una ARNt sintetasa que reconoce solo ese ARNt y solo el aminoácido no estándar.
La expansión del código genético es un área de investigación de la biología sintética , una disciplina biológica aplicada cuyo objetivo es diseñar sistemas vivos con fines útiles. La expansión del código genético enriquece el repertorio de herramientas útiles de que dispone la ciencia.
En mayo de 2019, los investigadores, en un esfuerzo histórico, informaron sobre la creación de una nueva forma sintética (posiblemente artificial ) de vida viable , una variante de la bacteria Escherichia coli , al reducir el número natural de 64 codones en el genoma bacteriano a 61 codones. (eliminando dos de los seis codones que codifican la serina y uno de los tres codones de parada ), de los cuales 59 solían codificar 20 aminoácidos . [2] [3]
Introducción
Es de destacar que el código genético de todos los organismos es básicamente el mismo, por lo que todos los seres vivos utilizan el mismo "lenguaje genético". [4] En general, la introducción de nuevos aminoácidos funcionales no naturales en proteínas de células vivas rompe la universalidad del lenguaje genético, que idealmente conduce a formas de vida alternativas. [5] Las proteínas se producen gracias al sistema de moléculas traduccionales, que decodifican los mensajes del ARN en una cadena de aminoácidos. La traducción de la información genética contenida en el ARN mensajero (ARNm) en una proteína está catalizada por los ribosomas . Los ARN de transferencia (ARNt) se utilizan como claves para decodificar el ARNm en su polipéptido codificado . El ARNt reconoce un codón específico de tres nucleótidos en el ARNm con una secuencia complementaria llamada anticodón en uno de sus bucles. Cada codón de tres nucleótidos se traduce en uno de los veinte aminoácidos naturales. [6] Hay al menos un ARNt para cualquier codón y, a veces, varios codones codifican el mismo aminoácido. Muchos ARNt son compatibles con varios codones. Una enzima llamada aminoacil tRNA sintetasa une covalentemente el aminoácido al tRNA apropiado. [7] La mayoría de las células tienen una sintetasa diferente para cada aminoácido (20 o más sintetasas). Por otro lado, algunas bacterias tienen menos de 20 aminoacil tRNA sintetasas e introducen los aminoácidos "faltantes" mediante la modificación de un aminoácido estructuralmente relacionado mediante una enzima aminotransferasa . [8] Una característica explotada en la expansión del código genético es el hecho de que la aminoacil tRNA sintetasa a menudo no reconoce el anticodón, sino otra parte del tRNA, lo que significa que si el anticodón fuera mutado, la codificación de ese aminoácido cambiaría a un nuevo codón. En el ribosoma, la información del ARNm se traduce en un aminoácido específico cuando el codón del ARNm coincide con el anticodón complementario de un ARNt y el aminoácido adjunto se agrega a una cadena polipeptídica en crecimiento. Cuando se libera del ribosoma, la cadena polipeptídica se pliega formando una proteína funcional. [7]
Para incorporar un nuevo aminoácido al código genético se requieren varios cambios. En primer lugar, para que la traducción de un nuevo aminoácido sea exitosa, el codón al que está asignado el nuevo aminoácido no puede codificar ya uno de los 20 aminoácidos naturales. Normalmente se utiliza un codón sin sentido ( codón de parada ) o un codón de cuatro bases. [6] En segundo lugar, se requiere un nuevo par de ARNt y aminoacil ARNt sintetasa, que se denomina conjunto ortogonal. El conjunto ortogonal no debe interferir con los conjuntos de ARNt y sintetasa endógenos, sin dejar de ser funcionalmente compatible con el ribosoma y otros componentes del aparato de traducción. El sitio activo de la sintetasa se modifica para aceptar sólo el nuevo aminoácido. Muy a menudo, se analiza una biblioteca de sintetasas mutantes en busca de una que cargue el ARNt con el aminoácido deseado. La sintetasa también se modifica para reconocer sólo el ARNt ortogonal. [6] El par de ARNt sintetasa a menudo se diseña en otras bacterias o células eucariotas. [9]
En esta área de investigación, los 20 aminoácidos proteinogénicos codificados se denominan aminoácidos estándar o, alternativamente, aminoácidos naturales o canónicos, mientras que los aminoácidos añadidos se denominan aminoácidos no estándar (NSAA) o aminoácidos no naturales ( uAA; término no utilizado en artículos que tratan sobre aminoácidos naturales no proteinógenos, como la fosfoserina , o aminoácidos no canónicos.
