El experimento de evolución a largo plazo de E. coli ( LTEE ) es un estudio en curso sobre la evolución experimental iniciado por Richard Lenski en la Universidad de California, Irvine , llevado a cabo por Lenski y sus colegas en la Universidad Estatal de Michigan , [2] y actualmente supervisado por Jeffrey E. Barrick en la Universidad de Texas en Austin . [3] Ha estado rastreando cambios genéticos en 12 poblaciones inicialmente idénticas de bacterias asexuales Escherichia coli desde el 24 de febrero de 1988. [4] Lenski realizó la transferencia número 10.000 del experimento el 13 de marzo de 2017. [5] Las poblaciones alcanzaron más de 73.000 generaciones a principios de 2020, poco antes de quedar congelado debido a la pandemia de COVID-19. [6] En septiembre de 2020, se reanudó el experimento LTEE utilizando las existencias congeladas. [7]
A lo largo del experimento, Lenski y sus colegas informaron de una amplia gama de cambios fenotípicos y genotípicos en las poblaciones en evolución. Estos han incluido cambios que han ocurrido en las 12 poblaciones y otros que solo han aparecido en una o unas pocas poblaciones. Por ejemplo, las 12 poblaciones mostraron un patrón similar de rápida mejora en la aptitud física que se desaceleró con el tiempo, tasas de crecimiento más rápidas y un mayor tamaño de las células. La mitad de las poblaciones han desarrollado defectos en la reparación del ADN que han causado fenotipos mutadores marcados por tasas de mutación elevadas. La adaptación más sorprendente reportada hasta ahora es la evolución del crecimiento aeróbico en citrato , que es inusual en E. coli , en una población en algún momento entre las generaciones 31.000 y 31.500. [8] [9]
El 4 de mayo de 2020, Lenski anunció una renovación por cinco años de la subvención a través del Programa de Investigación a Largo Plazo en Biología Ambiental (LTREB) de la Fundación Nacional de Ciencias que apoya el LTEE. También anunció que el Dr. Jeffrey E. Barrick, profesor asociado de Biociencias Moleculares en la Universidad de Texas en Austin, se haría cargo de la supervisión del experimento dentro del período de financiación de cinco años. [10] El tiempo del experimento en la Universidad Estatal de Michigan terminó en mayo de 2022, cuando las poblaciones alcanzaron las 75.000 generaciones, y el experimento fue transferido al laboratorio de Barrick. [11] [ verificación fallida ] El experimento fue revivido y reiniciado en el laboratorio de Barrick el 21 de junio de 2022. [3]
El experimento de evolución a largo plazo fue diseñado como un medio abierto de examen empírico de las características centrales de la evolución . El experimento se inició con tres objetivos principales:
A medida que el experimento ha continuado, su alcance ha crecido a medida que han surgido nuevas preguntas en biología evolutiva que se pueden utilizar para abordar, a medida que la evolución de las poblaciones ha presentado nuevos fenómenos para estudiar y a medida que la tecnología y las técnicas metodológicas han avanzado. [13]
El uso de E. coli como organismo experimental ha permitido estudiar muchas generaciones y grandes poblaciones en un período de tiempo relativamente corto. Además, debido al uso prolongado de E. coli como organismo modelo principal en biología molecular , se disponía de una amplia gama de herramientas, protocolos y procedimientos para estudiar cambios a nivel genético, fenotípico y fisiológico. [14] Las bacterias también se pueden congelar y conservar sin dejar de ser viables. Esto ha permitido la creación de lo que Lenski describe como un "registro fósil congelado" de muestras de poblaciones en evolución que pueden revivir en cualquier momento. Este registro fósil congelado permite reiniciar las poblaciones en casos de contaminación u otra interrupción en el experimento, y permite aislar y comparar ejemplares vivos de clones ancestrales y evolucionados. Lenski eligió una cepa de E. coli que se reproduce sólo asexualmente , carece de plásmidos que podrían permitir la conjugación bacteriana y no tiene profago viable . Como consecuencia, la evolución en el experimento se produce sólo mediante los procesos evolutivos centrales de mutación , deriva genética y selección natural . Esta asexualidad estricta también significa que los marcadores genéticos persisten en linajes y clados por descendencia común , pero no pueden propagarse de otra manera en las poblaciones. [12]
