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Evolución dirigida

Un ejemplo de evolución dirigida en comparación con la evolución natural . El ciclo interior indica las 3 etapas del ciclo de evolución dirigida y el proceso natural se imita entre paréntesis. El círculo exterior muestra los pasos de un experimento típico. Los símbolos rojos indican variantes funcionales y los símbolos pálidos indican variantes con función reducida.

La evolución dirigida ( ED ) es un método utilizado en ingeniería de proteínas que imita el proceso de selección natural para dirigir proteínas o ácidos nucleicos hacia un objetivo definido por el usuario. [1] Consiste en someter un gen a rondas iterativas de mutagénesis (creando una biblioteca de variantes), selección (expresando esas variantes y aislando miembros con la función deseada) y amplificación (generando una plantilla para la siguiente ronda). Puede realizarse in vivo (en organismos vivos) o in vitro (en células o libre en solución). La evolución dirigida se utiliza tanto para la ingeniería de proteínas como una alternativa al diseño racional de proteínas modificadas, como para estudios de evolución experimental de principios evolutivos fundamentales en un entorno de laboratorio controlado.

Historia

La evolución dirigida tiene sus orígenes en la década de 1960 [2] con la evolución de las moléculas de ARN en el experimento del " Monstruo de Spiegelman ". [3] El concepto se extendió a la evolución de las proteínas mediante la evolución de bacterias bajo presiones de selección que favorecieron la evolución de un solo gen en su genoma. [4]

Las primeras técnicas de visualización de fagos en la década de 1980 permitieron la focalización de mutaciones y la selección de una sola proteína. [5] Esto permitió la selección de proteínas de unión mejoradas , pero aún no era compatible con la selección para la actividad catalítica de las enzimas . [6] Los métodos para desarrollar enzimas se desarrollaron en la década de 1990 y llevaron la técnica a una audiencia científica más amplia. [7] El campo se expandió rápidamente con nuevos métodos para hacer bibliotecas de variantes genéticas y para examinar su actividad. [2] [8] El desarrollo de métodos de evolución dirigida fue honrado en 2018 con la concesión del Premio Nobel de Química a Frances Arnold por la evolución de enzimas, y a George Smith y Gregory Winter por la visualización de fagos. [9]

Principios

La evolución dirigida es análoga a escalar una colina en un " paisaje de aptitud " donde la elevación representa la propiedad deseada. Cada ronda de selección toma muestras de mutantes en todos los lados de la plantilla inicial (1) y selecciona el mutante con la elevación más alta, subiendo así la colina. Esto se repite hasta que se alcanza una cima local (2).

La evolución dirigida es una imitación del ciclo evolutivo natural en un entorno de laboratorio. La evolución requiere que ocurran tres cosas: variación entre replicadores, que la variación cause diferencias de aptitud sobre las que actúe la selección y que esta variación sea hereditaria . En DE, un solo gen evoluciona mediante rondas iterativas de mutagénesis, selección o cribado y amplificación. [10] Las rondas de estos pasos suelen repetirse, utilizando la mejor variante de una ronda como plantilla para la siguiente para lograr mejoras graduales.

La probabilidad de éxito en un experimento de evolución dirigida está directamente relacionada con el tamaño total de la biblioteca, ya que evaluar más mutantes aumenta las posibilidades de encontrar uno con las propiedades deseadas. [11]

Generando variación

Gen de partida (izquierda) y biblioteca de variantes (derecha). Las mutaciones puntuales modifican nucleótidos individuales. Las inserciones y deleciones añaden o eliminan secciones de ADN. La recombinación recombina segmentos de dos (o más) genes similares.
Cómo las bibliotecas de ADN generadas por mutagénesis aleatoria muestran el espacio de secuencias. Se muestra el aminoácido sustituido en una posición determinada. Cada punto o conjunto de puntos conectados es un miembro de la biblioteca. La PCR propensa a errores muta aleatoriamente algunos residuos a otros aminoácidos. El escaneo de alanina reemplaza cada residuo de la proteína con alanina, uno por uno. La saturación del sitio sustituye cada uno de los 20 aminoácidos posibles (o algún subconjunto de ellos) en una sola posición, uno por uno.

