La fase G 2 , fase Gap 2 o fase Growth 2 , es la tercera subfase de la interfase en el ciclo celular que precede directamente a la mitosis . Sigue a la finalización exitosa de la fase S , durante la cual se replica el ADN de la célula . La fase G 2 termina con el inicio de la profase , la primera fase de la mitosis en la que la cromatina de la célula se condensa en cromosomas .
La fase G2 es un período de rápido crecimiento celular y síntesis de proteínas durante el cual la célula se prepara para la mitosis. Curiosamente, la fase G2 no es una parte necesaria del ciclo celular, ya que algunos tipos de células (en particular los embriones jóvenes de Xenopus [1] y algunos cánceres [2] ) proceden directamente de la replicación del ADN a la mitosis. Aunque se sabe mucho sobre la red genética que regula la fase G2 y la posterior entrada en mitosis, todavía hay mucho por descubrir sobre su importancia y regulación, en particular en lo que respecta al cáncer. Una hipótesis es que el crecimiento en la fase G2 se regula como un método de control del tamaño celular. Se ha demostrado anteriormente que la levadura de fisión ( Schizosaccharomyces pombe ) emplea dicho mecanismo, a través de la regulación espacial mediada por Cdr2 de la actividad de Wee1 . [3] Aunque Wee1 es un regulador negativo bastante conservado de la entrada mitótica, aún no se ha dilucidado ningún mecanismo general de control del tamaño celular en G2.
Bioquímicamente, el final de la fase G 2 ocurre cuando se alcanza un nivel umbral del complejo ciclina B1 / CDK1 activo , también conocido como factor promotor de la maduración (MPF). [4] La actividad de este complejo está estrechamente regulada durante G 2. En particular, el punto de control G 2 detiene las células en G 2 en respuesta al daño del ADN a través de la regulación inhibitoria de CDK1.
Durante la fase S mitótica , la replicación del ADN produce dos cromátidas hermanas casi idénticas . Las roturas de doble cadena del ADN que surgen después de que la replicación ha progresado o durante la fase G2 pueden repararse antes de que se produzca la división celular (fase M del ciclo celular ). Por lo tanto, durante la fase G2, las roturas de doble cadena en una cromátida hermana pueden repararse mediante reparación recombinacional homóloga utilizando la otra cromátida hermana intacta como plantilla. [5]
La entrada mitótica está determinada por un nivel umbral del complejo ciclina-B1/CDK1 activo, también conocido como ciclina-B1/Cdc2 o factor promotor de la maduración (MPF). La ciclina-B1/CDK1 activa desencadena acciones irreversibles en la mitosis temprana, incluida la separación del centrosoma , la ruptura de la envoltura nuclear y el ensamblaje del huso . En los vertebrados, hay cinco isoformas de ciclina B ( B1 , B2 , B3, B4 y B5), pero aún no está claro el papel específico de cada una de estas isoformas en la regulación de la entrada mitótica. Se sabe que la ciclina B1 puede compensar la pérdida de ciclina B2 (y viceversa en Drosophila ). [6] Saccharomyces cerevisiae contiene seis ciclinas de tipo B (Clb1-6), siendo Clb2 la más esencial para la función. Se especula que tanto en vertebrados como en S. cerevisiae la presencia de múltiples ciclinas de tipo B permite que diferentes ciclinas regulen diferentes partes de la transición G2/M y al mismo tiempo hacen que la transición sea robusta a las perturbaciones. [7]
Las discusiones posteriores se centrarán en la activación espacial y temporal de la ciclina B1/CDK en células de mamíferos, pero se pueden aplicar vías similares tanto en otros metazoos como en S. cerevisiae.
