Técnica genética que utiliza recombinación homóloga para cambiar un gen endógeno
La orientación genética es una herramienta biotecnológica que se utiliza para cambiar la secuencia de ADN de un organismo (de ahí que sea una forma de edición del genoma ). Se basa en el mecanismo natural de reparación del ADN de reparación dirigida por homología (HDR), incluida la recombinación homóloga . La orientación genética se puede utilizar para realizar ediciones de ADN de diversos tamaños, desde ediciones de ADN más grandes, como la inserción de genes completamente nuevos en un organismo, hasta cambios mucho más pequeños en el ADN existente, como un cambio de un solo par de bases. La orientación genética se basa en la presencia de una plantilla de reparación para introducir las ediciones definidas por el usuario en el ADN. El usuario (generalmente un científico) diseñará la plantilla de reparación para que contenga la edición deseada, flanqueada por una secuencia de ADN correspondiente (homóloga) a la región de ADN que el usuario desea editar; por lo tanto, la edición está dirigida a una región genómica particular. De esta manera, Gene Targeting se diferencia de la reparación natural dirigida por homología, durante la cual la plantilla de reparación de ADN "natural" de la cromátida hermana se utiliza para reparar el ADN roto (la cromátida hermana es la segunda copia del gen). La alteración de la secuencia del ADN en un organismo puede ser útil tanto en el contexto de la investigación (por ejemplo, para comprender el papel biológico de un gen) como en la biotecnología, por ejemplo, para alterar las características de un organismo (por ejemplo, para mejorar las plantas de cultivo).
Métodos
Para crear un organismo dirigido por genes, se debe introducir ADN en sus células. Este ADN debe contener todas las partes necesarias para completar la selección del gen. Como mínimo, esta es la plantilla de reparación de homología, que contiene la edición deseada flanqueada por regiones de ADN homólogas (idénticas en secuencia) a la región objetivo (estas regiones homólogas se denominan "brazos de homología"). A menudo también se requiere un gen informador y/o un marcador seleccionable para ayudar a identificar y seleccionar células (o "eventos") donde realmente se ha producido la GT. También es una práctica común aumentar las tasas de GT provocando una rotura de doble hebra (DSB) en la región del ADN objetivo. [2] Por lo tanto, los genes que codifican la nucleasa específica del sitio de interés también pueden transformarse junto con la plantilla de reparación. Estos elementos genéticos necesarios para la GT pueden ensamblarse mediante clonación molecular convencional en bacterias.
Los métodos de selección de genes están establecidos para varios organismos modelo y pueden variar según la especie utilizada. Para atacar genes en ratones , el ADN se inserta en células madre embrionarias de ratón en cultivo. Las células con la inserción pueden contribuir al tejido de un ratón mediante inyección de embrión . Finalmente, se crían ratones quiméricos donde las células modificadas forman los órganos reproductivos . Después de este paso, todo el cuerpo del ratón se basa en la célula madre embrionaria seleccionada.
Para atacar genes en musgo , el ADN se incuba junto con protoplastos recién aislados y con polietilenglicol . Como los musgos son organismos haploides , [3] los filamentos de musgo ( protonema ) pueden detectarse directamente para detectar el objetivo, ya sea mediante tratamiento con antibióticos o con PCR . Único entre las plantas , este procedimiento de genética inversa es tan eficaz como el de la levadura . [4] La orientación genética se ha aplicado con éxito al ganado vacuno, ovino, porcino y a muchos hongos.
