El silenciamiento de ARN o interferencia de ARN se refiere a una familia de efectos de silenciamiento de genes mediante los cuales la expresión genética está regulada negativamente por ARN no codificantes como los microARN . El silenciamiento de ARN también puede definirse como una regulación específica de secuencia de la expresión génica desencadenada por ARN bicatenario ( dsRNA ). [1] Los mecanismos de silenciamiento del ARN se conservan entre la mayoría de los eucariotas . [2] El ejemplo más común y mejor estudiado es la interferencia de ARN ( ARNi ), en la que el microARN expresado endógenamente ( miARN ) o el pequeño ARN de interferencia derivado exógenamente ( ARNip ) induce la degradación del ARN mensajero complementario . Se han identificado otras clases de ARN pequeño, incluido el ARN que interactúa con piwi ( piRNA ) [3] y su subespecie de ARN pequeño de interferencia asociado repetido ( rasiRNA ). [4]
El silenciamiento de ARN describe varias vías relacionadas mecánicamente que participan en el control y regulación de la expresión génica. [5] [6] [7] Las vías de silenciamiento del ARN están asociadas con la actividad reguladora de pequeños ARN no codificantes (de aproximadamente 20 a 30 nucleótidos de longitud) que funcionan como factores involucrados en la inactivación de secuencias homólogas, promoviendo la actividad endonucleasa, la detención de la traducción, y/o modificación cromática o de ADN. [8] [9] [10] En el contexto en el que se estudió el fenómeno por primera vez, se descubrió que el ARN pequeño desempeñaba un papel importante en la defensa de las plantas contra los virus. Por ejemplo, estos estudios demostraron que las enzimas detectan el ARN bicatenario ( dsRNA ) que normalmente no se encuentra en las células y lo digieren en pequeños trozos que no pueden causar enfermedades. [11] [12] [13] [14] [2]
Si bien se comprenden algunas funciones del silenciamiento del ARN y su maquinaria, muchas no. Por ejemplo, se ha demostrado que el silenciamiento del ARN es importante en la regulación del desarrollo y en el control de los eventos de transposición. [15] Se ha demostrado que el silenciamiento por ARN desempeña un papel en la protección antiviral tanto en plantas como en insectos. [16] También en levaduras, se ha demostrado que el silenciamiento de ARN mantiene la estructura de la heterocromatina. [17] Sin embargo, el papel variado y matizado del silenciamiento del ARN en la regulación de la expresión genética sigue siendo una investigación científica en curso. Se ha propuesto una variedad de funciones diversas para un número creciente de pequeñas secuencias de ARN caracterizadas, por ejemplo, regulación del desarrollo, destino de las células neuronales, muerte celular, proliferación, almacenamiento de grasa, destino de las células hematopoyéticas y secreción de insulina. [18]
El silenciamiento del ARN funciona reprimiendo la traducción o escindiendo el ARN mensajero ( ARNm ), dependiendo de la cantidad de complementariedad del emparejamiento de bases. El ARN ha sido ampliamente investigado en su papel como intermediario en la traducción de genes a proteínas. [19] Sin embargo, las funciones regulatorias más activas, sin embargo, sólo comenzaron a ser abordadas por los investigadores a partir de finales de los años 1990. [20] El estudio histórico que proporciona una comprensión del primer mecanismo identificado fue publicado en 1998 por Fire et al., [1] y demuestra que el ARN bicatenario podría actuar como un desencadenante del silenciamiento de genes. [20] Desde entonces, se han identificado y caracterizado varias otras clases de silenciamiento de ARN. [5] Actualmente, el potencial terapéutico de estos descubrimientos se está explorando, por ejemplo, en el contexto de la terapia genética dirigida. [21] [22]
Si bien el silenciamiento de ARN es una clase de mecanismos en evolución, un tema común es la relación fundamental entre los ARN pequeños y la expresión genética. [9] También se ha observado que las principales vías de silenciamiento de ARN actualmente identificadas tienen mecanismos de acción que pueden involucrar tanto el silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) [23] como las vías de silenciamiento génico dependiente de cromatina (CDGS). [5] CDGS implica el ensamblaje de pequeños complejos de ARN en transcripciones nacientes y se considera que abarca mecanismos de acción que implican eventos de silenciamiento de genes transcripcionales (TGS) y de silenciamiento de genes cotranscripcionales (CTGS). [24] Esto es significativo al menos porque la evidencia sugiere que los ARN pequeños desempeñan un papel en la modulación de la estructura de la cromatina y el TGS. [25] [26]