Aminoácidos no estándar
Tirosina y algunas variantes de tirosina sintética utilizadas para el etiquetado de proteínas. Se han sintetizado diferentes variantes de tirosina que pueden incorporarse a proteínas mediante un código genético ampliado. Todas las variantes que se muestran aquí se utilizan para enlaces químicos o fotoquímicos. Esto significa que el AA incorporado reacciona específicamente con un grupo químico particular (como hidrazidas, aminas, azidas o tioles) o puede activarse mediante UV para reticularse con otros AA.
El primer elemento del sistema es el aminoácido que se añade al código genético de una determinada cepa de organismo.
Se han añadido más de 71 NSAA diferentes a diferentes cepas de E. coli , levaduras o células de mamíferos. [10] Debido a detalles técnicos (síntesis química más fácil de los NSAA, menos interferencias y evolución más fácil de la aminoacil-tRNA sintasa), los NSAA son generalmente más grandes que los aminoácidos estándar y la mayoría de las veces tienen un núcleo de fenilalanina, pero con una gran variedad de aminoácidos diferentes. sustituyentes. Estos permiten un gran repertorio de nuevas funciones, como el etiquetado (ver figura), como indicador fluorescente ( por ejemplo, dansilalanina) [11] o para producir proteínas traduccionales en E. coli con modificaciones postraduccionales eucariotas ( por ejemplo, fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina). [10] [12]
El trabajo fundacional fue informado por Rolf Furter, quien utilizó por sí solo el par de ARNt Phe /PheRS de levadura para incorporar p-yodofenilalanina en E. coli . [13]
Los aminoácidos no naturales incorporados a las proteínas incluyen aminoácidos que contienen átomos pesados para facilitar ciertos estudios cristalográficos de rayos X; aminoácidos con nuevas propiedades estéricas/de empaquetadura y electrónicas; aminoácidos fotoentrecruzados que pueden usarse para investigar interacciones proteína-proteína in vitro o in vivo; aminoácidos que contienen ceto, acetileno, azida y boronato que pueden usarse para introducir selectivamente una gran cantidad de sondas biofísicas, etiquetas y nuevos grupos funcionales químicos en proteínas in vitro o in vivo ; aminoácidos activos redox para sondear y modular la transferencia de electrones; aminoácidos fotoenjaulados y fotoisomerizables para fotorregular procesos biológicos; aminoácidos de unión a metales para catálisis y detección de iones metálicos; aminoácidos que contienen cadenas laterales activas fluorescentes o infrarrojas para sondear la estructura y dinámica de las proteínas; α-hidroxiácidos y D -aminoácidos como sondas de conformación de la columna vertebral e interacciones de enlaces de hidrógeno; y aminoácidos sulfatados y miméticos de aminoácidos fosforilados como sondas de modificaciones postraduccionales. [14] [15] [16]
La disponibilidad del aminoácido no estándar requiere que el organismo lo importe del medio o lo biosintetice. En el primer caso, el aminoácido no natural se sintetiza químicamente en su forma L ópticamente pura . [17] Luego se agrega al medio de crecimiento de la célula. [10] Generalmente se prueba una biblioteca de compuestos para su uso en la incorporación del nuevo aminoácido, pero esto no siempre es necesario; por ejemplo, varios sistemas de transporte pueden manejar aminoácidos no naturales con cadenas laterales apolares. En el segundo caso, es necesario diseñar una vía biosintética, por ejemplo, una cepa de E. coli que biosintetice un nuevo aminoácido (p-aminofenilalanina) a partir de fuentes básicas de carbono y lo incluya en su código genético. [16] [18] [19] Otro ejemplo: la producción de fosfoserina, un metabolito natural, y en consecuencia requirió la alteración de su flujo de vía para aumentar su producción. [12]
asignación de codones
Otro elemento del sistema es un codón para asignar al nuevo aminoácido. [ cita necesaria ]
Un problema importante para la expansión del código genético es que no hay codones libres. El código genético tiene un diseño no aleatorio que muestra signos reveladores de varias fases de la evolución primordial; sin embargo, desde entonces se ha congelado en su lugar y se conserva casi universalmente. [20] Sin embargo, algunos codones son más raros que otros. De hecho, en E. coli (y en todos los organismos) el uso de codones no es igual, sino que presenta varios codones raros (ver tabla), siendo el más raro el codón de parada ámbar (UAG).
