(i) Interacciones dipolo-dipolo
(ii) Interacciones estéricas debido a la estructura helicoidal del CSP.
Estos efectos sobre el proceso de retención se originan también de la funcionalidad de los derivados del polisacárido, su peso molecular promedio y distribución de tamaño, el solvente utilizado para inmovilizarlo en el soporte de sílice macroporoso y la naturaleza del propio soporte de sílice macroporoso.
La fase estacionaria quiral de la ciclodextrina (CD) se produce por degradación parcial del almidón por la enzima ciclodextrina glicosiltransferasa , seguida de acoplamiento enzimático de las unidades de glucosa , formando una estructura toroidal. Las CD son oligosacáridos cíclicos que constan de seis (α CD), siete (β CD) y ocho (γ CD) unidades de glucopiranosa . El mecanismo de reconocimiento quiral se basa en una especie de complexación de inclusión . La complexación implica la interacción de la porción hidrófoba de un enantiómero de analito con el interior no polar de la cavidad, mientras que los grupos funcionales polares pueden formar un enlace de hidrógeno con el espacio de la cavidad quiral hidroxilo polar. El factor más importante que determina si la molécula de analito encajará en la cavidad de la ciclodextrina es su tamaño. La α-CD consta de 30 centros estereoselectivos, la β-CD consta de 35 centros estereoselectivos y la γ-CD consta de 40 centros estereoselectivos. Cuando la porción hidrofóbica del analito es más grande o más pequeña que el tamaño de la cavidad del toroide, no se producirá inclusión.
Las fases estacionarias quirales macrocíclicas consisten en un soporte de sílice, sobre el cual se unen moléculas de antibióticos macrocíclicos. [13] Los antibióticos macrocíclicos comúnmente utilizados incluyen rifamicina , glicopéptidos (por ejemplo, avoparcina , teicoplanina , ristocetina A, vancomicina y sus análogos), el antibiótico polipeptídico tiostreptona y aminoglucósidos (por ejemplo, fradiomicina , kanamicina y estreptomicina ). Los antibióticos macrocíclicos interactúan con el analito a través de enlaces de hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo con los grupos polares del analito, interacciones iónicas e interacciones π-π.
Las fases estacionarias de corona quirales consisten en éteres corona, inmovilizados o unidos a las partículas de soporte, que son poliéteres con una estructura macrocíclica que pueden crear complejos anfitrión-huésped con iones de metales alcalinos , alcalinotérreos y cationes amonio . El esqueleto de la estructura cíclica está compuesto por grupos oxígeno y metileno dispuestos de forma alternada. Los oxígenos del éter donadores de electrones se colocan dentro de la pared interna de la cavidad de la corona y están rodeados por grupos metileno en una disposición similar a un collar. El reconocimiento quiral se basa en dos complejos de inclusión diastereoméricos distintos que se pueden generar. Las interacciones primarias que facilitan la complejación involucran enlaces de hidrógeno, formados entre los tres hidrógenos de amina y los oxígenos del éter macrocíclico, dispuestos en una configuración de trípode. Además, pueden ocurrir interacciones iónicas, interacciones dipolo-dipolo o enlaces de hidrógeno entre los grupos carbocíclicos y los grupos polares de los analitos, lo que proporciona un soporte adicional para los complejos.
El desarrollo de métodos de cromatografía quiral todavía se realiza mediante la selección de columnas de las diversas clases de columnas quirales. [23] Si bien los mecanismos de separación quiral son comprensibles en ciertos escenarios, y las características de retención de analitos dentro de las columnas cromatográficas ocasionalmente se pueden dilucidar, la combinación precisa de fases estacionarias quirales (CSP) y composiciones de fase móvil que se requieren para resolver eficazmente un par enantiomérico específico a menudo sigue siendo difícil de alcanzar.
La química de los ligandos de CSP influye significativamente en la creación de complejos diastereoméricos in situ sobre la superficie de la fase estacionaria. Sin embargo, otras condiciones del método, como los disolventes de la fase móvil, su composición, los aditivos de la fase móvil y la temperatura de la columna pueden desempeñar papeles igualmente críticos. La resolución final de los enantiómeros es el resultado de la combinación de fuerzas intermoleculares, e incluso un cambio sutil en ellas puede determinar el éxito o el fracaso de la separación. Esta complejidad impide establecer protocolos de desarrollo de métodos de rutina que sean universalmente aplicables a una amplia gama de enantiómeros. De hecho, a veces el resultado de experimentos previos fallidos no proporciona ninguna pista para los pasos posteriores. Por lo tanto, en la práctica, un entorno de laboratorio de desarrollo de métodos quirales actúa como un protocolo de selección de alto rendimiento [24] , que consiste en realizar una selección sistemática de varios CSP mediante dispositivos avanzados de conmutación de columnas, probando de forma automática y sistemática varias combinaciones de fases móviles, empleando de forma eficaz una estrategia de prueba y error. [23]
Debido al mecanismo de retención altamente complejo de una fase estacionaria quiral debido al reconocimiento quiral, [17] cuyos principios no han sido descifrados, a menudo es difícil, si no imposible, predecir de antemano los pasos que se pueden aplicar con éxito a los enantiómeros en cuestión como parte del desarrollo del método. Es por eso que el enfoque estándar en el desarrollo del método es la selección de alto rendimiento, para evaluar o examinar una serie de fases estacionarias, utilizando varias combinaciones de fases móviles, para aumentar la posibilidad de encontrar una condición de separación adecuada. [23]
Este artículo incorpora texto de Celina Nazareth y Sanelly Pereira disponible bajo la licencia CC BY 4.0.