Microfluídica digital

La microfluídica digital (DMF) es una plataforma para sistemas de laboratorio en un chip que se basa en la manipulación de microgotas. Las gotas se dispensan, mueven, almacenan, mezclan, hacen reaccionar o analizan en una plataforma con un conjunto de electrodos aislados. ^{[1] [2]} La microfluídica digital se puede utilizar junto con procedimientos de análisis analíticos como la espectrometría de masas, la colorimetría, la electroquímica y la electroquimioluminiscencia. ^[1]

Descripción general

Gota acuosa colocada sobre un sistema microfluídico abierto con una vista en sección transversal. El diseño del dispositivo se puede manipular para adaptarse a las necesidades del usuario (electrodos modificados, patrón de electrodos, materiales utilizados, etc.).[3][4]

En analogía con la microelectrónica digital, las operaciones de microfluidos digitales se pueden combinar y reutilizar dentro de estructuras de diseño jerárquico para que los procedimientos complejos (por ejemplo, síntesis química o ensayos biológicos ) se puedan construir paso a paso. Y en contraste con la microfluídica de flujo continuo , la microfluídica digital ^[3] funciona de la misma manera que los protocolos de sobremesa tradicionales, solo que con volúmenes mucho más pequeños y una automatización mucho mayor. Por lo tanto, una amplia gama de procedimientos y protocolos químicos establecidos se pueden transferir sin problemas a un formato de gota de nanolitros . La electrohumectación , la dielectroforesis y los flujos de fluidos inmiscibles son los tres principios más utilizados, que se han utilizado para generar y manipular microgotas en un dispositivo microfluídico digital.

La configuración de un dispositivo microfluídico digital (DMF) depende de los sustratos utilizados, los electrodos, la configuración de esos electrodos, el uso de un material dieléctrico, el espesor de ese material dieléctrico, las capas hidrofóbicas y el voltaje aplicado. ^{[4] [5]}

Gota acuosa colocada sobre un sistema microfluídico digital abierto y cerrado con una vista en sección transversal. Esto muestra el movimiento de la gota una vez que se activa un electrodo. El diseño del dispositivo se puede manipular para adaptarse a las necesidades del usuario (electrodos modificados, patrón de electrodos, materiales utilizados, etc.).[3][4]]]

Un sustrato común utilizado en este tipo de sistema es el vidrio. Dependiendo de si el sistema es abierto o cerrado, habría una o dos capas de vidrio. La capa inferior del dispositivo contiene una matriz estampada de electrodos controlables individualmente. ^[4] Cuando se observa un sistema cerrado, generalmente hay un electrodo de tierra continuo que se encuentra a través de la capa superior hecha generalmente de óxido de indio y estaño ( ITO ). La capa dieléctrica se encuentra alrededor de los electrodos en la capa inferior del dispositivo y es importante para generar cargas y gradientes de campo eléctrico en el dispositivo. ^[5] Se aplica una capa hidrófoba a la capa superior del sistema para disminuir la energía de la superficie donde la gota realmente estará en contacto. ^[5] El voltaje aplicado activa los electrodos y permite cambios en la humectabilidad de la gota en la superficie del dispositivo. Para mover una gota , se aplica un voltaje de control a un electrodo adyacente a la gota y, al mismo tiempo, se desactiva el electrodo justo debajo de la gota. Al variar el potencial eléctrico a lo largo de una matriz lineal de electrodos, se puede utilizar la electrohumectación para mover gotas a lo largo de esta línea de electrodos. ^[6]

También se pueden realizar modificaciones a esta base en la estructura básica del diseño. Un ejemplo de esto es la adición de detectores de electroquimioluminiscencia dentro de la capa de óxido de indio y estaño (el electrodo de tierra en un sistema cerrado) que ayudan en la detección de luminóforos en gotitas. ^[7] En general, también se pueden utilizar diferentes materiales para reemplazar los componentes básicos de un sistema DMF, como el uso de PDMS en lugar de vidrio para el sustrato. ^[8] Se pueden agregar materiales líquidos, como aceite u otra sustancia, a un sistema cerrado para evitar la evaporación de materiales y disminuir la contaminación de la superficie. ^{[6] [9]} Además, los sistemas DMF pueden ser compatibles con gotitas de líquido iónico con el uso de un aceite en un dispositivo cerrado o con el uso de una catena (un cable suspendido) sobre un dispositivo DMF abierto. ^[9]

La microfluídica digital se puede activar con luz. La optoelectrohumectación se puede utilizar para transportar gotitas sésiles por una superficie que contenga fotoconductores con patrones . ^[10] El efecto de fotoelectrohumectación ^[11] también se puede utilizar para lograr el transporte de gotitas en una oblea de silicio sin la necesidad de electrodos con patrones. ^[12]