Comparación con otras formas de ingeniería genética
La relación entre la selección de genes, la edición de genes y la modificación genética se describe en el siguiente diagrama de Venn. Muestra cómo la 'ingeniería genética' abarca las tres técnicas. La edición del genoma se caracteriza por realizar pequeñas ediciones en el genoma en una ubicación específica, a menudo después del corte de la región de ADN objetivo mediante una nucleasa de sitio específico como CRISPR. [12] La modificación genética generalmente describe la inserción de un transgén (ADN extraño, es decir, un gen de otra especie) en una ubicación aleatoria dentro del genoma. [13] [14] La orientación genética es una herramienta biotecnológica específica que puede conducir a pequeños cambios en el genoma en un sitio específico [2] - en cuyo caso las ediciones causadas por la orientación genética contarían como edición del genoma. Sin embargo, la orientación genética también es capaz de insertar genes completos (tales como transgenes) en el sitio objetivo si el transgén se incorpora en la plantilla de reparación de homología que se utiliza durante la orientación genética. [15] [16] En tales casos, las ediciones causadas por la selección genética se considerarían, en algunas jurisdicciones, equivalentes a la modificación genética, ya que se ha producido la inserción de ADN extraño. [dieciséis]
La orientación genética es una forma específica de herramienta de edición del genoma . Otras herramientas de edición del genoma incluyen la mutagénesis dirigida, la edición de bases y la edición primaria , todas las cuales crean ediciones en el ADN endógeno (ADN ya presente en el organismo) en una ubicación genómica específica. [17] [18] Esta naturaleza específica de sitio o "dirigida" de la edición del genoma es típicamente lo que hace que la edición del genoma sea diferente de la "modificación genética" tradicional que inserta un transgén en una ubicación no específica en el genoma del organismo, así como como la edición de genes que realiza pequeñas modificaciones en el ADN ya presente en los organismos, frente a la modificación genética que inserta ADN 'extraño' de otra especie. [19] [20]
Debido a que la edición de genes realiza cambios más pequeños en el ADN endógeno, muchas mutaciones creadas mediante la edición del genoma podrían, en teoría, ocurrir mediante mutagénesis natural o, en el contexto de las plantas, mediante el mejoramiento por mutación que es parte del mejoramiento convencional (en contraste con la inserción de un transgén en el ADN endógeno). crear un Organismo Genéticamente Modificado (OGM) no podría ocurrir naturalmente). Sin embargo, existen excepciones a esta regla general; como se explicó en la introducción, GT puede introducir una variedad de tamaños posibles de ediciones en el ADN; desde ediciones muy pequeñas, como cambiar, insertar o eliminar 1 par de bases, hasta la inserción de secuencias de ADN mucho más largas, que en teoría podrían incluir la inserción de un transgén completo. [16] Sin embargo, en la práctica GT se utiliza más comúnmente para insertar secuencias más pequeñas. La variedad de ediciones posibles a través de GT puede dificultar la regulación (ver Reglamento).
Las dos formas más establecidas de edición de genes son la dirigida a genes y la mutagénesis dirigida . Mientras que la orientación genética se basa en la vía de reparación del ADN de reparación dirigida por homología (HDR) (también llamada recombinación homóloga , HR), la mutagénesis dirigida utiliza la unión de extremos no homólogos (NHEJ) del ADN roto. NHEJ es una vía de reparación del ADN propensa a errores, lo que significa que cuando repara el ADN roto puede insertar o eliminar bases de ADN, creando inserciones o eliminaciones (indeles). El usuario no puede especificar cuáles serán estos indeles aleatorios, por lo que no puede controlar exactamente qué ediciones se realizan en el sitio de destino. Sin embargo, pueden controlar dónde se producirán estas ediciones (es decir, dictar el sitio objetivo) mediante el uso de una nucleasa específica del sitio (anteriormente Zinc Finger Nucleases & TALEN , ahora comúnmente CRISPR ) para romper el ADN en el sitio objetivo. En la siguiente figura se muestra un resumen de la selección de genes mediante HDR (también llamada recombinación homóloga) y la mutagénesis dirigida a través de NHEJ.
Las técnicas de edición de genes desarrolladas más recientemente, de edición principal y edición de base, [18] basadas en métodos CRISPR-Cas, son alternativas a la selección de genes, que también pueden crear ediciones definidas por el usuario en ubicaciones genómicas específicas. Sin embargo, cada uno está limitado en la longitud posible de inserción de la secuencia de ADN; la edición de bases se limita a conversiones de un solo par de bases [21], mientras que la edición principal solo puede insertar secuencias de hasta ~44 pb. [22] [23] Por lo tanto, GT sigue siendo el método principal de inserción dirigida (ubicación específica) de secuencias largas de ADN para la ingeniería genómica.
