El experimento Avery-MacLeod-McCarty fue una demostración experimental realizada por Oswald Avery , Colin MacLeod y Maclyn McCarty que, en 1944, informó que el ADN es la sustancia que causa la transformación bacteriana , en una época en la que se creía ampliamente que eran proteínas. que cumplía la función de transportar información genética (con la propia palabra proteína acuñada para indicar la creencia de que su función era primaria ). Fue la culminación de una investigación realizada en la década de 1930 y principios del siglo XX en el Instituto Rockefeller de Investigación Médica para purificar y caracterizar el "principio transformador" responsable del fenómeno de transformación descrito por primera vez en el experimento de Griffith de 1928: Streptococcus pneumoniae muerto del tipo cepa virulenta . III-S, cuando se inyectó junto con neumococos vivos pero no virulentos de tipo II-R, resultó en una infección mortal de neumococos de tipo III-S. En su artículo " Estudios sobre la naturaleza química de la sustancia que induce la transformación de tipos neumocócicos: inducción de transformación por una fracción de ácido desoxirribonucleico aislada de neumococo tipo III ", publicado en la edición de febrero de 1944 del Journal of Experimental Medicine , Avery y sus colegas sugieren que el ADN, en lugar de las proteínas como se creía ampliamente en ese momento, puede ser el material hereditario de las bacterias y podría ser análogo a genes y/o virus en organismos superiores. [1] [2]
Con el desarrollo de la tipificación serológica , los investigadores médicos pudieron clasificar las bacterias en diferentes cepas o tipos . Cuando una persona o un animal de prueba (p. ej., un ratón ) es inoculado con un tipo particular, se produce una respuesta inmune que genera anticuerpos que reaccionan específicamente con los antígenos de la bacteria. Luego se puede extraer el suero sanguíneo que contiene los anticuerpos y aplicarlo a bacterias cultivadas . Los anticuerpos reaccionarán con otras bacterias del mismo tipo que la inoculación original. Fred Neufeld , un bacteriólogo alemán, había descubierto los tipos neumocócicos y la tipificación serológica; Hasta los estudios de Frederick Griffith, los bacteriólogos creían que los tipos eran fijos e inmutables de una generación a la siguiente. [3]
El experimento de Griffith , publicado en 1928, [4] identificó que algún "principio transformador" en las bacterias neumocócicas podía transformarlas de un tipo a otro. Griffith, un médico británico, había pasado años aplicando tipificación serológica a casos de neumonía , una enfermedad frecuentemente mortal a principios del siglo XX. Descubrió que a lo largo de un caso clínico de neumonía a menudo estaban presentes múltiples tipos, algunos virulentos y otros no virulentos, y pensó que un tipo podría convertirse en otro (en lugar de simplemente estar presentes múltiples tipos todo el tiempo). Al probar esa posibilidad, descubrió que la transformación podría ocurrir cuando se inyectaban en ratones bacterias muertas de un tipo virulento y bacterias vivas de un tipo no virulento: los ratones desarrollarían una infección fatal (normalmente sólo causada por bacterias vivas de tipo virulento). tipo) y mueren, y se pueden aislar bacterias virulentas de dichos ratones infectados. [5]
Los hallazgos del experimento de Griffith pronto fueron confirmados, primero por Fred Neufeld [6] en el Instituto Koch y por Martin Henry Dawson en el Instituto Rockefeller. [7] Una serie de investigadores del Instituto Rockefeller continuaron estudiando la transformación en los años siguientes. Con Richard HP Sia, Dawson desarrolló un método para transformar bacterias in vitro (en lugar de in vivo como había hecho Griffith). [8] Después de la partida de Dawson en 1930, James Alloway emprendió el intento de ampliar los hallazgos de Griffith, lo que dio como resultado la extracción de soluciones acuosas del principio transformante en 1933. Colin MacLeod trabajó para purificar tales soluciones de 1934 a 1937, y el trabajo fue continuó en 1940 y fue completado por Maclyn McCarty. [9] [10]
El neumococo se caracteriza por colonias lisas que tienen una cápsula de polisacárido que induce la formación de anticuerpos ; los diferentes tipos se clasifican según su especificidad inmunológica. [1]
