El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ( ELISA ) ( / ɪ ˈ l aɪ z ə / , / ˌ iː ˈ l aɪ z ə / ) es un ensayo de bioquímica analítica de uso común , descrito por primera vez por Eva Engvall y Peter Perlmann en 1971. [1 ] El ensayo es un tipo de inmunoensayo enzimático (EIA) en fase sólida para detectar la presencia de un ligando (comúnmente una proteína) en una muestra líquida utilizando anticuerpos dirigidos contra la proteína que se va a medir. ELISA se ha utilizado como herramienta de diagnóstico en medicina, fitopatología y biotecnología , así como como control de calidad en diversas industrias.
En la forma más simple de ELISA, los antígenos de la muestra que se va a analizar se adhieren a una superficie. Luego, se aplica un anticuerpo compatible sobre la superficie para que pueda unirse al antígeno. Este anticuerpo se vincula a una enzima y luego se eliminan los anticuerpos no unidos. En el paso final, se añade una sustancia que contiene el sustrato de la enzima. Si hubo unión, la reacción posterior produce una señal detectable, más comúnmente un cambio de color.
La realización de un ELISA implica al menos un anticuerpo con especificidad por un antígeno particular. La muestra con una cantidad desconocida de antígeno se inmoviliza sobre un soporte sólido (normalmente una placa de microtitulación de poliestireno ) ya sea de forma no específica (mediante adsorción a la superficie) o específica (mediante captura por otro anticuerpo específico del mismo antígeno, en un "sándwich"). "ELISA). Una vez inmovilizado el antígeno, se añade el anticuerpo de detección, formando un complejo con el antígeno. El anticuerpo de detección puede estar unido covalentemente a una enzima o puede detectarse él mismo mediante un anticuerpo secundario que está unido a una enzima mediante bioconjugación . Entre cada paso, la placa generalmente se lava con una solución de detergente suave para eliminar cualquier proteína o anticuerpo que esté unido de manera no específica. Después del paso de lavado final, la placa se revela agregando un sustrato enzimático para producir una señal visible , que indica la cantidad de antígeno en la muestra.
Es de destacar que ELISA puede realizar otras formas de ensayos de unión de ligandos en lugar de ensayos estrictamente "inmuno", aunque el nombre llevaba el "inmuno" original debido al uso común y la historia de desarrollo de este método. Básicamente, la técnica requiere cualquier reactivo de ligadura que pueda inmovilizarse en la fase sólida junto con un reactivo de detección que se una específicamente y utilice una enzima para generar una señal que pueda cuantificarse adecuadamente. Entre los lavados, sólo el ligando y sus homólogos de unión específica permanecen específicamente unidos o "inmunosorbidos" mediante interacciones antígeno-anticuerpo a la fase sólida, mientras que los componentes no específicos o no unidos se eliminan por lavado. A diferencia de otros formatos de ensayos espectrofotométricos de laboratorio húmedo en los que el mismo pocillo de reacción (p. ej., una cubeta) se puede reutilizar después del lavado, las placas ELISA tienen los productos de reacción inmunoabsorbidos en la fase sólida, que forma parte de la placa, y por lo tanto no son fácilmente reutilizables. .