Lenski optó por llevar a cabo el experimento con las bacterias cultivadas en un medio limitado en glucosa llamado DM25, [15] que se basa en un medio mínimo desarrollado por Bernard Davis para su uso en el aislamiento de mutantes auxotróficos de E. coli utilizando penicilina como agente selectivo. . [16] [17] Para producir DM25, el medio mínimo se complementa con una concentración baja (25 mg/L) de glucosa. [15] Lenski eligió esta concentración para simplificar el análisis de la evolución de las poblaciones al reducir la interferencia clonal , en la que múltiples versiones de alelos compiten en una población en evolución, al tiempo que reduce la posibilidad de la evolución de interacciones ecológicas. [12] Esta concentración de glucosa utilizada soporta una población máxima de 500 millones de células del ancestro en un cultivo de 10 ml, aunque el máximo ahora varía entre las poblaciones evolucionadas. [16] DM25 también contiene una gran cantidad de citrato (aproximadamente 11 veces la concentración de glucosa), que Davis incluyó originalmente porque mejoraba la eficacia letal de la penicilina durante sus experimentos, aunque ahora se sabe que ayuda en E. coli. ' s adquisición de hierro del medio. [16] [18]
Las 12 poblaciones se mantienen en una incubadora a 37 °C (99 °F) en el laboratorio de Lenski en la Universidad Estatal de Michigan . Cada día, se transfiere el 1% de cada población a un matraz de medio de crecimiento DM25 fresco. La dilución significa que cada población experimenta 6,64 generaciones, o duplicaciones, cada día. Se congelan muestras grandes y representativas de cada población con glicerol como crioprotector en intervalos de 500 generaciones (75 días). Las bacterias de estas muestras siguen siendo viables y pueden revivir en cualquier momento. Esta colección de muestras se conoce como "registro fósil congelado" y proporciona una historia de la evolución de cada población a lo largo de todo el experimento. Las poblaciones también se examinan periódicamente para detectar cambios en la aptitud media y se realizan periódicamente experimentos complementarios para estudiar desarrollos interesantes en las poblaciones. [19] Hasta abril de 2016 [actualizar], las poblaciones de E. coli han estado bajo estudio durante más de 64 500 generaciones y se cree que han sufrido suficientes mutaciones espontáneas como para que cada posible mutación puntual en el genoma de E. coli haya ocurrido varias veces. [8]
La cepa de E. coli que Lenski eligió utilizar en el experimento de evolución a largo plazo se derivó de la "cepa B", como se describe en un artículo de 1966 de Seymour Lederberg (que identificó incorrectamente la cepa como "Bc251", aunque análisis genéticos posteriores encontraron "B" en su lugar), a través de Bruce Levin, quien lo había usado en un experimento de ecología bacteriana en 1972. Los rasgos genéticos definitorios de esta cepa fueron: T6 r , Str r , r − m − , Ara − (incapaz de crecer en arabinosa ). [4] Lenski designó la cepa fundadora original como REL606. Antes de comenzar el experimento, Lenski aisló una variante Ara + de la cepa en la que una mutación puntual en el operón ara había restablecido el crecimiento de la arabinosa, a la que denominó cepa REL607. Al comenzar el experimento de evolución a largo plazo, Lenski fundó seis poblaciones con seis colonias Ara individuales de REL606. Estas poblaciones se denominan Ara-1 a Ara-6. Lenski también fundó seis poblaciones más de seis colonias individuales Ara + de REL607. Estas se conocen como poblaciones Ara+1 a Ara+6. Las diferencias de marcadores permiten diferenciar las cepas en placas de Tetrazolium Arabinosa, en las que las colonias Ara - aparecen rojas, mientras que las colonias Ara + aparecen de color blanco a rosa. A lo largo del experimento, cada población ha acumulado una gran cantidad de mutaciones distintas, lo que permite medios adicionales para identificar cepas según su población de origen. [ cita necesaria ]