Supresión de codones ámbar
Normanly et al. se dieron cuenta de la posibilidad de reasignar codones . en 1990, cuando una cepa mutante viable de E. coli leyó el codón de parada UAG ("ámbar") . [22]
Esto fue posible gracias a la rareza de este codón y al hecho de que el factor de liberación 1 por sí solo hace que el codón ámbar termine la traducción. Más tarde, en el laboratorio de Schultz , se utilizó la tRNATyr/tirosil-tRNA sintetasa (TyrRS) de Methanococcus jannaschii , una arqueobacteria, [6] para introducir una tirosina en lugar de STOP, el valor predeterminado del codón ámbar. [23] Esto fue posible debido a las diferencias entre la síntesis bacteriana endógena y la arquea sintasa ortóloga, que no se reconocen entre sí. Posteriormente, el grupo desarrolló el par ortologonal de ARNt/sintasa para utilizar el aminoácido no estándar O -metiltirosina. [6] A esto le siguió la naftilalanina más grande [24] y la benzoilfenilalanina fotoentrecruzada, [25] que demostró la utilidad potencial del sistema.
El codón ámbar es el codón menos utilizado en Escherichia coli , pero secuestrarlo resulta en una pérdida sustancial de aptitud. De hecho, un estudio encontró que había al menos 83 péptidos afectados principalmente por la lectura completa [26]. Además, el etiquetado estaba incompleto. Como consecuencia, se han creado varias cepas para reducir el coste de aptitud física, incluida la eliminación de todos los codones ámbar del genoma. En la mayoría de las cepas de E. coli K-12 (es decir, Escherichia coli (biología molecular) para pedigríes de cepas) hay 314 codones de parada UAG. En consecuencia, se ha invertido una enorme cantidad de trabajo en reemplazarlos. Un enfoque iniciado por el grupo del Prof. George Church de Harvard se denominó MAGE en CAGE: se basaba en una transformación múltiple y la posterior recombinación de cepas para eliminar todos los codones UAG; la última parte presentó un punto de interrupción en un primer artículo [27 ] pero fue superado. Esto dio como resultado la cepa C321.ΔA de E. coli , que carece de todos los codones UAG y RF1. [28] Esto permitió realizar un experimento con esta cepa para hacerla "adicta" al aminoácido bifenilalanina mediante la evolución de varias enzimas clave para requerirlo estructuralmente, poniendo así su código genético expandido bajo selección positiva. [29]
Reasignación de codones de sentido raro
Además del codón ámbar, también se ha considerado el uso de codones de sentido raro. El codón AGG codifica la arginina, pero se ha modificado con éxito una cepa para que codifique la 6- N- aliloxicarbonil-lisina. [30]
Otro candidato es el codón AUA, que es inusual porque su respectivo ARNt tiene que diferenciarse del AUG que codifica metionina (primordialmente, isoleucina, de ahí su ubicación). Para ello, el ARNt de AUA tiene una base especial, la lisidina. La deleción de la sintasa ( tilS ) fue posible gracias a la sustitución del ARNt nativo por el de Mycoplasma mobile (sin lisidina). La aptitud reducida es un primer paso para presionar a la cepa para que pierda todas las instancias de AUA, lo que le permitirá usarse para la expansión del código genético. [31]
La cepa Syn61 de E. coli es una variante en la que todos los usos de los codones TCG (Ser), TCA (Ser) y TAG (STOP) se eliminan utilizando un genoma sintético (consulte § Genoma sintético recodificado a continuación). Al eliminar los genes de ARNt innecesarios y RF1, se produjo la cepa Syn61Δ3. Los tres codones liberados quedan disponibles para agregar tres residuos especiales, como se demuestra en la cepa "Syn61Δ3(ev4)". [32]
Cuatro codones de base (cuádruple)