Como ensayo de bioquímica analítica y técnica de "laboratorio húmedo", ELISA implica la detección de un analito (es decir, la sustancia específica cuya presencia se analiza cuantitativa o cualitativamente) en una muestra líquida mediante un método que continúa utilizando reactivos líquidos durante el análisis . (es decir, una secuencia controlada de reacciones bioquímicas que generará una señal que puede cuantificarse e interpretarse fácilmente como una medida de la cantidad de analito en la muestra) que permanece líquida y permanece dentro de una cámara de reacción o bien necesaria para mantener contenidos los reactivos. [2] [3] Esto contrasta con las técnicas de "laboratorio seco" que utilizan tiras secas. Incluso si la muestra es líquida (por ejemplo, una pequeña gota medida), el paso de detección final en el análisis "seco" implica la lectura de una tira seca mediante métodos como la reflectometría y no necesita una cámara de contención de reacción para evitar derrames o mezclas entre muestras. . [4]
Como ensayo heterogéneo, ELISA separa algún componente de la mezcla de reacción analítica adsorbiendo ciertos componentes en una fase sólida que está físicamente inmovilizada. En ELISA, se agrega una muestra líquida a una fase sólida estacionaria con propiedades de unión especiales y es seguida por múltiples reactivos líquidos que se agregan, incuban y lavan secuencialmente, seguidos de algún cambio óptico (p. ej., desarrollo de color por el producto de una reacción enzimática). reacción) en el líquido final en el pozo desde el cual se mide la cantidad del analito. La "lectura" cuantitativa generalmente se basa en la detección de la intensidad de la luz transmitida mediante espectrofotometría , que implica la cuantificación de la transmisión de alguna longitud de onda específica de la luz a través del líquido (así como el fondo transparente del pocillo en el formato de placa de múltiples pocillos). . [2] [3] La sensibilidad de la detección depende de la amplificación de la señal durante las reacciones analíticas. Dado que las reacciones enzimáticas son procesos de amplificación muy conocidos, la señal se genera mediante enzimas que están unidas a los reactivos de detección en proporciones fijas para permitir una cuantificación precisa, de ahí el nombre "unido a enzimas". [5]
El analito también se denomina ligando porque se unirá o ligará específicamente a un reactivo de detección, por lo que ELISA se incluye en la categoría más amplia de ensayos de unión de ligando . [2] El reactivo de unión específica del ligando se "inmoviliza", es decir, normalmente se recubre y se seca sobre el fondo transparente y a veces también sobre la pared lateral de un pocillo [6] (en este caso la "fase sólida" estacionaria/"sustrato sólido" a micropartículas/perlas sólidas que se pueden eliminar mediante lavado), que generalmente se construye como una placa de múltiples pocillos conocida como "placa ELISA". Convencionalmente, al igual que otras formas de inmunoensayos , la especificidad de la reacción de tipo antígeno - anticuerpo se utiliza porque es fácil generar un anticuerpo específicamente contra un antígeno en masa como reactivo. Alternativamente, si el analito en sí es un anticuerpo, su antígeno diana puede usarse como reactivo de unión. [7]
Antes del desarrollo del ELISA, la única opción para realizar un inmunoensayo era el radioinmunoensayo , una técnica que utiliza antígenos o anticuerpos marcados radiactivamente . En el radioinmunoensayo, la radiactividad proporciona la señal que indica si un antígeno o anticuerpo específico está presente en la muestra. El radioinmunoensayo se describió por primera vez en un artículo científico de Rosalyn Sussman Yalow y Solomon Berson publicado en 1960. [8]
Como la radiactividad representa una amenaza potencial para la salud, se buscó una alternativa más segura. Una alternativa adecuada al radioinmunoensayo sustituiría la señal radiactiva por una señal no radiactiva. Cuando las enzimas (como la peroxidasa de rábano picante ) reaccionan con sustratos apropiados (como ABTS o TMB ), se produce un cambio de color, que se utiliza como señal. Sin embargo, la señal tiene que estar asociada a la presencia de anticuerpo o antígeno, por lo que la enzima tiene que estar unida a un anticuerpo apropiado. Este proceso de vinculación fue desarrollado de forma independiente por Stratis Avrameas y GB Pierce. [9] Dado que es necesario eliminar cualquier anticuerpo o antígeno no unido mediante lavado, el anticuerpo o antígeno debe fijarse a la superficie del recipiente; es decir, se debe preparar el inmunosorbente. Wide y Jerker Porath publicaron una técnica para lograr esto en 1966. [10]
En 1971, Peter Perlmann y Eva Engvall de la Universidad de Estocolmo en Suecia, y Anton Schuurs y Bauke van Weemen en los Países Bajos publicaron de forma independiente artículos que sintetizaban este conocimiento en métodos para realizar EIA/ELISA. [11] [12]
El ELISA tradicional normalmente implica sustratos y reporteros cromogénicos que producen algún tipo de cambio de color observable para indicar la presencia de antígeno o analito. Las técnicas más nuevas similares a ELISA utilizan indicadores de PCR fluorogénicos , electroquimioluminiscentes y cuantitativos para crear señales cuantificables. Estos nuevos reporteros pueden tener varias ventajas, incluidas mayores sensibilidades y multiplexación . [13] [14] En términos técnicos, los ensayos más nuevos de este tipo no son estrictamente ELISA, ya que no están "unidos a enzimas", sino que están vinculados a algún indicador no enzimático. Sin embargo, dado que los principios generales de estos ensayos son muy similares, a menudo se agrupan en la misma categoría que los ELISA.