El primer paso para llevar a cabo un ciclo de evolución dirigida es la generación de una biblioteca de genes variantes. El espacio de secuencias para secuencias aleatorias es vasto (10 130 secuencias posibles para una proteína de 100 aminoácidos ) y está extremadamente escasamente poblado por proteínas funcionales. Ni la evolución experimental [12] ni la natural [13] [ verificación fallida ] pueden jamás acercarse a muestrear tantas secuencias. Por supuesto, la evolución natural muestrea secuencias variantes cercanas a secuencias de proteínas funcionales y esto se imita en DE mutagenizando un gen ya funcional. Algunos cálculos sugieren que es completamente factible que para todos los propósitos prácticos (es decir, funcionales y estructurales), el espacio de secuencias de proteínas se haya explorado completamente durante el curso de la evolución de la vida en la Tierra. [13]

El gen de partida puede ser mutagenizado mediante mutaciones puntuales aleatorias (mediante mutágenos químicos o PCR propensa a errores ) [14] [15] e inserciones y deleciones (mediante transposones). [16] La recombinación génica puede ser imitada mediante la reorganización del ADN [17] [18] de varias secuencias (normalmente con más del 70% de identidad de secuencia) para saltar a regiones del espacio de secuencia entre los genes parentales reorganizados. Finalmente, regiones específicas de un gen pueden ser sistemáticamente aleatorizadas [19] para un enfoque más centrado basado en el conocimiento de la estructura y la función. Dependiendo del método, la biblioteca generada variará en la proporción de variantes funcionales que contiene. Incluso si se utiliza un organismo para expresar el gen de interés, al mutagenizar solo ese gen, el resto del genoma del organismo permanece igual y puede ignorarse para el experimento de evolución (en la medida de proporcionar un entorno genético constante).

Detección de diferencias de aptitud física

La mayoría de las mutaciones son perjudiciales, por lo que las bibliotecas de mutantes tienden a tener principalmente variantes con actividad reducida . [20] Por lo tanto, un ensayo de alto rendimiento es vital para medir la actividad y encontrar las variantes raras con mutaciones beneficiosas que mejoran las propiedades deseadas. Existen dos categorías principales de métodos para aislar variantes funcionales. Los sistemas de selección acoplan directamente la función de la proteína a la supervivencia del gen, mientras que los sistemas de cribado ensayan individualmente cada variante y permiten establecer un umbral cuantitativo para clasificar una variante o población de variantes de una actividad deseada. Tanto la selección como el cribado se pueden realizar en células vivas ( evolución in vivo ) o directamente en la proteína o el ARN sin ninguna célula ( evolución in vitro ). [21] [22]

Durante la evolución in vivo , cada célula (normalmente una bacteria o una levadura ) se transforma con un plásmido que contiene un miembro diferente de la biblioteca de variantes. De esta forma, solo el gen de interés difiere entre las células, y todos los demás genes se mantienen iguales. Las células expresan la proteína en su citoplasma o en su superficie , donde se puede probar su función. Este formato tiene la ventaja de seleccionar propiedades en un entorno celular, lo que resulta útil cuando la proteína o el ARN evolucionado se va a utilizar en organismos vivos. Cuando se realiza sin células, la DE implica el uso de la traducción de la transcripción in vitro para producir proteínas o ARN libres en solución o compartimentados en microgotas artificiales . Este método tiene la ventaja de ser más versátil en las condiciones de selección (p. ej., temperatura, disolvente) y puede expresar proteínas que serían tóxicas para las células. Además, los experimentos de evolución in vitro pueden generar bibliotecas mucho más grandes (hasta 10 15 ) porque el ADN de la biblioteca no necesita insertarse en las células (a menudo un paso limitante).

Selección

La selección de la actividad de unión es conceptualmente simple. La molécula objetivo se inmoviliza en un soporte sólido, se hace fluir sobre ella una biblioteca de proteínas variantes, se eliminan los aglutinantes deficientes y se recuperan las variantes unidas restantes para aislar sus genes. [23] La unión de una enzima a un inhibidor covalente inmovilizado también se ha utilizado como un intento de aislar catalizadores activos. Sin embargo, este enfoque solo selecciona una única renovación catalítica y no es un buen modelo de unión al sustrato o de reactividad real del sustrato. Si se puede hacer necesaria una actividad enzimática para la supervivencia celular, ya sea sintetizando un metabolito vital o destruyendo una toxina, entonces la supervivencia celular es una función de la actividad enzimática. [24] [25] Estos sistemas generalmente solo están limitados en rendimiento por la eficiencia de transformación de las células. También son menos costosos y requieren menos mano de obra que el cribado, sin embargo, suelen ser difíciles de diseñar, propensos a artefactos y no brindan información sobre el rango de actividades presentes en la biblioteca.