Los niveles de ciclina B1 se suprimen a lo largo de las fases G1 y S por el complejo promotor de anafase (APC), una ligasa de ubiquitina E3 que dirige la ciclina B1 para la proteólisis. La transcripción comienza al final de la fase S después de la replicación del ADN, en respuesta a la fosforilación de factores de transcripción como NF-Y , FoxM1 y B-Myb por los complejos ciclina-CDK G1 y G1/S anteriores. [8]
El aumento de los niveles de ciclina B1 provoca un aumento de los niveles de complejos ciclina B1-CDK1 en todo el G2, pero el complejo permanece inactivo antes de la transición G2/M debido a la fosforilación inhibidora por parte de las quinasas Wee1 y Myt1. Wee1 se localiza principalmente en el núcleo y actúa en el sitio Tyr15, mientras que Myt1 se localiza en la superficie externa del RE y actúa predominantemente en el sitio Thr14.
Los efectos de Wee1 y Myt1 son contrarrestados por las fosfatasas de la familia cdc25, que eliminan los fosfatos inhibidores de CDK1 y así convierten el complejo ciclina B1-CDK1 en su forma completamente activada, MPF.
La ciclina B1-CDK1 activa fosforila y modula la actividad de Wee1 y las isoformas A y C de Cdc25. En concreto, la fosforilación de CDK1 inhibe la actividad de la cinasa Wee1, activa la actividad de la fosfatasa Cdc25C mediante la activación de la cinasa intermedia PLK1 y estabiliza Cdc25A. Por tanto, CDK1 forma un bucle de retroalimentación positiva con Cdc25 y un bucle de retroalimentación negativa doble con Wee1 (esencialmente, un bucle de retroalimentación positiva neta).
Estos bucles de retroalimentación positiva codifican un cambio biestable histérico en la actividad de CDK1 en relación con los niveles de ciclina B1 (ver figura). Este cambio se caracteriza por dos equilibrios estables distintos sobre una región biestable de concentraciones de ciclina B1. Un equilibrio corresponde a la interfase y se caracteriza por la inactividad de Ciclina-B1/CDK1 y Cdc25, y un alto nivel de actividad de Wee1 y Myt1. El otro equilibrio corresponde a la fase M y se caracteriza por una alta actividad de Ciclina-B1/CDK1 y Cdc25, y una baja actividad de Wee1 y Myt1. Dentro del rango de biestabilidad, el estado de una célula depende de si estaba previamente en interfase o en fase M: la concentración umbral para entrar en la fase M es mayor que la concentración mínima que mantendrá la actividad de la fase M una vez que una célula ya ha salido de la interfase.
Los científicos han validado tanto teórica como empíricamente la naturaleza biestable de la transición G2/M. El modelo de Novak-Tyson muestra que las ecuaciones diferenciales que modelan el ciclo de retroalimentación ciclina-B/CDK1-cdc25-Wee1-Myt1 admiten dos equilibrios estables en un rango de concentraciones de ciclina-B. [9] Experimentalmente, la biestabilidad ha sido validada bloqueando la síntesis endógena de ciclina B1 y titulando células en interfase y fase M con concentraciones variables de ciclina B1 no degradable. Estos experimentos muestran que la concentración umbral para entrar en la fase M es más alta que el umbral para salir de la fase M: la descomposición de la envoltura nuclear ocurre entre 32-40 nm de ciclina-B1 para las células que salen de la interfase, mientras que el núcleo permanece desintegrado a concentraciones superiores a 16-24 nm en células que ya están en fase M. [10]
Este cambio biestable e histérico es fisiológicamente necesario por al menos tres razones. [11] En primer lugar, la transición G2/M señala el inicio de varios eventos, como la condensación cromosómica y la ruptura de la envoltura nuclear, que cambian notablemente la morfología de la célula y solo son viables en células en división. Por lo tanto, es esencial que la activación de ciclina-B1/CDK1 ocurra de manera similar a un cambio; es decir, las células deberían establecerse rápidamente en un estado discreto de fase M después de la transición, y no deberían persistir en un continuo de estados intermedios (por ejemplo, con una envoltura nuclear parcialmente descompuesta). Este requisito se satisface mediante la discontinuidad aguda que separa los niveles de equilibrio de la interfase y la fase M de la actividad de CDK1; a medida que la concentración de ciclina-B aumenta más allá del umbral de activación, la célula cambia rápidamente al equilibrio de la fase M.