Si bien los codones tripletes son la base del código genético en la naturaleza, el cambio de marco +1 programado es un proceso natural que permite el uso de una secuencia de cuatro nucleótidos (codón cuádruple) para codificar un aminoácido. [33] Los avances recientes en la ingeniería de códigos genéticos también mostraron que el codón cuádruple podría usarse para codificar aminoácidos no estándar en condiciones experimentales. [34] [35] [36] Esto permitió el uso simultáneo de dos aminoácidos no naturales, p -azidofenilalanina (pAzF) y N6-[(2-propiniloxi)carbonil]lisina (CAK), que se entrecruzan entre sí mediante Cicloadición de Huisgen . [37] La decodificación cuadruplicada en cepas de tipo salvaje no recodificadas es muy ineficiente. [37] Esto se debe al hecho de que la interacción entre los ARNt diseñados con complejos ternarios u otros componentes de traducción no es tan favorable y fuerte como con los elementos de traducción endógenos de las células. [38] Este problema se puede superar diseñando y desarrollando específicamente ARNt que pueda decodificar codones cuádruples en cepas no recodificadas. [39] De esta manera se pueden generar hasta 4 pares de tRNA/tRNA sintetasa ortogonales cuádruples diferentes. [40] El enfoque de decodificación de codones cuádruples también se ha aplicado a la construcción de una vacuna contra el VIH-1. [41]
par tRNA/sintetasa
Otro elemento clave es el par tRNA/sintetasa.
El conjunto ortólogo de sintetasa y ARNt se puede mutar y detectar mediante evolución dirigida para cargar el ARNt con un aminoácido diferente, incluso nuevo. Las mutaciones en el plásmido que contiene el par pueden introducirse mediante PCR propensa a errores o mediante cebadores degenerados para el sitio activo de la sintetasa. La selección implica múltiples rondas de un proceso de dos pasos, donde el plásmido se transfiere a células que expresan cloranfenicol acetil transferasa con un codón ámbar prematuro. En presencia de cloranfenicol tóxico y el aminoácido no natural, las células supervivientes habrán anulado el codón ámbar utilizando el ARNt ortogonal aminoacilado con los aminoácidos estándar o el no natural. Para eliminar el primero, el plásmido se inserta en células con un gen barnasa (tóxico) con un codón ámbar prematuro pero sin el aminoácido no natural, eliminando todas las síntesis ortogonales que no reconocen específicamente el aminoácido no natural. [6]
Además de la recodificación del ARNt en un codón diferente, se pueden mutar para reconocer un codón de cuatro bases, lo que permite opciones de codificación libre adicionales. [42]
Como resultado, el aminoácido no natural introduce diversas propiedades fisicoquímicas y biológicas para poder ser utilizado como herramienta para explorar la estructura y función de las proteínas o para crear proteínas nuevas o mejoradas con fines prácticos.
Se han desarrollado varios métodos para seleccionar la sintetasa que acepta sólo el aminoácido no natural. Uno de los cuales es mediante el uso de una combinación de selección positiva y negativa.
Conjuntos ortogonales en organismos modelo.
Los pares ortogonales de sintetasa y ARNt que funcionan para un organismo pueden no funcionar para otro, ya que la sintetasa puede aminoacilar erróneamente los ARNt endógenos o el propio ARNt puede ser aminoacilado erróneamente por una sintetasa endógena. Como resultado, los conjuntos creados hasta la fecha difieren entre organismos.
En 2017, se informó sobre un ratón diseñado con un código genético extendido que puede producir proteínas con aminoácidos no naturales. [56]
Ribosomas ortogonales
De manera similar a los ARNt ortogonales y las aminoacil ARNt sintetasas (aaRS), los ribosomas ortogonales se han diseñado para funcionar en paralelo a los ribosomas naturales. Lo ideal es que los ribosomas ortogonales utilicen transcripciones de ARNm diferentes a las de sus homólogos naturales y, en última instancia, también deberían recurrir a un grupo separado de ARNt. Esto debería aliviar parte de la pérdida de aptitud física que todavía surge actualmente de técnicas como la supresión de codones ámbar. Además, los ribosomas ortogonales se pueden mutar y optimizar para tareas particulares, como el reconocimiento de codones cuádruples. Una optimización de este tipo no es posible o es muy desventajosa para los ribosomas naturales.