Principio de funcionamiento

Las gotas se forman utilizando las propiedades de tensión superficial de un líquido. Por ejemplo, el agua colocada sobre una superficie hidrófoba como el papel encerado formará gotas esféricas para minimizar su contacto con la superficie. ^[13] Las diferencias en la hidrofobicidad de la superficie afectan la capacidad de un líquido para extenderse y "humedecer" una superficie al cambiar el ángulo de contacto . ^[14] A medida que aumenta la hidrofobicidad de una superficie, aumenta el ángulo de contacto y disminuye la capacidad de la gota para humedecer la superficie. El cambio en el ángulo de contacto y, por lo tanto, la humectación, está regulado por la ecuación de Young-Lippmann. ^{[4] [9] [5]}

${\displaystyle \cos(\theta )=\cos(\theta {_{0}})+{\frac {\varepsilon {_{0}}\varepsilon {_{r}}V^{2}}{{2\gamma }d}}}$

donde es el ángulo de contacto con un voltaje aplicado ; es el ángulo de contacto sin voltaje; es la permitividad relativa del dieléctrico; es la permitividad del espacio libre ; es la tensión superficial del medio líquido/relleno; es el espesor dieléctrico. ^[5] ${\displaystyle \theta }$ ${\displaystyle V}$ ${\displaystyle \theta {_{0}}}$ ${\displaystyle \varepsilon {_{r}}}$ ${\displaystyle \varepsilon {_{0}}}$ ${\displaystyle \gamma }$ ${\displaystyle d}$

En algunos casos, la hidrofobicidad de un sustrato se puede controlar mediante el uso de campos eléctricos. Esto se refiere al fenómeno de electrohumectación sobre dieléctrico ( EWOD ).[3][4] ^[5] Por ejemplo, cuando no se aplica ningún campo eléctrico a un electrodo, la superficie permanecerá hidrófoba y una gota de líquido formará una gota más esférica con un ángulo de contacto mayor. Cuando se aplica un campo eléctrico, se crea una superficie hidrófila polarizada. La gota de agua luego se aplana y el ángulo de contacto disminuye. Al controlar la localización de esta polarización, podemos crear un gradiente de tensión interfacial que permite el desplazamiento controlado de la gota a través de la superficie del dispositivo DMF. ^[6]

Formación de gotitas

Hay dos maneras de crear nuevas gotas con un dispositivo microfluídico digital. O bien una gota existente se puede dividir en dos, o bien se puede crear una nueva gota a partir de un depósito de material. ^[15] Se sabe que ambos procesos solo funcionan en dispositivos cerrados, ^{[9] [16]} aunque esto no suele ser un problema ya que las placas superiores de los dispositivos DMF suelen ser extraíbles, ^[17] por lo que un dispositivo abierto se puede cerrar temporalmente en caso de que sea necesaria la formación de gotas.

Vista lateral y de arriba hacia abajo de una gota que se divide en un dispositivo DMF, donde la progresión del tiempo se muestra de izquierda a derecha.

De una gota existente

Una gota se puede dividir cargando dos electrodos en lados opuestos de una gota en un electrodo no cargado. De la misma manera que una gota en un electrodo no cargado se moverá hacia un electrodo adyacente cargado, ^[6] esta gota se moverá hacia ambos electrodos activos. El líquido se mueve hacia ambos lados, lo que hace que el centro de la gota se estreche. ^[15] Para una gota del mismo tamaño que los electrodos, la división ocurrirá aproximadamente cuando , ya que el cuello estará en su punto más delgado. ^[15] es el radio de curvatura de los meniscos en el cuello, que es negativo para una curva cóncava, y es el radio de curvatura de los meniscos en los extremos alargados de la gota. Este proceso es simple y da como resultado consistentemente dos gotas de igual volumen. ^{[15] [18]} ${\displaystyle R_{neck}/R_{end}=-1}$ ${\displaystyle R_{neck}}$ ${\displaystyle R_{end}}$

El método convencional ^{[19] [15]} de dividir una gota existente simplemente encendiendo y apagando los electrodos de división produce nuevas gotas de volumen relativamente igual. Sin embargo, las nuevas gotas formadas por el método convencional muestran una diferencia considerable en volumen. ^{[20] [21]} Esta diferencia es causada por perturbaciones locales debido al rápido transporte de masa. ^[21] Aunque la diferencia es insignificante en algunas aplicaciones, todavía puede plantear un problema en aplicaciones que son altamente sensibles a las variaciones de volumen, ^{[22] [23]} como los inmunoensayos ^[24] y la amplificación de ADN. ^[25] Para superar la limitación del método convencional, una gota existente se puede dividir cambiando gradualmente el potencial de los electrodos en la región de división en lugar de simplemente encenderlos y apagarlos. ^[21] Usando este método, se ha informado de una mejora notable en la variación del volumen de la gota, de alrededor del 10% de variación en el volumen a menos del 1% de variación en el volumen. ^[21]