Gran parte del análisis del experimento se ha centrado en cómo ha cambiado la aptitud de las poblaciones en relación con su cepa ancestral. Todas las poblaciones mostraron un patrón de rápido aumento en la aptitud relativa durante las primeras generaciones, y este aumento se desaceleró con el tiempo. Al cabo de 20.000 generaciones, las poblaciones crecieron aproximadamente un 70% más rápido que la cepa ancestral. [12] Este aumento y desaceleración del aumento ha continuado en las generaciones posteriores. Un estudio de 2013 realizado por Wiser et al. informó una mejora continua en 50.000 generaciones en relación con muestras aisladas en 40.000 generaciones. Descubrieron que el aumento de aptitud se ajustaba a un modelo de ley potencial mucho mejor que los modelos hiperbólicos que se habían utilizado anteriormente. Como un modelo de ley de potencia describe un aumento cada vez más lento que no tiene límite superior, mientras que un modelo hiperbólico implica un límite estricto, el trabajo sugirió que el aumento continuaría sin límites a medida que se fijaran mutaciones de beneficios progresivamente más bajas en las poblaciones. [21] Otros trabajos publicados en 2015 informaron los resultados de más de 1100 nuevos ensayos de aptitud física que examinaron los cambios de aptitud física a lo largo de 60 000 generaciones. Una vez más, los datos se ajustan al modelo de ley de potencias propuesto y, de hecho, se ajustan a las predicciones del modelo a partir de datos anteriores. Estos resultados sugieren que, contrariamente a lo que se pensaba anteriormente, la adaptación y la divergencia adaptativa pueden potencialmente aumentar indefinidamente, incluso en un entorno constante. [22] [23] [24]
De las 12 poblaciones, hasta ahora se ha informado que seis han desarrollado defectos en su capacidad para reparar el ADN , lo que aumenta considerablemente la tasa de mutación en esas cepas. [9] [25] [26] Aunque se cree que las bacterias de cada población generaron cientos de millones de mutaciones durante las primeras 20.000 generaciones, Lenski ha estimado que dentro de este período de tiempo, sólo de 10 a 20 mutaciones beneficiosas lograron la fijación en cada población, con menos de 100 mutaciones puntuales en total (incluidas las mutaciones neutras ) que alcanzan la fijación en cada población. [12] En 2009, Barrick et al. informaron los resultados de secuencias del genoma de múltiples puntos temporales en la población Ara-1. Descubrieron que, a diferencia de la tasa decreciente de mejora de la aptitud física, la acumulación de mutaciones era lineal y parecida a un reloj, aunque varias líneas de evidencia sugerían que gran parte de la acumulación era beneficiosa, en lugar de neutral. [27]
Las doce poblaciones experimentales muestran un aumento en el tamaño de las células al mismo tiempo que una disminución en la densidad de población máxima y, en muchas de las poblaciones, una forma de células más redondeada. [28] Este cambio fue en parte el resultado de una mutación que cambió la expresión de un gen para una proteína de unión a penicilina , lo que permitió a las bacterias mutantes superar a las bacterias ancestrales en las condiciones del experimento de evolución a largo plazo. Sin embargo, aunque esta mutación aumentó la aptitud en estas condiciones, también aumentó la sensibilidad de las bacterias al estrés osmótico y disminuyó su capacidad para sobrevivir largos períodos en cultivos en fase estacionaria. [28]
A lo largo del experimento, las poblaciones han evolucionado para especializarse en el recurso de glucosa en el que crecen. Esto se describió por primera vez en 2000, cuando Cooper y Lenski demostraron que todas las poblaciones habían experimentado una decadencia de funciones metabólicas no utilizadas después de 20.000 generaciones, restringiendo la variedad de sustancias en las que las bacterias podían crecer. Su análisis sugirió que esta decadencia se debía a una pleiotropía antagónica , en la que las mutaciones que mejoraban la capacidad de crecer en glucosa habían reducido o eliminado la capacidad de crecer en otras sustancias. [29] Un estudio posterior de Leiby y Marx que utilizó técnicas más avanzadas mostró que gran parte de la descomposición que Cooper y Lenski habían identificado eran artefactos experimentales, que la pérdida de funciones no utilizadas no era tan extensa como se pensaba inicialmente y que algunas funciones no utilizadas habían mejorado. . Además, concluyeron que las pérdidas metabólicas no se debían a pleiotropía antagónica, sino a la acumulación neutra de mutaciones en porciones no utilizadas del genoma, lo que sugiere que la adaptación a un entorno simple no necesariamente conduciría a la especialización. [30]