o-ribosoma
En 2005, se publicaron tres conjuntos de ribosomas que no reconocían el ARNm natural, sino que traducían un conjunto separado de ARNm ortogonal (o-ARNm). [57] Esto se logró cambiando la secuencia de reconocimiento del ARNm, la secuencia Shine-Dalgarno , y la secuencia de reconocimiento correspondiente en el ARNr 16S de los ribosomas, la llamada secuencia Anti-Shine-Dalgarno. De esta manera, el emparejamiento de bases, que normalmente se pierde si se muta alguna de las secuencias, permanece disponible. Sin embargo, las mutaciones en el ARNr 16S no se limitaron a los nucleótidos obviamente emparejados de bases de la secuencia clásica Anti-Shine-Dalgarno.
Ribo-X
En 2007, el grupo de Jason W. Chin presentó un ribosoma ortogonal, que estaba optimizado para la supresión del codón ámbar. [58] El ARNr 16S fue mutado de tal manera que se unía al factor de liberación RF1 con menos fuerza que el ribosoma natural. Este ribosoma no eliminó el problema de la disminución de la aptitud celular causada por la supresión de los codones de parada en las proteínas naturales. Sin embargo, a través de la especificidad mejorada, aumentó significativamente el rendimiento de la proteína diana sintetizada correctamente (de ~20 % a >60 % para un codón ámbar que se suprimirá y de <1 % a >20 % para dos codones ámbar).
Ribo-Q
En 2010, el grupo de Jason W. Chin presentó una versión optimizada del ribosoma ortogonal. Ribo-Q es un ARNr 16S optimizado para reconocer ARNt, que tienen anticodones cuádruples para reconocer codones cuádruples, en lugar de los codones triples naturales. [37] Con este enfoque, el número de codones posibles aumenta de 64 a 256. Incluso teniendo en cuenta una variedad de codones de parada, más de 200 aminoácidos diferentes podrían codificarse de esta manera.
grapado de ribosomas
Todos los ribosomas ortogonales descritos anteriormente se centran en optimizar el ARNr 16S. Hasta ahora, este ARNr 16S optimizado se combinó con subunidades grandes naturales para formar ribosomas ortogonales. Si se quería optimizar también el ARNr 23S, el principal componente de ARN de la subunidad ribosomal grande, había que asegurarse de que no hubiera interferencias en el ensamblaje de los ribosomas ortogonales y naturales (ver figura X B). Para garantizar que el ARNr 23S optimizado solo se formara en ribosomas con el ARNr 16S optimizado, los dos ARNr se combinaron en una transcripción. [59] Al insertar la secuencia del ARNr 23S en una región de bucle de la secuencia del ARNr 16S, ambas subunidades aún adoptan pliegues funcionales. Dado que los dos ARNr están unidos y, por tanto, en constante proximidad, es preferible que se unan entre sí, no a otras subunidades ribosómicas flotantes libres. [ cita necesaria ]
Centro de peptidil transferasa diseñado
En 2014, se demostró que al alterar el centro de peptidil transferasa del ARNr 23S, se podían crear ribosomas que aprovechaban grupos ortogonales de ARNt. [60] El extremo 3' de los ARNt se conserva universalmente como CCA. Las dos bases de citidinas se emparejan con dos guaninas, el ARNr 23S, para unir el ARNt al ribosoma. Esta interacción es necesaria para la fidelidad traslacional. Sin embargo, al comutar los nucleótidos de unión de tal manera que aún puedan formar pares de bases, se puede conservar la fidelidad de la traducción. El extremo 3' del ARNt se muta de CCA a CGA, mientras que dos nucleótidos de citidina en los sitios A y P de los ribosomas se mutan a guanidina. Esto conduce a ribosomas que no aceptan los ARNt naturales como sustratos y a ARNt que los ribosomas naturales no pueden utilizar como sustrato. Para utilizar dichos ARNt de forma eficaz, tendrían que ser aminoacilados mediante aaRS ortogonales específicos. La mayoría de las aaRS de origen natural reconocen el extremo 3' de su ARNt correspondiente. [61] [62] Las aaRS para estos ARNt con mutación 3' aún no están disponibles. Hasta ahora, sólo se ha demostrado que este sistema funciona en un entorno de traducción in vitro donde la aminoacilación del ARNt ortogonal se logró utilizando las llamadas "flexizimas".Las flexizimas son ribozimas con actividad de aminoacilación de ARNt. [63]
Aplicaciones