En segundo lugar, también es vital que la transición G2/M ocurra unidireccionalmente, o solo una vez por ciclo celular Los sistemas biológicos son inherentemente ruidosos , y pequeñas fluctuaciones en las concentraciones de ciclina B1 cerca del umbral para la transición G2/M no deberían hacer que la célula cambie de un lado a otro entre los estados de interfase y fase M. Esto está asegurado por la naturaleza biestable del cambio: después de que la célula pasa al estado de fase M, pequeñas disminuciones en la concentración de ciclina B no hacen que la célula vuelva a cambiar a interfase.
Por último, la continuación del ciclo celular requiere oscilaciones persistentes en la actividad de ciclina-B/CDK1 a medida que la célula y sus descendientes entran y salen de la fase M. La retroalimentación negativa proporciona un elemento esencial de esta oscilación a largo plazo: la ciclina-B/CDK activa APC/C, que causa la degradación de la ciclina-B a partir de la metafase, restaurando a CDK1 a su estado inactivo. Sin embargo, los bucles de retroalimentación negativa simples conducen a oscilaciones amortiguadas que finalmente se asientan en un estado estable. Los modelos cinéticos muestran que los bucles de retroalimentación negativa acoplados con motivos de retroalimentación positiva biestables pueden conducir a oscilaciones persistentes, no amortiguadas (ver oscilador de relajación ) del tipo requerido para el ciclo celular a largo plazo.
El ciclo de retroalimentación positiva mencionado anteriormente, en el que la ciclina-B1/CDK1 promueve su propia activación inhibiendo Wee1 y Myst1 y activando cdc25, no incluye inherentemente un mecanismo "desencadenante" para iniciar el ciclo de retroalimentación. Recientemente, ha surgido evidencia que sugiere un papel más importante para los complejos ciclina A2 /CDK en la regulación del inicio de este cambio. La actividad de ciclina A2/ CDK2 comienza en la fase S temprana y aumenta durante G 2 . Se ha demostrado que Cdc25B desfosforila Tyr15 en CDK2 en la fase G 2 temprana a media de una manera similar al mecanismo CDK1 mencionado anteriormente. La regulación negativa de ciclina A2 en células U2OS retrasa la activación de ciclina-B1/CDK1 al aumentar la actividad de Wee1 y reducir la actividad de Plk1 y Cdc25C. Sin embargo, los complejos ciclina A2/CDK no funcionan estrictamente como activadores de ciclina B1/CDK1 en G 2 , ya que se ha demostrado que CDK2 es necesaria para la activación de la actividad del punto de control G 2 independiente de p53 , tal vez a través de una fosforilación estabilizadora en Cdc6 . Las células CDK2-/- también tienen niveles aberrantemente altos de Cdc25A. También se ha demostrado que la ciclina A2/CDK1 media la destrucción proteasomal de Cdc25B. Estas vías a menudo están desreguladas en el cáncer. [7]
Además de los aspectos biestables e histeréticos de la activación de ciclina B1-CDK1, la regulación de la localización de proteínas subcelulares también contribuye a la transición G2/M. La ciclina B1-CDK1 inactiva se acumula en el citoplasma, comienza a ser activada por cdc25 citoplasmático y luego es secuestrada rápidamente en el núcleo durante la profase (a medida que se activa más). En los mamíferos, la translocación de ciclina B1/CDK1 al núcleo se activa por la fosforilación de cinco sitios de serina en el sitio de retención citoplasmático (CRS) de ciclina B1: S116, S26, S128, S133 y S147. En Xenopus laevis , la ciclina B1 contiene cuatro sitios de fosforilación de serina CRS análogos (S94, S96, S101 y S113), lo que indica que este mecanismo está altamente conservado. La exportación nuclear también se inactiva por la fosforilación de la señal de exportación nuclear (NES) de la ciclina B1. Los reguladores de estos sitios de fosforilación aún son en gran parte desconocidos, pero se han identificado varios factores, incluidas las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK), PLK1 y la propia CDK1. Al alcanzar un nivel umbral de fosforilación, la translocación de ciclina B1/CDK1 al núcleo es extremadamente rápida. Una vez en el núcleo, la ciclina B1/CDK1 fosforila muchos objetivos en preparación para la mitosis, incluida la histona H1 , las láminas nucleares , las proteínas centrosómicas y las proteínas asociadas a los microtúbulos (MAP) .