Se identificaron dos variantes distintas, S y L, en la población denominada Ara-2 en 18.000 generaciones en función de su formación de colonias pequeñas y grandes, respectivamente. [31] Los clones de los tipos S y L podrían coexistir de manera estable en cocultivo entre sí, lo que indica que ocupaban nichos distintos en la población. Esto se verificó mediante el hallazgo de que el tipo L tenía una ventaja durante el crecimiento con glucosa, pero que el tipo S tenía una ventaja durante la fase estacionaria, después de que se había agotado la glucosa. Se descubrió que los dos tipos evolucionaron inicialmente antes de 6.000 generaciones y luego coexistieron a partir de entonces. [31] El análisis filogenético de clones de los dos tipos aislados de diferentes generaciones demostró que los tipos S y L pertenecían a linajes distintos y coexistentes en la población, y podrían estar experimentando una especiación incipiente. [32]
Normalmente , E. coli no puede crecer aeróbicamente en citrato debido a la incapacidad de expresar un transportador de citrato cuando hay oxígeno presente. [34] Sin embargo, E. coli tiene un ciclo completo del ácido cítrico y, por lo tanto, metaboliza el citrato como intermediario durante el crecimiento aeróbico de otras sustancias, incluida la glucosa. La mayoría de E. coli puede crecer anaeróbicamente en citrato mediante fermentación , si se dispone de un cosustrato como la glucosa para proporcionar poder reductor. [8] [34] [35] [36] El crecimiento anaeróbico es posible debido a la expresión de un gen antiportador transmembrana de citrato-succinato, citT , que se identificó por primera vez en 1998. Este gen está coregulado con otros genes implicados en fermentación de citrato que se encuentra en el operón cit , que se activa solo cuando falta oxígeno. [34] [37]
La incapacidad de crecer aeróbicamente en citrato, conocida como fenotipo Cit- , se considera una característica definitoria de E. coli como especie, y ha sido un medio valioso para diferenciar E. coli de Salmonella patógena . Aunque se han aislado cepas Cit + de E. coli de muestras ambientales y agrícolas, en todos los casos se descubrió que el rasgo se debe a la presencia de un plásmido que transporta un transportador de citrato extraño. [38] Hall informó sobre un único mutante Cit + espontáneo de E. coli en 1982. [39] Este mutante había sido aislado durante una selección prolongada para el crecimiento de otra sustancia nueva en un caldo de crecimiento que también contenía citrato. El análisis genético de Hall indicó que la mutación subyacente era compleja, pero finalmente no pudo identificar los cambios precisos o los genes involucrados, lo que lo llevó a plantear la hipótesis de la activación de un gen transportador críptico. [39] Las regiones del genoma a las que Hall pudo reducir las ubicaciones de los cambios no corresponden a la ubicación conocida del gen citT identificado 16 años después, ni las características fisiológicas en los ensayos de transporte de los mutantes Cit + de Hall coincidieron con aquellas. de esperarse para la expresión aeróbica del transportador CitT. [38] [40]
En 2008, el equipo de Lenski, dirigido por Zachary D. Blount , informó que la capacidad de crecer aeróbicamente con citrato había evolucionado en una población. Alrededor de la generación 33.127, se observó un aumento dramático de la turbidez en la población designada Ara-3. Descubrieron que la población contenía clones que podían crecer aeróbicamente en citrato (Cit + ). Esta capacidad metabólica permitió que la población creciera varias veces más que antes, debido a la gran cantidad de citrato presente en el medio. El examen de muestras fósiles congeladas de las poblaciones mostró que los clones de Cit + podían aislarse ya en 31.500 generaciones. Se descubrió que las variantes Cit + en la población poseen una serie de marcadores genéticos exclusivos de la población Ara-3; esta observación excluyó la posibilidad de que los clones fueran contaminantes, en lugar de mutantes espontáneos. En una serie de experimentos que "reprodujeron" la cinta de la evolución de Ara-3 de Cit - clones aislados de muestras congeladas en varios momentos de la historia de la población, demostraron que la capacidad de crecer aeróbicamente en citrato tenía más probabilidades de volver a evolucionar. en un subconjunto de clones evolucionados genéticamente puros. En estos experimentos, observaron 19 casos nuevos e independientes de reevolución Cit + , pero solo a partir de clones aislados después de la generación 20.000. Las pruebas de fluctuación mostraron que los clones de esta generación y posteriores mostraron una tasa de mutación en el rasgo Cit + que era significativamente mayor que la tasa ancestral. Incluso en estos clones posteriores, la tasa de mutación a Cit + fue del orden de una ocurrencia por billón de divisiones celulares. [8]