En 2012, una prueba ELISA ultrasensible basada en enzimas que utilizaba nanopartículas como indicador cromogénico pudo dar una señal de color a simple vista, a partir de la detección de meros attogramos de analito. Aparece un color azul para resultados positivos y un color rojo para resultados negativos. Tenga en cuenta que esta detección sólo puede confirmar la presencia o ausencia del analito, no la concentración real. [15]
Existen muchas pruebas ELISA para moléculas particulares que utilizan los anticuerpos correspondientes. Las pruebas ELISA se dividen en varios tipos de pruebas según cómo se unen y utilizan los analitos y anticuerpos. [16] [17] Los tipos principales se describen aquí. [18]
Los pasos del ELISA directo [19] siguen el siguiente mecanismo:
La enzima actúa como amplificador; Incluso si sólo quedan unidos unos pocos anticuerpos ligados a enzimas, las moléculas de enzima producirán muchas moléculas señal. Dentro de las limitaciones del sentido común, la enzima puede seguir produciendo color indefinidamente, pero cuanto más anticuerpo se una, más rápido se desarrollará el color. Una desventaja importante del ELISA directo es que el método de inmovilización del antígeno no es específico; Cuando se utiliza suero como fuente del antígeno de prueba, todas las proteínas de la muestra pueden adherirse bien a la placa de microtitulación, por lo que pequeñas concentraciones de analito en el suero deben competir con otras proteínas del suero cuando se unen a la superficie del pocillo. El sándwich o ELISA indirecto proporciona una solución a este problema, mediante el uso de un anticuerpo de "captura" específico del antígeno de prueba para extraerlo de la mezcla molecular del suero. [ cita necesaria ]
ELISA puede realizarse en formato cualitativo o cuantitativo. Los resultados cualitativos proporcionan un resultado simple positivo o negativo (sí o no) para una muestra. El límite entre positivo y negativo lo determina el analista y puede ser estadístico. A menudo se utiliza dos o tres veces la desviación estándar (error inherente a una prueba) para distinguir las muestras positivas de las negativas. En ELISA cuantitativo, la densidad óptica (DO) de la muestra se compara con una curva estándar, que normalmente es una dilución en serie de una solución de concentración conocida de la molécula objetivo. Por ejemplo, si una muestra de prueba arroja una DO de 1,0, el punto de la curva estándar que dio DO = 1,0 debe tener la misma concentración de analito que la muestra. [ cita necesaria ]
El uso y significado de los nombres "ELISA indirecto" y "ELISA directo" difieren en la literatura y en los sitios web según el contexto del experimento. Cuando se analiza la presencia de un antígeno, el nombre "ELISA directo" se refiere a un ELISA en el que sólo se utiliza un anticuerpo primario marcado, y el término "ELISA indirecto" se refiere a un ELISA en el que el antígeno está unido al anticuerpo primario. que luego es detectado por un anticuerpo secundario marcado. En este último caso, un ELISA tipo sándwich se distingue claramente de un ELISA indirecto. Cuando el anticuerpo "primario" es de interés, por ejemplo en el caso de análisis de inmunización, este anticuerpo es detectado directamente por el anticuerpo secundario y el término "ELISA indirecto" se aplica a un entorno con dos anticuerpos. [ cita necesaria ]
Se utiliza un ELISA "sándwich" para detectar el antígeno de la muestra. [20] Los pasos son:
La imagen de la derecha incluye el uso de un anticuerpo secundario conjugado a una enzima, aunque, en el sentido técnico, esto no es necesario si el anticuerpo primario está conjugado a una enzima (lo que sería ELISA directo). Sin embargo, el uso de un conjugado de anticuerpo secundario evita el costoso proceso de crear anticuerpos ligados a enzimas para cada antígeno que uno quiera detectar. Al usar un anticuerpo ligado a enzima que se une a la región Fc de otros anticuerpos, este mismo anticuerpo ligado a enzima se puede usar en una variedad de situaciones. Sin la primera capa de anticuerpo de "captura", cualquier proteína de la muestra (incluidas las proteínas del suero) puede adsorberse competitivamente en la superficie de la placa, lo que reduce la cantidad de antígeno inmovilizado. El uso del anticuerpo específico purificado para unir el antígeno al plástico elimina la necesidad de purificar el antígeno de mezclas complicadas antes de la medición, simplificando el ensayo y aumentando la especificidad y la sensibilidad del ensayo. Por lo tanto, un ELISA sándwich utilizado para la investigación a menudo necesita validación para reducir el riesgo de resultados falsos positivos. [21]
Un tercer uso de ELISA es mediante unión competitiva. Los pasos para este ELISA son algo diferentes de los dos primeros ejemplos:
El anticuerpo no marcado se incuba en presencia de su antígeno (muestra).