Cribado

Una alternativa a la selección es un sistema de cribado. Cada gen variante se expresa individualmente y se analiza para medir cuantitativamente la actividad (generalmente mediante un producto colorogénico o fluorogénico ). Luego, las variantes se clasifican y el experimentador decide qué variantes utilizar como plantillas para la siguiente ronda de DE. Incluso los ensayos de mayor rendimiento suelen tener una cobertura menor que los métodos de selección, pero ofrecen la ventaja de producir información detallada sobre cada una de las variantes analizadas. Estos datos desagregados también se pueden utilizar para caracterizar la distribución de actividades en bibliotecas, lo que no es posible en sistemas de selección simples. Por lo tanto, los sistemas de cribado tienen ventajas cuando se trata de caracterizar experimentalmente la evolución adaptativa y los paisajes de aptitud.

Asegurar la herencia

Una proteína expresada puede estar unida covalentemente a su gen (como en el ARNm , izquierda) o compartimentada con él ( células o compartimentos artificiales , derecha). De cualquier manera, se garantiza que el gen pueda aislarse en función de la actividad de la proteína codificada.

Cuando se han aislado proteínas funcionales, es necesario que sus genes también lo sean, por lo que se requiere un vínculo genotipo-fenotipo . [24] Esto puede ser covalente, como la visualización del ARNm , donde el gen del ARNm se une a la proteína al final de la traducción mediante puromicina. [12] Alternativamente, la proteína y su gen pueden co-localizarse mediante compartimentación en células vivas [26] o gotitas de emulsión. [27] Las secuencias de genes aisladas se amplifican luego mediante PCR o mediante bacterias hospedadoras transformadas. Se puede utilizar la mejor secuencia individual o un grupo de secuencias como plantilla para la siguiente ronda de mutagénesis. Los ciclos repetidos de Diversificación-Selección-Amplificación generan variantes de proteínas adaptadas a las presiones de selección aplicadas.

Comparación con el diseño racional de proteínas

Ventajas de la evolución dirigida

El diseño racional de una proteína se basa en un conocimiento profundo de la estructura de la proteína , así como de su mecanismo catalítico . [28] [29] Luego se realizan cambios específicos mediante mutagénesis dirigida al sitio en un intento de cambiar la función de la proteína. Una desventaja de esto es que incluso cuando la estructura y el mecanismo de acción de la proteína son bien conocidos, el cambio debido a la mutación sigue siendo difícil de predecir. Por lo tanto, una ventaja de la DE es que no hay necesidad de comprender el mecanismo de la actividad deseada o cómo las mutaciones lo afectarían. [30]

Limitaciones de la evolución dirigida

Una restricción de la evolución dirigida es que se requiere un ensayo de alto rendimiento para medir los efectos de una gran cantidad de mutaciones aleatorias diferentes. Esto puede requerir una investigación y un desarrollo exhaustivos antes de que pueda usarse para la evolución dirigida. Además, estos ensayos suelen ser muy específicos para monitorear una actividad particular y, por lo tanto, no son transferibles a nuevos experimentos de DE. [31]

Además, la selección para mejorar la función analizada simplemente genera mejoras en la función analizada. Para entender cómo se logran estas mejoras, se deben medir las propiedades de la enzima en evolución. La mejora de la actividad analizada puede deberse a mejoras en la actividad catalítica de la enzima o en la concentración de la enzima. Tampoco hay garantía de que la mejora en un sustrato mejore la actividad en otro. Esto es particularmente importante cuando la actividad deseada no se puede analizar o seleccionar directamente y, por lo tanto, se utiliza un sustrato "proxy". La DE puede conducir a la especialización evolutiva en el proxy sin mejorar la actividad deseada. En consecuencia, la elección de las condiciones de análisis o selección adecuadas es vital para una DE exitosa. [32]