A pesar de que la literatura se centró inicialmente en la interferencia de ARN ( ARNi ) como un mecanismo central que se produce a nivel de la traducción del ARN mensajero, desde entonces se han identificado otros en la familia más amplia de vías de silenciamiento de ARN conservadas que actúan a nivel de ADN y cromatina. [27] El silenciamiento por ARN se refiere a la actividad silenciadora de una variedad de ARN pequeños y generalmente se considera una categoría más amplia que la iARN. Si bien los términos a veces se han utilizado indistintamente en la literatura, la iARN generalmente se considera una rama del silenciamiento por ARN. En la medida en que sea útil hacer una distinción entre estos conceptos relacionados, se puede considerar que el silenciamiento por ARN se refiere al esquema más amplio de pequeños controles relacionados con el ARN implicados en la expresión génica y la protección del genoma contra secuencias móviles repetitivas de ADN, retroelementos, y transposones en la medida en que puedan inducir mutaciones. [28] Los mecanismos moleculares para el silenciamiento del ARN se estudiaron inicialmente en plantas [13] pero desde entonces se han ampliado para abarcar una variedad de temas, desde hongos hasta mamíferos, lo que proporciona pruebas sólidas de que estas vías están altamente conservadas. [29]
Actualmente se han identificado al menos tres clases principales de ARN pequeño, a saber: ARN pequeño de interferencia ( ARNip ), microARN ( miARN ) y ARN que interactúa con piwi ( ARNpi ).
Los ARNip actúan en el núcleo y el citoplasma y participan en el ARNi y en el CDGS. [5] Los ARNip provienen de precursores largos de ARNbc derivados de una variedad de precursores de ARN monocatenario (ARNss), como los ARN sentido y antisentido. Los ARNip también provienen de ARN en horquilla derivados de la transcripción de regiones repetidas invertidas. Los ARNip también pueden surgir enzimáticamente a partir de precursores de ARN no codificantes. [30] El volumen de literatura sobre ARNip en el marco de ARNi es extenso. Una de las potentes aplicaciones de los ARNip es la capacidad de distinguir la secuencia objetivo de la no objetivo con una diferencia de un solo nucleótido. Este enfoque se ha considerado terapéuticamente crucial para silenciar los trastornos de ganancia de función dominante (GOF), donde el alelo mutante que causa la enfermedad se diferencia del alelo wt en un solo nucleótido (nt). Este tipo de ARNip con capacidad para distinguir una diferencia de un solo nt se denomina ARNip específicos de alelo. [31]
La mayoría de los miARN actúan en el citoplasma y median en la degradación o detención de la traducción del ARNm. [32] Sin embargo, se ha demostrado que algunos miARN de plantas actúan directamente para promover la metilación del ADN. [33] Los miARN provienen de precursores en horquilla generados por las enzimas RNasaIII Drosha y Dicer . [34] Tanto el miARN como el ARNip forman el complejo silenciador inducido por ARN ( RISC ) o la forma nuclear de RISC conocida como complejo silenciador transcripcional inducido por ARN ( RITS ). [35] El volumen de literatura sobre miARN en el marco de ARNi es extenso.
Tres regiones principales no traducidas (3'UTR) de los ARN mensajeros (ARNm) a menudo contienen secuencias reguladoras que causan interferencia de ARN postranscripcionalmente. Estas 3'-UTR contienen a menudo tanto sitios de unión para microARN (miARN) como para proteínas reguladoras. Al unirse a sitios específicos dentro de la 3'-UTR, los miARN pueden disminuir la expresión genética de varios ARNm al inhibir la traducción o causar directamente la degradación del transcrito. La 3'-UTR también puede tener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm.
La 3'-UTR a menudo contiene elementos de respuesta de microARN (MRE) . Los MRE son secuencias a las que se unen los miARN. Estos son motivos predominantes dentro de las 3'-UTR. Entre todos los motivos reguladores dentro de las 3'-UTR (por ejemplo, incluidas las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad de los motivos.