La localización subcelular de cdc25 también se desplaza del citosol al núcleo durante la profase. Esto se logra mediante la eliminación de fosfatos que ocultan la secuencia de localización nuclear (NLS) y la fosforilación de la señal de exportación nuclear. Se cree que el transporte simultáneo de cdc25 y ciclina-B1/CDK1 al núcleo amplifica la naturaleza de transición de tipo interruptor al aumentar las concentraciones efectivas de las proteínas. [7]
Las células responden al daño del ADN o a los cromosomas replicados de forma incompleta en la fase G2 retrasando la transición G2/M para evitar los intentos de segregar los cromosomas dañados. El daño del ADN es detectado por las quinasas ATM y ATR , que activan Chk1 , una quinasa inhibidora de Cdc25. Chk1 inhibe la actividad de Cdc25 tanto directamente como promoviendo su exclusión del núcleo. [7] El efecto neto es un aumento en el umbral de ciclina B1 requerido para iniciar la transición histéresis a la fase M, deteniendo efectivamente la célula en G2 hasta que el daño sea reparado por mecanismos como la reparación dirigida por homología (ver arriba). [4]
El mantenimiento a largo plazo del arresto de G2 también está mediado por p53 , que se estabiliza en respuesta al daño del ADN. CDK1 es inhibido directamente por tres objetivos transcripcionales de p53: p21 , Gadd45 y 14-3-3σ . La ciclina B1/CDK1 inactiva es secuestrada en el núcleo por p21, [12] mientras que los complejos ciclina B1/CDK1 activos son secuestrados en el citoplasma por 14-3-3σ. [13] Gadd45 interrumpe la unión de la ciclina B1 y CDK1 a través de la interacción directa con CDK1. P53 también reprime transcripcionalmente directamente a CDK1. [13] [14]
Las mutaciones en varios genes implicados en la transición G2/M están implicadas en muchos cánceres. La sobreexpresión tanto de ciclina B como de CDK1, a menudo después de la pérdida de supresores tumorales como p53, puede provocar un aumento en la proliferación celular. [7] Los enfoques experimentales para mitigar estos cambios incluyen tanto la inhibición farmacológica de CDK1 como la regulación negativa de la expresión de ciclina B1 (por ejemplo, a través de ARNi ). [15] [16]
Otros intentos de modular la transición G2/M para aplicaciones de quimioterapia se han centrado en el punto de control del daño del ADN. Se ha demostrado que la elusión farmacológica del punto de control G2/M mediante la inhibición de Chk1 mejora la citotoxicidad de otros fármacos de quimioterapia. La elusión del punto de control conduce a la rápida acumulación de mutaciones perjudiciales, que se cree que conducen a las células cancerosas a la apoptosis . Por el contrario, se ha demostrado que los intentos de prolongar la detención de G2/M también mejoran la citotoxicidad de fármacos como la doxorrubicina . Estos enfoques permanecen en las fases clínicas y preclínicas de investigación. [17]
{{cite book}}: CS1 maint: nombres múltiples: lista de autores ( enlace ) CS1 maint: nombres numéricos: lista de autores ( enlace )12345678910