Con un código genético ampliado, el aminoácido no natural puede dirigirse genéticamente a cualquier sitio elegido en la proteína de interés. La alta eficiencia y fidelidad de este proceso permite un mejor control de la colocación de la modificación en comparación con la modificación postraduccional de la proteína, que, en general, se dirigirá a todos los aminoácidos del mismo tipo, como el grupo tiol de la cisteína y el grupo amino de la lisina. [64] Además, un código genético ampliado permite que se lleven a cabo modificaciones in vivo . La capacidad de dirigir específicamente fracciones químicas sintetizadas en laboratorio a proteínas permite muchos tipos de estudios que de otro modo serían extremadamente difíciles, como por ejemplo:
Sondeo de la estructura y función de las proteínas: mediante el uso de aminoácidos con tamaños ligeramente diferentes, como O -metiltirosina o dansilalanina en lugar de tirosina, y mediante la inserción de restos informadores codificados genéticamente (que cambian de color y/o son activos por espín) en sitios proteicos seleccionados, se obtiene información química. Se pueden medir datos sobre la estructura y función de la proteína.
Explorar el papel de las modificaciones postraduccionales en la estructura y función de las proteínas: mediante el uso de aminoácidos que imitan las modificaciones postraduccionales, como la fosfoserina, se pueden obtener proteínas biológicamente activas y la naturaleza específica del sitio de la incorporación de aminoácidos puede conducir a información. sobre cómo la posición, densidad y distribución de la fosforilación de proteínas afectan la función de las proteínas. [65] [66] [67] [68]
Identificación y regulación de la actividad de las proteínas: mediante el uso de aminoácidos fotoenjaulados, la función de las proteínas se puede "activar" o desactivar iluminando el organismo.
Cambiar el modo de acción de una proteína: se puede comenzar con el gen de una proteína que se une a una determinada secuencia de ADN y, al insertar un aminoácido químicamente activo en el sitio de unión, convertirlo en una proteína que corta el ADN en lugar de atándolo.
Mejorar la inmunogenicidad y superar la autotolerancia: al reemplazar las tirosinas elegidas estratégicamente con p -nitrofenilalanina, una autoproteína tolerada puede volverse inmunogénica. [69]
Destrucción selectiva de componentes celulares seleccionados: utilizando un código genético expandido, se pueden incorporar restos químicos destructivos y no naturales (a veces llamados "ojivas químicas") en proteínas que se dirigen a componentes celulares específicos. [70]
Producir mejor proteína: la evolución de los bacteriófagos T7 en una cepa de E. coli no evolucionada que codificaba 3-yodotirosina en el codón ámbar, dio como resultado una población más apta que la de tipo salvaje gracias a la presencia de yodotirosina en su proteoma [71]
Sondeo de la localización de proteínas y la interacción proteína-proteína en bacterias. [72]
Futuro
La expansión del código genético está todavía en su infancia. La metodología actual utiliza sólo un aminoácido no estándar a la vez, aunque lo ideal sería utilizar varios. De hecho, el grupo de Jason Chin ha batido recientemente el récord de una cepa de E. coli genéticamente recodificada que puede incorporar simultáneamente hasta 4 aminoácidos no naturales. [73] Además, se ha desarrollado software que permite la combinación de ribosomas ortogonales y pares de tRNA/RS no naturales para mejorar el rendimiento y la fidelidad de las proteínas. [73]
Genoma sintético recodificado
Una forma de lograr la codificación de múltiples aminoácidos no naturales es sintetizando un genoma reescrito. [74] En 2010, a un costo de 40 millones de dólares, se construyó un organismo, Mycoplasma laboratorium , que estaba controlado por un genoma sintético, pero no recodificado. [75] El primer organismo genéticamente recodificado fue creado mediante una colaboración entre los laboratorios de George Church y Farren Isaacs, cuando la E. coli MG1655 de tipo salvaje fue recodificada de tal manera que los 321 codones de parada (UAG) conocidos fueron sustituidos por UAA sinónimos. Los codones y el factor de liberación 1 se eliminaron para eliminar la interacción con el codón de parada exógeno y mejorar la síntesis de proteínas no naturales. [28] En 2019, se creó Escherichia coli Syn61, con un genoma codificado de 4 megabases que consta de solo 61 codones en lugar de los 64 naturales. [3] [2]
Además de la eliminación del uso de codones raros, la especificidad de es necesario aumentar el sistema ya que muchos ARNt reconocen varios codones [74]
Alfabeto genético ampliado
Otro enfoque es ampliar el número de nucleobases para aumentar la capacidad de codificación.