Lenski y sus colegas concluyeron que la evolución de la función Cit + en esta población surgió debido a una o más mutaciones "potenciadoras" anteriores, posiblemente no adaptativas, que aumentaron la tasa de mutación a un nivel accesible. Los datos sugirieron que el uso de citrato implicaba al menos dos mutaciones posteriores a estas mutaciones "potenciadoras". De manera más general, los autores sugieren que estos resultados indican, siguiendo el argumento de Stephen Jay Gould , "que la contingencia histórica puede tener un impacto profundo y duradero" en el curso de la evolución. [8] Estos hallazgos han llegado a ser considerados un ejemplo significativo del impacto de la contingencia histórica en la evolución. [16] [41] [42]
En 2012, Lenski y su equipo informaron los resultados de un análisis genómico del rasgo Cit + que arrojó luz sobre la base genética y la historia evolutiva del rasgo. Los investigadores habían secuenciado los genomas completos de veintinueve clones aislados de varios momentos de la historia de la población Ara-3. Utilizaron estas secuencias para reconstruir la historia filogenética de la población; esta reconstrucción mostró que la población se había diversificado en tres clados en 20.000 generaciones. Las variantes Cit + habían evolucionado en uno de ellos, al que llamaron Clado 3. Los clones que se habían encontrado potenciados en investigaciones anteriores se distribuyeron entre los tres clados, pero estaban sobrerrepresentados en el Clado 3. Esto llevó a los investigadores a concluir que había habido al menos dos mutaciones potenciadoras involucradas en la evolución de Cit + . [9]
Los investigadores también descubrieron que todos los clones de Cit + tenían mutaciones en las que se duplicaba o amplificaba un segmento de ADN de 2933 pares de bases. El segmento duplicado contenía el gen citT para la proteína transportadora de citrato utilizada en el crecimiento anaeróbico en citrato. La duplicación es en tándem y dio como resultado copias que estaban cabeza con cola entre sí. Esta nueva configuración colocó una copia del citT previamente silencioso y no expresado bajo el control del promotor del gen rnk adyacente , que dirige la expresión cuando hay oxígeno presente. Este nuevo módulo rnk-citT produjo un nuevo patrón regulador para citT , activando la expresión del transportador de citrato cuando había oxígeno presente y, por lo tanto, permitió el crecimiento aeróbico en citrato. [9]
Se demostró que el movimiento de este módulo rnk-citT al genoma de un clon Cit - potenciado es suficiente para producir un fenotipo Cit + . Sin embargo, el fenotipo Cit + inicial conferido por la duplicación fue muy débil y solo otorgó un beneficio de aptitud física de ~1%. Los investigadores descubrieron que era necesario aumentar el número de copias del módulo rnk-citT para fortalecer el rasgo Cit + lo suficiente como para permitir que las bacterias crezcan bien en el citrato. Otras mutaciones después de que la bacteria Cit + se volviera dominante en la población continuaron acumulando un mejor crecimiento en citrato. [ cita necesaria ]
Los investigadores concluyeron que la evolución del rasgo Cit + se produjo en tres fases distintas: (1) mutaciones acumuladas que aumentaron la tasa de mutación a Cit + , (2) el rasgo en sí apareció en una forma débil y (3) el rasgo fue mejorado por mutaciones posteriores. Blount y cols. sugirió que este patrón podría ser típico de cómo evolucionan los rasgos novedosos en general y propuso un modelo de innovación evolutiva de tres pasos:
Este modelo ha tenido aceptación en la biología evolutiva. En 2015, el paleontólogo Douglas Erwin sugirió una modificación de un modelo de cuatro pasos para reflejar mejor una posible distinción entre novedad evolutiva e innovación evolutiva, y para resaltar la importancia de las condiciones ambientales: potenciación, generación de fenotipos novedosos (actualización), refinamiento adaptativo y explotación (conversión de una novedad en innovación a medida que adquiere importancia para el establecimiento ecológico de los organismos poseedores). [44]