La velocidad de la evolución en un experimento también plantea una limitación a la utilidad de la evolución dirigida. Por ejemplo, la evolución de un fenotipo particular, aunque teóricamente factible, puede ocurrir en escalas de tiempo que no son factibles en la práctica. [33] Los enfoques teóricos recientes han apuntado a superar la limitación de la velocidad mediante una aplicación de técnicas de conducción contradiabática de la física estadística, aunque esto aún no se ha implementado en un experimento de evolución dirigida. [34]

Enfoques combinatorios

Se están investigando enfoques combinados, "semirracionales" para abordar las limitaciones tanto del diseño racional como de la evolución dirigida. [1] [35] Las mutaciones beneficiosas son raras, por lo que se deben examinar grandes cantidades de mutantes aleatorios para encontrar variantes mejoradas. Las "bibliotecas enfocadas" se concentran en aleatorizar regiones que se cree que son más ricas en mutaciones beneficiosas para el paso de mutagénesis de DE. Una biblioteca enfocada contiene menos variantes que una biblioteca de mutagénesis aleatoria tradicional y, por lo tanto, no requiere un examen de alto rendimiento.

Para crear una biblioteca específica es necesario saber qué residuos de la estructura se van a mutar. Por ejemplo, el conocimiento del sitio activo de una enzima puede permitir que se aleatoricen solo los residuos que se sabe que interactúan con el sustrato . [36] [37] Alternativamente, el conocimiento de qué regiones de proteínas son variables por naturaleza puede guiar la mutagénesis solo en esas regiones. [38] [39]

Aplicaciones

La evolución dirigida se utiliza con frecuencia para la ingeniería de proteínas como una alternativa al diseño racional , [40] pero también se puede utilizar para investigar cuestiones fundamentales de la evolución de las enzimas. [41]

Ingeniería de proteínas

Como herramienta de ingeniería de proteínas, DE ha tenido más éxito en tres áreas:

  1. Mejora de la estabilidad de las proteínas para uso biotecnológico a altas temperaturas o en disolventes agresivos [42] [43] [44]
  2. Mejora de la afinidad de unión de los anticuerpos terapéuticos ( maduración de la afinidad ) [45] y la actividad de enzimas diseñadas de novo [30]
  3. Modificación de la especificidad del sustrato de enzimas existentes, [46] [47] [48] [49] (a menudo para uso en la industria) [40]

Estudios de evolución

El estudio de la evolución natural se basa tradicionalmente en los organismos existentes y sus genes. Sin embargo, la investigación está fundamentalmente limitada por la falta de fósiles (y en particular la falta de secuencias de ADN antiguas ) [50] [51] y el conocimiento incompleto de las condiciones ambientales antiguas. La evolución dirigida investiga la evolución en un sistema controlado de genes para enzimas individuales , [52] [53] [35] ribozimas [54] y replicadores [55] [3] (similar a la evolución experimental de eucariotas , [56] [57] procariotas [58] y virus [59] ).

La DE permite controlar la presión de selección , la tasa de mutación y el entorno (tanto el entorno abiótico , como la temperatura, como el entorno biótico, como otros genes del organismo). Además, existe un registro completo de todos los genes intermedios evolutivos. Esto permite realizar mediciones detalladas de los procesos evolutivos, por ejemplo, la epistasis , la capacidad de evolución , las restricciones adaptativas [60] [61] , los paisajes de aptitud [62] y las redes neutrales [63] .

Evolución adaptativa de proteomas microbianos en laboratorio

La composición natural de aminoácidos de los proteomas se puede cambiar mediante sustituciones globales de aminoácidos canónicos con contrapartes no canónicas adecuadas bajo la presión selectiva impuesta experimentalmente . Por ejemplo, se han intentado sustituciones globales de aminoácidos naturales con análogos fluorados en Escherichia coli [64] y Bacillus subtilis . [65] En 2015, Budisa y Söll informaron sobre una sustitución completa de triptófano con tienopirrol-alanina en respuesta a 20899 codones UGG en Escherichia coli . [66] Se espera que la evolución experimental de cepas microbianas con una acomodación clara de un aminoácido adicional sea fundamental para ampliar el código genético experimentalmente. [67] La ​​evolución dirigida generalmente se dirige a un gen particular para la mutagénesis y luego examina las variantes resultantes para un fenotipo de interés, a menudo independiente de los efectos de aptitud , mientras que la evolución de laboratorio adaptativa selecciona muchas mutaciones de todo el genoma que contribuyen a la aptitud de cultivos en crecimiento activo. [68]

Véase también

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