Un par de bases no naturales (UBP) es una subunidad diseñada (o nucleobase ) de ADN que se crea en un laboratorio y no se encuentra en la naturaleza. El grupo de Ichiro Hirao en el instituto RIKEN de Japón logró una demostración in vitro de las UBP. En 2002, desarrollaron un par de bases no naturales entre 2-amino-8-(2-tienil)purina (s) y piridina-2-ona (y) que funciona in vitro en la transcripción y traducción para la incorporación específica de sitio de -aminoácidos estándar en proteínas. [76] En 2006, crearon 7-(2-tienil)imidazo[4,5-b]piridina (Ds) y pirrol-2-carbaldehído (Pa) como un tercer par de bases para la replicación y transcripción. [77] Posteriormente, se descubrió que Ds y 4-[3-(6-aminohexanamido)-1-propinil]-2-nitropirrol (Px) eran un par de alta fidelidad en la amplificación por PCR. [78] [79] En 2013, aplicaron el par Ds-Px a la generación de aptámeros de ADN mediante selección in vitro (SELEX) y demostraron que la expansión del alfabeto genético aumenta significativamente las afinidades de los aptámeros de ADN con las proteínas diana. [80]
En 2012, un grupo de científicos estadounidenses liderados por Floyd Romesberg, biólogo químico del Instituto de Investigación Scripps en San Diego, California, publicó que su equipo diseñó un par de bases no naturales (UBP). [81] Los dos nuevos nucleótidos artificiales o Par de Bases No Naturales (UBP) fueron denominados " d5SICS " y " dNaM ". Más técnicamente, estos nucleótidos artificiales que contienen nucleobases hidrofóbicas presentan dos anillos aromáticos fusionados que forman un complejo (d5SICS-dNaM) o par de bases en el ADN. [82] [83] En 2014, el mismo equipo del Instituto de Investigación Scripps informó que sintetizaron un tramo de ADN circular conocido como plásmido que contiene pares de bases naturales TA y CG junto con la UBP de mejor rendimiento que el laboratorio de Romesberg había diseñado e insertado. en células de la bacteria común E. coli que replicaron con éxito los pares de bases no naturales a lo largo de múltiples generaciones. [84] Este es el primer ejemplo conocido de un organismo vivo que transmite un código genético ampliado a las generaciones posteriores. [82] [85] Esto se logró en parte mediante la adición de un gen de alga de apoyo que expresa un transportador de nucleótido trifosfato que importa eficientemente los trifosfatos de d5SICSTP y dNaMTP a la bacteria E. coli . [82] Luego, las vías de replicación bacteriana natural las utilizan para replicar con precisión el plásmido que contiene d5SICS-dNaM.
La incorporación exitosa de un tercer par de bases en un microorganismo vivo es un avance significativo hacia el objetivo de ampliar en gran medida la cantidad de aminoácidos que pueden codificar el ADN, ampliando así el potencial de los organismos vivos para producir nuevas proteínas . [84] Las cadenas artificiales de ADN no codifican nada todavía, pero los científicos especulan que podrían diseñarse para fabricar nuevas proteínas que podrían tener usos industriales o farmacéuticos. [86]
En mayo de 2014, los investigadores anunciaron que habían introducido con éxito dos nuevos nucleótidos artificiales en el ADN bacteriano y, al incluir nucleótidos artificiales individuales en los medios de cultivo, pudieron inducir la amplificación de los plásmidos que contenían los nucleótidos artificiales en un factor de 2 x 10 7. (24 duplicaciones); no crearon ARNm ni proteínas capaces de utilizar los nucleótidos artificiales. [82] [87] [88] [89]
Métodos relacionados
Método de incorporación de presión selectiva (SPI) para la producción de aloproteínas.