En 2014, el sitio web miRBase , [36] un archivo de secuencias y anotaciones de miARN , enumeró 28.645 entradas en 233 especies biológicas. De estos, 1.881 miARN estaban en loci de miARN humanos anotados. Se predijo que los miARN tendrían un promedio de aproximadamente cuatrocientos ARNm diana (que afectan la expresión de varios cientos de genes). [37] Freidman et al. [37] estiman que >45.000 sitios objetivo de miARN dentro de las 3'UTR de ARNm humano se conservan por encima de los niveles de fondo, y >60% de los genes codificadores de proteínas humanas han estado bajo presión selectiva para mantener el emparejamiento con los miARN.
Los experimentos directos muestran que un solo miARN puede reducir la estabilidad de cientos de ARNm únicos. [38] Otros experimentos muestran que un solo miARN puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión a menudo es relativamente leve (menos de 2 veces). [39] [40]
Los efectos de la desregulación de la expresión genética de los miARN parecen ser importantes en el cáncer. [41] Por ejemplo, en los cánceres gastrointestinales, se han identificado nueve miARN como alterados epigenéticamente y eficaces para regular a la baja las enzimas reparadoras del ADN. [42]
Los efectos de la desregulación de la expresión genética de los miARN también parecen ser importantes en los trastornos neuropsiquiátricos, como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la depresión mayor, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del espectro autista. [43] [44] [45]
Los piRNA representan la clase más grande de pequeñas moléculas de ARN no codificantes expresadas en células animales y se derivan de una gran variedad de fuentes, incluido el ADN repetitivo y los transposones. [46] Sin embargo, la biogénesis de los piRNA también es la menos comprendida. [47] Los ARNpi parecen actuar tanto a nivel postranscripcional como a nivel de cromatina. Se diferencian de los miARN debido al menos a un aumento en términos de tamaño y complejidad. Los pequeños ARN de interferencia asociados repetidos ( rasiRNA ) se consideran una subespecie de piRNA. [4]
El flujo mecanicista más básico para el silenciamiento de ARN es el siguiente: (Para obtener una explicación más detallada del mecanismo, consulte el artículo ARNi: mecanismo celular ).
1: ARN con repeticiones invertidas construcciones de horquilla/panhandle --> 2: dsRNA --> 3: miRNA / siRNA --> 4: RISC --> 5: Destrucción del mRNA objetivo
El silenciamiento por ARN es el mecanismo que utilizan nuestras células (y las células de todos los reinos ) para combatir los virus y transposones de ARN (que se originan tanto en nuestras propias células como en otros vehículos). [2] En el caso de los virus de ARN, estos se destruyen inmediatamente mediante el mecanismo citado anteriormente. En el caso de los transposones, es un poco más indirecto. Dado que los transposones están ubicados en diferentes partes del genoma, las diferentes transcripciones de los diferentes promotores producen ARNm complementarios que pueden hibridarse entre sí. Cuando esto sucede, la maquinaria de ARNi entra en acción, debilitando los ARNm de las proteínas que serían necesarios para mover los propios transposones. [48]
Para obtener una explicación detallada de la regulación negativa de los genes, consulte ARNi: regulación negativa de los genes.
Para obtener una explicación detallada de la regulación positiva de genes, consulte ARNi: regulación positiva de genes.
De la misma manera que el silenciamiento del ARN regula los ARNm diana posteriores , el silenciamiento del ARN en sí está regulado. Por ejemplo, las señales de silenciamiento se propagan entre las células mediante un grupo de enzimas llamadas RdRP ( ARN polimerasas dependientes de ARN ) o RDR. [2]
La creciente comprensión de los mecanismos de silenciamiento de genes de ARN pequeños que implican la degradación de ARNm de secuencia específica mediada por ARNbc ha tenido un impacto directo en los campos de la genómica funcional, la biomedicina y la biología experimental. La siguiente sección describe varias aplicaciones que involucran los efectos del silenciamiento de ARN. Estos incluyen usos en biotecnología, terapéutica e investigación de laboratorio. También se están aplicando técnicas bioinformáticas para identificar y caracterizar un gran número de ARN pequeños y sus objetivos.