Comparación con la captura de genes
La captura de genes se basa en la inserción aleatoria de un casete, mientras que la focalización de genes manipula un gen específico. Los casetes se pueden utilizar para muchas cosas diferentes, mientras que las regiones de homología flanqueantes de los casetes de direccionamiento de genes deben adaptarse para cada gen. Esto hace que la captura de genes sea más factible para proyectos a gran escala que la focalización. Por otro lado, la orientación genética se puede utilizar para genes con transcripciones bajas que no se detectarían en una prueba de detección. La probabilidad de captura aumenta con el tamaño del intrón , mientras que para la selección de genes, los genes pequeños se alteran con la misma facilidad.
Aplicaciones
Aplicaciones en sistemas de mamíferos.
La orientación genética se desarrolló en células de mamíferos en la década de 1980, [24] [25] [26] con diversas aplicaciones posibles como resultado de la capacidad de realizar cambios de secuencia específicos en un sitio genómico objetivo, como el estudio de la función genética o humana. enfermedad, particularmente en modelos de ratones. [27] De hecho, la orientación genética se ha utilizado ampliamente para estudiar enfermedades genéticas humanas mediante la eliminación (" eliminación ") o la adición (" introducción "), mutaciones específicas de interés. [28] [29] Utilizados anteriormente para diseñar modelos de células de rata, [30] [31] los avances en las tecnologías de selección de genes permiten una nueva ola de modelos isogénicos de enfermedades humanas . Estos modelos son los modelos in vitro más precisos disponibles para los investigadores y facilitan el desarrollo de fármacos y diagnósticos personalizados, particularmente en oncología . [32] También se ha investigado la focalización genética en la terapia génica para corregir mutaciones que causan enfermedades. Sin embargo, la baja eficiencia de la introducción de la maquinaria de direccionamiento de genes en las células ha obstaculizado esto, y se han realizado investigaciones sobre vectores virales para el direccionamiento de genes para tratar de abordar estos desafíos. [33]
Aplicaciones en levadura y musgo.
La selección de genes tiene una eficacia relativamente alta en levaduras, bacterias y musgos (pero es poco común en eucariotas superiores). Por lo tanto, la selección de genes se ha utilizado en enfoques de genética inversa para estudiar la función de los genes en estos sistemas. [34] [35] [36] [37] [38]
Aplicaciones en ingeniería del genoma vegetal.
La orientación genética (GT), o reparación dirigida por homología (HDR), se utiliza habitualmente en la ingeniería del genoma vegetal para insertar secuencias específicas, [39] y el primer ejemplo publicado de GT en plantas data de la década de 1980. [15] Sin embargo, la selección de genes es particularmente desafiante en plantas superiores debido a las bajas tasas de recombinación homóloga, o reparación dirigida por homología, en plantas superiores y la baja tasa de transformación (absorción de ADN) por muchas especies de plantas. [40] Sin embargo, en las últimas décadas se han realizado muchos esfuerzos para aumentar las frecuencias de selección de genes en plantas, [39] [40] [41] [42] ya que es muy útil poder introducir secuencias específicas en el genoma vegetal para la ingeniería del genoma vegetal. La mejora más significativa en las frecuencias de selección de genes en plantas fue la inducción de roturas de doble cadena a través de nucleasas específicas de sitio como CRISPR, como se describió anteriormente. Otras estrategias incluyen la focalización de genes en la planta , mediante la cual la plantilla de reparación de homología se incrusta dentro del genoma de la planta y luego se libera mediante corte CRISPR; [43] regulación positiva de genes implicados en la vía de recombinación homóloga; regulación a la baja de la vía competitiva de unión de extremos no homólogos; [39] número creciente de copias de la plantilla de reparación homóloga; [44] y la ingeniería de variantes de Cas para optimizarlas para el cultivo de tejidos vegetales. [45] Algunos de estos enfoques también se han utilizado para mejorar la eficiencia de la focalización de genes en células de mamíferos. [46]
Las plantas que han sido seleccionadas genéticamente incluyen Arabidopsis thaliana (la planta modelo más comúnmente utilizada ), arroz, tomate, maíz, tabaco y trigo. [40]
Desafíos técnicos