Ha habido muchos estudios que han producido proteínas con aminoácidos no estándar, pero no alteran el código genético. Estas proteínas, llamadas aloproteínas , se elaboran incubando células con un aminoácido no natural en ausencia de un aminoácido codificado similar para que el primero se incorpore a la proteína en lugar del segundo, por ejemplo, el ácido L -2-aminohexanoico ( Ahx) para metionina (Met). [90]
Estos estudios se basan en la actividad promiscua natural de la aminoacil ARNt sintetasa para agregar a su ARNt objetivo un aminoácido no natural (es decir, un análogo) similar al sustrato natural, por ejemplo, la metionil-ARNt sintasa confunde isoleucina con metionina. [91] En cristalografía de proteínas, por ejemplo, la adición de selenometionina al medio de un cultivo de una cepa auxotrófica de metionina da como resultado proteínas que contienen selenometionina en lugar de metionina ( a saber, dispersión anómala de múltiples longitudes de onda por alguna razón). [92] Otro ejemplo es que se añaden fotoleucina y fotometionina en lugar de leucina y metionina para marcar de forma cruzada la proteína. [93]
De manera similar, algunos hongos tolerantes al telurio pueden incorporar telurocisteína y telurometionina en su proteína en lugar de cisteína y metionina. [94]
El objetivo de ampliar el código genético es más radical ya que no reemplaza un aminoácido, sino que agrega uno o más al código. Por otro lado, los reemplazos de todo el proteoma se realizan de manera más eficiente mediante sustituciones globales de aminoácidos. Por ejemplo, se han intentado sustituciones globales de aminoácidos naturales en todo el proteoma por análogos fluorados en E. coli [95] y B. subtilis . [96] Budisa y Söll informaron en 2015 de una sustitución completa de triptófano con tienopirrol-alanina en respuesta a 20899 codones UGG en E. coli . [97] Además, muchos fenómenos biológicos, como el plegamiento y la estabilidad de las proteínas, se basan en efectos sinérgicos en muchas posiciones de la secuencia de las proteínas. [98]
En este contexto, el método SPI genera variantes de proteínas recombinantes o aloproteínas directamente mediante la sustitución de aminoácidos naturales por homólogos no naturales. [99] Un huésped de expresión auxotrófica de aminoácidos se complementa con un análogo de aminoácido durante la expresión de la proteína diana. [100] Este enfoque evita los inconvenientes de los métodos basados en la supresión [101] y es superior en términos de eficiencia, reproducibilidad y una configuración experimental extremadamente simple. [102] Numerosos estudios demostraron cómo la sustitución global de aminoácidos canónicos con varios análogos isostéricos causó perturbaciones estructurales mínimas pero cambios dramáticos en las propiedades termodinámicas, [103] plegamiento, [104] agregación [105] espectrales [106] [107] y actividad enzimática. . [108]
in vitrosíntesis
La expansión del código genético descrita anteriormente es in vivo . Una alternativa es el cambio de codificación en experimentos de traducción in vitro . Esto requiere el agotamiento de todos los ARNt y la reintroducción selectiva de ciertos ARNt aminoacilados, algunos de ellos químicamente aminoacilados. [109]
Síntesis química
Existen varias técnicas para producir péptidos químicamente, generalmente es mediante química de protección en fase sólida. Esto significa que se puede añadir cualquier aminoácido (protegido) a la secuencia naciente. [ cita necesaria ]
En noviembre de 2017, un equipo del Instituto de Investigación Scripps informó haber construido un genoma de bacteria E. coli semisintético utilizando seis nucleótidos diferentes (frente a los cuatro que se encuentran en la naturaleza). Las dos 'letras' adicionales forman un tercer par de bases antinatural. Los organismos resultantes pudieron prosperar y sintetizar proteínas utilizando "aminoácidos no naturales". [110] [111] El par de bases no natural utilizado es dNaM –dTPT3. [111] Este par de bases no naturales se ha demostrado previamente, [112] [113] pero este es el primer informe de transcripción y traducción de proteínas utilizando un par de bases no naturales.
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