La introducción artificial de ARNbc o ARNip largos se ha adoptado como herramienta para inactivar la expresión genética, tanto en células cultivadas como en organismos vivos. [2] La resolución estructural y funcional de los ARN pequeños como efectores del silenciamiento del ARN ha tenido un impacto directo en la biología experimental. Por ejemplo, se puede sintetizar ARNbc para que tenga una secuencia específica complementaria a un gen de interés. Una vez introducido en una célula o sistema biológico, se reconoce como material genético exógeno y activa la vía de silenciamiento del ARN correspondiente. Este mecanismo se puede utilizar para efectuar disminuciones en la expresión genética con respecto al objetivo, lo que es útil para investigar la pérdida de función de los genes en relación con un fenotipo. Es decir, estudiar los efectos fenotípicos y/o fisiológicos de la disminución de la expresión puede revelar el papel de un producto genético. Los efectos observables pueden matizarse, de modo que algunos métodos pueden distinguir entre "eliminación" (disminución de la expresión) y "eliminación" (eliminación de la expresión) de un gen. [49] Las tecnologías de interferencia de ARN se han señalado recientemente como una de las técnicas más utilizadas en genómica funcional. [50] Se han utilizado pantallas desarrolladas utilizando ARN pequeños para identificar genes implicados en procesos fundamentales como la división celular, la apoptosis y la regulación de las grasas.
Al menos desde mediados de la década de 2000, ha habido un interés cada vez mayor en el desarrollo de ARN de interferencia cortos para aplicaciones biomédicas y terapéuticas. [51] Este interés se ve reforzado por un número creciente de experimentos que han demostrado con éxito el potencial clínico y la seguridad de los ARN pequeños para combatir enfermedades que van desde infecciones virales hasta cáncer y trastornos neurodegenerativos. [52] En 2004, las primeras solicitudes de nuevo fármaco en investigación para ARNip se presentaron en los Estados Unidos ante la Administración de Alimentos y Medicamentos ; estaba destinado a ser una terapia para la degeneración macular relacionada con la edad . [50] El silenciamiento del ARN in vitro e in vivo se ha logrado mediante la creación de desencadenantes (ácidos nucleicos que inducen el ARNi), ya sea mediante la expresión en virus o la síntesis de oligonucleótidos. [53] Con optimismo, muchos estudios indican que las pequeñas terapias basadas en ARN pueden ofrecer armas novedosas y potentes contra patógenos y enfermedades donde los tratamientos de moléculas pequeñas/farmacológicos y vacunas/biológicos han fallado o han demostrado ser menos efectivos en el pasado. [51] Sin embargo, también se advierte que el diseño y la administración de pequeñas moléculas efectoras de ARN deben considerarse cuidadosamente para garantizar la seguridad y eficacia.
El papel del silenciamiento de ARN en la terapéutica, la medicina clínica y el diagnóstico es un área en rápido desarrollo y se espera que en los próximos años algunos de los compuestos que utilizan esta tecnología alcancen la aprobación del mercado. A continuación se resume un informe para resaltar los numerosos dominios clínicos en los que el silenciamiento del ARN está desempeñando un papel cada vez más importante, entre los que destacan los trastornos oculares y retinianos, el cáncer, los trastornos renales, la reducción del LDL y los antivirales. [53] La siguiente tabla muestra una lista de terapias basadas en ARNi actualmente en varias fases de ensayos clínicos. El estado de estos ensayos se puede monitorear en el sitio web ClinicalTrials.gov , un servicio de los Institutos Nacionales de Salud ( NIH ). [54] Cabe destacar los tratamientos en desarrollo para trastornos oculares y retinianos, que estuvieron entre los primeros compuestos en alcanzar el desarrollo clínico. AGN211745 (sirna027) (Allergan) y bevasiranib (Cand5) (Opko) se sometieron a desarrollo clínico para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad, pero los ensayos finalizaron antes de que los compuestos llegaran al mercado. Otros compuestos en desarrollo para afecciones oculares incluyen SYL040012 (Sylentis) y QPI-007 (Quark). SYL040012 (bamosinan) es un fármaco candidato en desarrollo clínico para el glaucoma, una neurodegeneración óptica progresiva frecuentemente asociada al aumento de la presión intraocular; QPI-007 es un candidato para el tratamiento del glaucoma de ángulo cerrado y la neuropatía óptica isquémica anterior no arterítica; Ambos compuestos se encuentran actualmente en ensayos clínicos de fase II. También se están desarrollando varios compuestos para enfermedades como el cáncer y enfermedades raras.