El procedimiento de purificación que llevó a cabo Avery consistió en matar primero las bacterias con calor y extraer los componentes solubles en solución salina . A continuación, la proteína se precipitó usando cloroformo y las cápsulas de polisacárido se hidrolizaron con una enzima . Se utilizó una precipitación inmunológica provocada por anticuerpos específicos de tipo para verificar la destrucción completa de las cápsulas. Luego, la porción activa se precipitó mediante fraccionamiento con alcohol , lo que dio como resultado hebras fibrosas que se pudieron eliminar con una varilla agitadora. [1]
El análisis químico mostró que las proporciones de carbono, hidrógeno, nitrógeno y fósforo en esta porción activa eran consistentes con la composición química del ADN. Para demostrar que era el ADN y no una pequeña cantidad de ARN , proteína o algún otro componente celular el responsable de la transformación, Avery y sus colegas utilizaron una serie de pruebas bioquímicas. Descubrieron que la tripsina , la quimotripsina y la ribonucleasa (enzimas que descomponen las proteínas o el ARN) no lo afectaban, pero una preparación enzimática de "desoxirribonucleodepolimerasa" (una preparación cruda, obtenible de varias fuentes animales, que podía descomponer el ADN) lo destruía. el poder transformador del extracto. [1]
El trabajo de seguimiento en respuesta a las críticas y desafíos incluyó la purificación y cristalización, por parte de Moses Kunitz en 1948, de una ADN despolimerasa ( desoxirribonucleasa I ), y el trabajo preciso de Rollin Hotchkiss que demostró que prácticamente todo el nitrógeno detectado en el ADN purificado procedía de glicina , un producto de degradación de la base nucleotídica adenina , y que la contaminación proteica no detectada fue como máximo del 0,02% según la estimación de Hotchkiss. [11] [12]
Los hallazgos experimentales del experimento de Avery-MacLeod-McCarty se confirmaron rápidamente y se ampliaron a otras características hereditarias además de las cápsulas de polisacárido. Sin embargo, hubo considerable renuencia a aceptar la conclusión de que el ADN era el material genético. Según la influyente " hipótesis del tetranucleótido " de Phoebus Levene , el ADN estaba formado por unidades repetidas de las cuatro bases de nucleótidos y tenía poca especificidad biológica. Por lo tanto, se pensaba que el ADN era el componente estructural de los cromosomas , mientras que se pensaba que los genes probablemente estaban formados por el componente proteico de los cromosomas. [13] [14] Esta línea de pensamiento fue reforzada por la cristalización en 1935 del virus del mosaico del tabaco por Wendell Stanley , [15] y los paralelos entre virus, genes y enzimas; muchos biólogos pensaban que los genes podrían ser una especie de "superenzima" y, según Stanley, se demostró que los virus eran proteínas y compartían la propiedad de la autocatálisis con muchas enzimas. [16] Además, pocos biólogos pensaron que la genética podría aplicarse a las bacterias, ya que carecían de cromosomas y reproducción sexual . En particular, muchos de los genetistas conocidos informalmente como el grupo de los fagos , que llegaría a ser influyente en la nueva disciplina de la biología molecular en la década de 1950, desdeñaban el ADN como material genético (y se inclinaban a evitar los enfoques bioquímicos "confusos" de Avery y sus colegas). Algunos biólogos, incluido Alfred Mirsky, miembro del Instituto Rockefeller , cuestionaron el hallazgo de Avery de que el principio transformador era ADN puro, sugiriendo que los contaminantes proteicos eran los responsables. [13] [14] Aunque la transformación se produjo en algunos tipos de bacterias, no pudo replicarse en otras bacterias (ni en ningún organismo superior), y su importancia parecía limitada principalmente a la medicina. [13] [17]
Los científicos que analizan retrospectivamente el experimento de Avery-MacLeod-McCarty no están de acuerdo sobre cuán influyente fue en los años cuarenta y principios de los cincuenta. Gunther Stent sugirió que fue ignorado en gran medida y sólo celebrado después, de manera similar al trabajo de Gregor Mendel décadas antes del surgimiento de la genética . Otros, como Joshua Lederberg y Leslie C. Dunn , dan fe de su importancia temprana y citan el experimento como el comienzo de la genética molecular . [18]