Algunos kits de ELISA competitivos incluyen antígeno ligado a enzima en lugar de anticuerpo ligado a enzima. El antígeno marcado compite por los sitios de unión del anticuerpo primario con el antígeno de la muestra (no marcado). Cuanto menos antígeno haya en la muestra, más antígeno marcado se retendrá en el pocillo y más fuerte será la señal.
Por lo general, el antígeno no se coloca primero en el pocillo.
Para la detección de anticuerpos contra el VIH, los pocillos de la placa de microtitulación se recubren con el antígeno del VIH. Se utilizan dos anticuerpos específicos, uno conjugado con enzima y el otro presente en suero (si el suero es positivo para el anticuerpo). Se produce una competencia acumulativa entre los dos anticuerpos por el mismo antígeno, lo que provoca que se vea una señal más fuerte. Los sueros que se van a analizar se añaden a estos pocillos, se incuban a 37 °C y luego se lavan. Si hay anticuerpos presentes, se produce la reacción antígeno-anticuerpo. No queda ningún antígeno para los anticuerpos específicos del VIH marcados con enzimas. Estos anticuerpos permanecen libres tras la adición y se eliminan durante el lavado. Se agrega sustrato, pero no hay enzima que actúe sobre él, por lo que un resultado positivo no muestra cambio de color.
Una cuarta prueba ELISA no utiliza los pocillos tradicionales. Esta prueba deja los antígenos suspendidos en el líquido de prueba. [22] [23]
Esta prueba permite etiquetar y contar múltiples antígenos al mismo tiempo. Esto permite identificar cepas específicas de bacterias mediante dos (o más) etiquetas de colores diferentes. Si ambas etiquetas están presentes en una célula, entonces la célula es esa cepa específica. Si sólo uno está presente, no lo es.
Esta prueba se realiza, generalmente, una prueba a la vez y no se puede realizar con la placa de microtitulación . El equipo necesario suele ser menos complicado y puede utilizarse en el campo.
La siguiente tabla enumera los marcadores enzimáticos comúnmente utilizados en los ensayos ELISA, que permiten medir los resultados del ensayo al finalizar.
Debido a que el ELISA se puede realizar para evaluar la presencia de antígeno o la presencia de anticuerpos en una muestra, es una herramienta útil para determinar las concentraciones de anticuerpos séricos (como con la prueba del VIH [26] o el virus del Nilo Occidental ). También ha encontrado aplicaciones en la industria alimentaria para detectar posibles alérgenos alimentarios , como leche , maní , nueces , almendras y huevos [27] y como análisis de sangre serológico para la enfermedad celíaca . [28] [29] ELISA también se puede utilizar en toxicología como una prueba de detección rápida para ciertas clases de medicamentos.
El ELISA fue la primera prueba de detección ampliamente utilizada para el VIH debido a su alta sensibilidad. En un ELISA, el suero de una persona se diluye 400 veces y se aplica a una placa a la que se unen antígenos del VIH. Si hay anticuerpos contra el VIH en el suero, pueden unirse a estos antígenos del VIH. Luego se lava la placa para eliminar todos los demás componentes del suero. Luego se aplica a la placa un "anticuerpo secundario" especialmente preparado, un anticuerpo que se une a otros anticuerpos, seguido de otro lavado. Este anticuerpo secundario está químicamente unido de antemano a una enzima.
Por tanto, la placa contendrá enzima en proporción a la cantidad de anticuerpo secundario unido a la placa. Se aplica un sustrato para la enzima y la catálisis por parte de la enzima produce un cambio de color o fluorescencia. Los resultados de ELISA se informan como un número; El aspecto más controvertido de esta prueba es determinar el punto de corte entre un resultado positivo y uno negativo.
Se puede determinar un punto de corte comparándolo con un estándar conocido. Si se utiliza una prueba ELISA para la detección de drogas en el lugar de trabajo, se establece una concentración de corte, por ejemplo, 50 ng/ml, y se prepara una muestra que contiene la concentración estándar del analito. Las incógnitas que generan una señal más fuerte que la muestra conocida son "positivas". Los que generan una señal más débil son "negativos".
Existen pruebas ELISA para detectar diversos tipos de enfermedades, como el dengue , la malaria , la enfermedad de Chagas , [30] la enfermedad de Johne y otras. [31] Las pruebas ELISA también se emplean ampliamente para el diagnóstico in vitro en laboratorios médicos . Los otros usos de ELISA incluyen:
ELISA es a partir de 2023 el principal método de detección de patógenos vegetales en todo el mundo. [33]
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