Al igual que con los medicamentos fabricados convencionalmente, el principal desafío en el desarrollo exitoso de medicamentos basados en ARNi es la entrega precisa de los activadores de ARNi a donde se necesitan en el cuerpo. La razón por la que el antídoto para la degeneración macular ocular tuvo éxito antes que el antídoto para otras enfermedades es que el globo ocular es casi un sistema cerrado y el suero se puede inyectar con una aguja exactamente donde debe estar. Los futuros medicamentos exitosos serán aquellos que puedan aterrizar donde sea necesario, probablemente con la ayuda de nanobots. A continuación se muestra una representación de una tabla [53] que muestra los medios existentes de administración de los desencadenantes de ARNi.
La comunidad científica se ha apresurado a aprovechar el silenciamiento del ARN como herramienta de investigación. La focalización estratégica del ARNm puede proporcionar una gran cantidad de información sobre la función del gen y su capacidad para activarse y desactivarse. El silenciamiento de ARN inducido puede servir como un método controlado para suprimir la expresión genética. Dado que la maquinaria se conserva en la mayoría de los eucariotas, estos experimentos se adaptan bien a una variedad de organismos modelo. [55] En la práctica, la expresión de ARN sintéticos en forma de horquilla corta se puede utilizar para alcanzar una eliminación estable. [56] Si se pueden hacer promotores para expresar estos ARN de diseño en forma de horquilla corta, el resultado suele ser una desactivación genética potente, estable y controlada tanto en contextos in vitro como in vivo. [57] Los sistemas de vectores de ARN de horquilla corta pueden considerarse aproximadamente análogos en alcance al uso de sistemas de sobreexpresión de ADNc. [58] En general, los ARN pequeños sintéticos y naturales han demostrado ser una herramienta importante para estudiar la función genética en células y animales. [59]
Los enfoques bioinformáticos para identificar ARN pequeños y sus objetivos han arrojado varios cientos, si no miles, de ARN pequeños candidatos que se predijo que afectarían la expresión genética en plantas, C. elegans, D. melanogaster, pez cebra, ratón, rata y humanos. [60] Estos métodos están dirigidos en gran medida a identificar pequeños ARN candidatos para experimentos de eliminación, pero pueden tener aplicaciones más amplias. Un enfoque bioinformático evaluó los criterios de conservación de secuencias mediante el filtrado de sitios de unión a objetivos complementarios de semillas. El estudio citado predijo que aproximadamente un tercio de los genes de los mamíferos estarían regulados, en este caso, por miARN. [61]
Un aspecto del silenciamiento de ARN a considerar son sus posibles efectos fuera del objetivo, su toxicidad y sus métodos de administración. Para que el silenciamiento de ARN se convierta en un fármaco convencional, primero debe superar las cuestiones éticas típicas de la biomedicina. [62] Utilizando el análisis riesgo-beneficio, los investigadores pueden determinar si el silenciamiento por ARN se ajusta a ideologías éticas como la no maleficencia, la beneficencia y la autonomía. [63]
Existe el riesgo de crear virus aptos para la infección que podrían infectar a personas que no consientan. [64] También existe el riesgo de afectar a las generaciones futuras en función de estos tratamientos. Estos dos escenarios, con respecto a la autonomía, son posibles poco éticos. En este momento, los métodos de administración inseguros y los aspectos no deseados de los virus vectores se suman al argumento en contra del silenciamiento por ARN. [63]
En términos de efectos fuera del objetivo, el ARNip puede inducir respuestas innatas al interferón, inhibir los miARN endógenos mediante saturación y puede tener secuencias complementarias a otros ARNm no objetivo. Estos objetivos fuera de objetivo también podrían tener regulaciones positivas como los oncogenes y los genes antiapoptóticos. La toxicidad del silenciamiento por ARN todavía está bajo revisión ya que existen informes contradictorios. [63] [64] [65]
El silenciamiento por ARN se está desarrollando rápidamente, por lo que es necesario debatir más a fondo las cuestiones éticas. Con el conocimiento de los principios éticos generales, debemos realizar continuamente análisis riesgo-beneficio. [63]