En 2014, un equipo de investigación dirigido por Eric Quandt en el laboratorio de Jeffrey Barrick en la Universidad de Texas en Austin describió la aplicación de una nueva técnica llamada Recombinación y Secuenciación Recursiva del Genoma (REGRES) para identificar mutaciones potenciadoras entre las 70 presentes en la Ara. -3 linaje que evolucionó a Cit + . [45] Este método utilizó múltiples rondas de un proceso en el que la conjugación basada en el plásmido F entre un clon Cit + de 33.000 generaciones , CZB154, y el clon fundador Cit- del LTEE para purgar mutaciones no necesarias para la manifestación de una forma débil o fuerte. del rasgo Cit + , este último denominado Cit ++ . Descubrieron que el módulo rnk-citT responsable del cambio fenotípico a Cit + era suficiente para producir un fenotipo Cit + débil en el ancestro. También identificaron una mutación que se había producido en el linaje que condujo a CZB154 después de la evolución inicial de Cit + que confirió un fenotipo fuerte de Cit ++ en el ancestro sin ninguna mutación excepto el módulo rnk-citT . Esta mutación, encontrada en la región reguladora de un gen llamado dctA , provocó un aumento masivo en la expresión del transportador DctA , cuya función es importar dicarboxilatos C 4 a la célula. Descubrieron que este aumento de la expresión de DctA permitía a las células Cit + recaptar el succinato , el malato y el fumarato liberados en el medio por el transportador CitT durante la importación de citrato. Identificaron una mutación similar en clones Cit ++ de la población Ara-3 que aumentaba la expresión de DctA al restaurar la función de un gen que lo regula, dcuS , que había sido desactivado en el clon ancestral. Quandt y cols. Concluyó que la mutación dctA no estaba involucrada en la potenciación, sino en el refinamiento. Esto los llevó a sugerir que la evolución de Cit + en la población Ara-3 podría haber estado supeditada a un trasfondo genético y una ecología específica de la población que permitió que las variantes tempranas y débiles de Cit + persistieran en la población el tiempo suficiente para que surgieran mutaciones de refinamiento. y hacer que el crecimiento del citrato sea lo suficientemente fuerte como para proporcionar un beneficio físico significativo. [ cita necesaria ]
Quandt y sus colegas publicaron posteriormente hallazgos que identificaban definitivamente una mutación que potenciaba la evolución de Cit + . [46] Esta mutación se produjo en el gen gltA , que codifica la citrato sintasa , una enzima implicada en el flujo de carbono hacia el ciclo del ácido cítrico . Tuvo el efecto de aumentar la actividad de la citrato sintasa y demostraron que permitía un mejor crecimiento en acetato . Además, con la mutación gltA , el módulo rnk-citT que causa el rasgo Cit + tiene un efecto de aptitud física de neutro a ligeramente beneficioso, mientras que, sin él, el módulo era fuertemente perjudicial. Por lo tanto, la mutación gltA parece haber permitido que las variantes tempranas y débiles de Cit + persistieran en la población hasta que pudieran ocurrir mutaciones de refinamiento posteriores, de acuerdo con sus conclusiones anteriores. Después de que evolucionó un fuerte fenotipo Cit ++ , el aumento de la actividad de la citrato sintasa se volvió perjudicial. Los investigadores descubrieron que mutaciones posteriores en gltA contrarrestaban la primera mutación, reduciendo la actividad de la citrato sintasa y mejorando aún más el crecimiento en citrato. Llegaron a la conclusión de que la serie de mutaciones en gltA primero potenció y luego refinó el crecimiento en citrato. También sugirieron que el linaje en el que surgió Cit + podría haber ocupado un nicho en Ara-3 basado en el crecimiento en acetato, y que las mutaciones potenciadoras que llevaron a la evolución de Cit + en Ara-3 fueron originalmente adaptativas para el uso de acetato. [ cita necesaria ]