Algunos microbiólogos y genetistas se habían interesado por la naturaleza física y química de los genes antes de 1944, pero el experimento de Avery-MacLeod-McCarty suscitó un interés renovado y más amplio en el tema. Si bien la publicación original no mencionaba específicamente la genética, Avery, así como muchos de los genetistas que leyeron el artículo, estaban conscientes de las implicaciones genéticas: que Avery pudo haber aislado el gen mismo como ADN puro. El bioquímico Erwin Chargaff , el genetista HJ Muller y otros elogiaron el resultado por establecer la especificidad biológica del ADN y por tener importantes implicaciones para la genética si el ADN desempeñara un papel similar en los organismos superiores. En 1945, la Royal Society concedió a Avery la Medalla Copley , en parte por su trabajo sobre la transformación bacteriana. [19]
Entre 1944 y 1954, el artículo fue citado al menos 239 veces (con citas distribuidas uniformemente a lo largo de esos años), principalmente en artículos sobre microbiología, inmunoquímica y bioquímica. Además del trabajo de seguimiento realizado por McCarty y otros en el Instituto Rockefeller en respuesta a las críticas de Mirsky, el experimento impulsó un trabajo considerable en microbiología, donde arrojó nueva luz sobre las analogías entre la herencia bacteriana y la genética de los organismos que se reproducen sexualmente. [17] El microbiólogo francés André Boivin afirmó haber extendido los hallazgos de transformación bacteriana de Avery a Escherichia coli , [20] aunque esto no pudo ser confirmado por otros investigadores. [17] En 1946, sin embargo, Joshua Lederberg y Edward Tatum demostraron la conjugación bacteriana en E. coli y demostraron que la genética podía aplicarse a las bacterias, incluso si el método específico de transformación de Avery no era general. [21] El trabajo de Avery también motivó a Maurice Wilkins a continuar con los estudios cristalográficos de rayos X del ADN, incluso cuando enfrentó la presión de los financiadores para centrar su investigación en células completas, en lugar de biomoléculas. [17]
A pesar del importante número de citas del artículo y de las respuestas positivas que recibió en los años siguientes a su publicación, gran parte de la comunidad científica descuidó el trabajo de Avery. Aunque muchos científicos lo recibieron positivamente, el experimento no afectó seriamente la investigación genética convencional, en parte porque hizo poca diferencia para los experimentos de genética clásica en los que los genes se definían por su comportamiento en experimentos de reproducción en lugar de por su composición química. HJ Muller, aunque estaba interesado, se centró más en estudios físicos que químicos del gen, al igual que la mayoría de los miembros del grupo de los fagos . El trabajo de Avery también fue desatendido por la Fundación Nobel , que más tarde expresó públicamente su pesar por no haberle otorgado el Premio Nobel . [22]
En el momento del experimento Hershey-Chase de 1952 , los genetistas estaban más inclinados a considerar el ADN como el material genético, y Alfred Hershey era un miembro influyente del grupo de los fagos. [23] [24] Erwin Chargaff había demostrado que la composición de bases del ADN varía según la especie (contrariamente a la hipótesis del tetranucleótido), [25] y en 1952 Rollin Hotchkiss publicó su evidencia experimental que confirmaba el trabajo de Chargaff y demostraba la ausencia de proteína en El principio transformador de Avery. [26] Además, el campo de la genética bacteriana se estaba consolidando rápidamente y los biólogos estaban más inclinados a pensar en la herencia en los mismos términos para las bacterias y los organismos superiores. [23] [24] Después de que Hershey y Chase usaron isótopos radiactivos para demostrar que era principalmente ADN, en lugar de proteínas, lo que ingresaba a las bacterias tras la infección con bacteriófagos , [27] pronto se aceptó ampliamente que el ADN era el material. A pesar de los resultados experimentales mucho menos precisos (encontraron una cantidad no insignificante de proteína que ingresaba a las células además del ADN), el experimento de Hershey-Chase no estuvo sujeto al mismo grado de desafío. Su influencia se vio impulsada por la creciente red del grupo de los fagos y, al año siguiente, por la publicidad en torno a la estructura del ADN propuesta por Watson y Crick (Watson también era miembro del grupo de los fagos). Sin embargo, sólo en retrospectiva cualquiera de los experimentos demostró definitivamente que el ADN es el material genético. [23] [24]