La orientación genética es muy prometedora para realizar cambios de secuencia o inserciones de secuencias específicas y definidas por el usuario en el genoma. Sin embargo, sus aplicaciones principales (modelado de enfermedades humanas e ingeniería del genoma vegetal) se ven obstaculizadas por la baja eficiencia de la recombinación homóloga en comparación con la unión de extremos no homólogos competidores en células de mamíferos y plantas superiores. [47] Como se describió anteriormente, existen estrategias que pueden emplearse para aumentar las frecuencias de direccionamiento de genes en plantas y células de mamíferos. [37] Además, los métodos de selección sólidos que permiten la selección o el enriquecimiento específico de células donde se ha producido la selección de genes pueden aumentar las tasas de recuperación de las células dirigidas a genes. [48]
Como se explicó anteriormente, Gene Targeting es técnicamente capaz de crear una variedad de tamaños de cambios genéticos; desde mutaciones de un solo par de bases hasta la inserción de secuencias más largas, incluidos potencialmente transgenes. Esto significa que los productos de la selección genética pueden ser indistinguibles de la mutación natural, o pueden ser equivalentes a los OGM debido a la inserción de un transgén (ver el diagrama de Venn arriba). Por lo tanto, regular los productos de Gene Targeting puede ser un desafío y diferentes países han adoptado diferentes enfoques o están revisando cómo hacerlo como parte de revisiones regulatorias más amplias de los productos de edición de genes. [50] [51] [52] Las clasificaciones ampliamente adoptadas dividen los organismos editados genéticamente en 3 clases de "SDN1-3", en referencia a las nucleasas dirigidas al sitio (como CRISPR-Cas) que se utilizan para generar organismos editados genéticamente. [53] [16] Estas clasificaciones de SDN pueden guiar las regulaciones nacionales sobre qué clase de SDN considerarán 'OGM' y, por lo tanto, cuáles están sujetas a regulaciones potencialmente estrictas.
SDN1 = organismos creados mediante la unión de extremos no homólogos de una rotura catalizada por SDN en el ADN. Por lo tanto, se han producido mutaciones aleatorias a través del NHEJ propenso a errores y no se ha utilizado ninguna plantilla de reparación (por lo tanto, no se trata de orientación genética). A menudo están sujetos a una supervisión regulatoria menos estricta debido a la falta de uso de una plantilla de reparación del ADN y a la equivalencia con las técnicas de mejoramiento convencionales (en el caso del mejoramiento vegetal).
SDN2 = se han introducido una o varias mutaciones específicas en el gen diana en el sitio de corte de SDN mediante el uso de una plantilla de reparación de homología (de ahí que esto sea Gene Targeting).
SDN3 = se han insertado secuencias más largas en el sitio de corte, mediante recombinación homóloga (es decir, orientación genética) o mediante NHEJ. [16] Las "secuencias más largas" normalmente se refieren a elementos genéticos completos, como promotores o regiones codificantes de proteínas. Estos a menudo se consideran transgénicos y, por lo tanto, a menudo se clasifican como OGM. [54]
Históricamente, la Unión Europea (UE) se ha opuesto en términos generales a la tecnología de modificación genética, por motivos de su principio de precaución . En 2018, el Tribunal de Justicia de la Unión Europea (TJCE) dictaminó que los cultivos genéticamente editados (incluidos los cultivos genéticamente dirigidos) deben considerarse modificados genéticamente [55] y, por lo tanto, estaban sujetos a la Directiva sobre OGM, que impone importantes cargas regulatorias al uso de OGM. Sin embargo, esta decisión fue recibida negativamente por la comunidad científica europea. [56] En 2021, la Comisión Europea consideró que la legislación actual de la UE que regula las técnicas de modificación genética y edición de genes (o NGT, nuevas técnicas genómicas) "no era adecuada para su propósito" y necesitaba adaptarse para reflejar el progreso científico y tecnológico. [57] En julio de 2023, la Comisión Europea publicó una propuesta para cambiar las reglas para ciertos productos de edición genética para reducir los requisitos regulatorios para organismos desarrollados con edición genética que contenían cambios genéticos que podrían haber ocurrido naturalmente. [58]
Physcomitrella patens (única planta en la que está disponible la orientación genética, desde 1998 [59] )
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enlaces externos
Esquema de la orientación genética de la Universidad de Michigan
Orientación genética en diagrama de ratón y resumen del laboratorio Heydari, Universidad Estatal de Wayne
Aspectos destacados de la investigación sobre genes reporteros Archivado el 19 de agosto de 2008 en Wayback Machine utilizados en la selección de genes