Una pequeña subpoblación de células Cit - incapaces de crecer en citrato y pertenecientes a un clado separado persistió en la población después de que las células Cit + se volvieron dominantes. Los primeros hallazgos mostraron que esta diversidad se debía en parte a que las células Cit- crecían mejor con la glucosa del medio. [8] Turner y cols. Más tarde descubrió que otro factor detrás de la coexistencia era que las células Cit - desarrollaron la capacidad de alimentarse cruzadamente de la mayoría Cit + . Demostraron que las células Cit + liberan succinato , malato y fumarato durante el crecimiento en citrato, ya que el transportador CitT bombea estas sustancias fuera de la célula mientras bombea citrato al interior de la célula. Las células Cit- habían desarrollado rápidamente la capacidad de crecer en estas sustancias debido a una mutación que restauró la expresión de una proteína transportadora apropiada que estaba silenciosa en el antepasado. [47]
La subpoblación Cit finalmente se extinguió en la población entre 43.500 y 44.000 generaciones. Se demostró que esta extinción no se debió a que la mayoría Cit + evolucionó para poder invadir el nicho ocupado por la minoría Cit− . De hecho, los clones de Cit - podrían invadir las poblaciones de Cit + después del evento de extinción. Además, en un experimento en el que reiniciaron veinte réplicas de la población Ara-3 a partir de la muestra congelada 500 generaciones antes de la extinción, Turner et al. descubrió que la subpoblación Cit − no se había extinguido en ninguna de las réplicas después de 500 generaciones de evolución. Una de estas réplicas continuó durante 2.500 generaciones, durante las cuales Cit continuó coexistiendo. Los investigadores concluyeron que la extinción de Cit − se debió a alguna "rara perturbación ambiental" desconocida, similar a la que puede afectar a las poblaciones naturales. [48] La réplica final se integró en el experimento principal LTEE, convirtiéndose en la decimotercera población, Ara-7. [49]
Otros investigadores han experimentado con la evolución de E. coli aeróbica que utiliza citrato . Dustin Van Hofwegen et al. Pudieron aislar 46 mutantes independientes de E. coli que utilizan citrato en solo 12 a 100 generaciones utilizando una selección muy prolongada en condiciones de inanición, durante la cual las bacterias tomarían muestras de más mutaciones más rápidamente. [50] En su investigación, la secuenciación del ADN genómico reveló una amplificación de los loci citT y dctA , y el reordenamiento del ADN era la misma clase de mutaciones identificadas en el experimento de Richard Lenski y su equipo. Llegaron a la conclusión de que la rareza del mutante que utiliza citrato en la investigación de Lenski era probablemente el resultado de las condiciones experimentales selectivas utilizadas por su equipo, en lugar de ser un evento de especiación evolutiva único. [50]
John Roth y Sophie Maisnier-Patin revisaron los enfoques tanto en las mutaciones retardadas del equipo de Lenski como en las mutaciones rápidas del equipo de Van Hofwegen en E. coli . Argumentan que ambos equipos observaron la misma secuencia de potenciación, actualización y refinamiento que condujo a variantes Cit + similares . [51] Según ellos, el período de Lenski de menos de un día durante el cual el uso de citrato estaría bajo selección, seguido de una dilución 100 veces mayor y un período de crecimiento en glucosa que no seleccionaría el uso de citrato; En última instancia, redujo la probabilidad de que E. coli pudiera acumular mutaciones adaptativas tempranas de un período de selección al siguiente. [51] Por el contrario, el equipo de Van Hofwegen permitió un período de selección continua de 7 días, lo que produjo un desarrollo más rápido de E. coli que utiliza citrato . Roth y Maisnier-Patin sugieren que la dilución en serie de E. coli y el corto período de selección para el uso de citrato bajo las condiciones del LTEE impidieron perpetuamente que cada generación de E. coli alcanzara las siguientes etapas de utilización aeróbica del citrato. [51]
Lenski sostiene que el problema no está en los experimentos o los datos, sino en las interpretaciones hechas por Van Hofwegen et al. y Maisnier-Patin y Roth. [52] Según él, la rápida evolución de Cit + no fue necesariamente inesperada ya que su equipo también pudo producir múltiples mutantes de Cit + en unas pocas semanas durante los experimentos de repetición. [53] Sostiene que el LTEE no fue diseñado para aislar mutantes que utilizan citrato o para abordar la especiación, que es un proceso, no un evento. Además, argumentó que la evolución de Cit + en la LTEE estaba supeditada a mutaciones que se habían acumulado anteriormente. [53]