De un depósito

La creación de una nueva gota a partir de un depósito de líquido se puede realizar de forma similar a la división de una gota. En este caso, el depósito permanece estacionario mientras se utiliza una secuencia de electrodos para extraer líquido del depósito. Este líquido extraído y el depósito forman un cuello de líquido, similar al cuello de una gota que se divide, pero más largo, y el colapso de este cuello forma una gota dispensada a partir del líquido extraído. ^{[15] [26]} Sin embargo, a diferencia de la división, la dispensación de gotas de esta manera es inconsistente en escala y resultados. No hay una distancia confiable que deba extraerse líquido del depósito para que el cuello colapse, si es que colapsa. ^[27] Debido a que esta distancia varía, los volúmenes de gotas dispensadas también variarán dentro del mismo dispositivo. ^[27]

Debido a estas inconsistencias, se han utilizado y propuesto técnicas alternativas para dispensar gotitas, incluyendo la extracción de líquido de los depósitos en geometrías que fuerzan un cuello más delgado, ^{[15] [28]} utilizando un canal de electrohumectación continuo y rellenable, ^[22] y moviendo los depósitos hacia las esquinas para cortar el depósito por la mitad. ^{[18] [28]} Múltiples iteraciones de esto último pueden producir gotitas de tamaños más manejables.

Manipulación de gotas

Fusión de gotitas

Como una gota existente se puede dividir para formar gotas discretas usando electrodos (ver A partir de una gota existente ), ^{[19] [15]} las gotas también se pueden fusionar en una gota mediante electrodos. ^{[29] [15]} Utilizando el mismo concepto aplicado para crear nuevas gotas mediante la división de una gota existente con electrodos, una gota acuosa que reposa sobre un electrodo no cargado puede moverse hacia un electrodo cargado donde las gotas se unirán y se fusionarán en una gota. ^{[29] [15]} Sin embargo, la gota fusionada podría no siempre formar una forma circular incluso después de que finalice el proceso de fusión debido a la tensión superficial. ^[15] Este problema se puede resolver implementando una superficie superhidrofóbica entre las gotas y los electrodos. ^[29] Las gotas de aceite también se pueden fusionar de la misma manera, pero las gotas de aceite se moverán hacia electrodos no cargados a diferencia de las gotas acuosas. ^[30]

Transporte de gotitas

Las gotas discretas se pueden transportar de una manera altamente controlada utilizando una matriz de electrodos. ^{[31] [32] [30]} De la misma manera que las gotas se mueven de un electrodo no cargado a un electrodo cargado, o viceversa, las gotas se pueden transportar continuamente a lo largo de los electrodos energizando secuencialmente los electrodos. ^{[33] [30] [15]} Dado que el transporte de gotas implica una matriz de electrodos, se pueden programar múltiples electrodos para aplicar selectivamente un voltaje a cada electrodo para un mejor control sobre el transporte de múltiples gotas. ^[33]

Desplazamiento por accionamiento electrostático

La activación tridimensional de gotas se ha hecho posible mediante la implementación de un sistema cerrado; este sistema contiene una gota de tamaño μL en un medio fluido inmiscible. La gota y el medio se intercalan entre dos placas electromagnéticas, creando un campo EM entre las dos placas. ^{[34] [35]} El propósito de este método es transferir la gota desde una superficie plana inferior a una superficie plana paralela superior y de regreso hacia abajo mediante fuerzas electrostáticas. ^{[34] [36]} La física detrás de dicha activación de partículas y movimiento perpendicular se puede entender a partir de los primeros trabajos de NN Lebedev e IP Skal'skaya. ^[37] En su investigación, intentaron modelar la carga eléctrica de Maxwell adquirida por una partícula conductora perfectamente redonda en presencia de un campo magnético uniforme causado por una superficie perfectamente conductora y de estiramiento infinito. ^[37] Su modelo ayuda a predecir el movimiento en la dirección Z de las microgotas dentro del dispositivo, ya que apunta a la magnitud y dirección de las fuerzas que actúan sobre una microgota. Esto se puede utilizar para ayudar a predecir y corregir con precisión el movimiento incontrolable y no deseado de partículas. El modelo explica por qué no utilizar un revestimiento dieléctrico en una de las dos superficies provoca una inversión de carga dentro de la gota al entrar en contacto con cada electrodo y, a su vez, hace que las gotas reboten sin control entre los electrodos.

La microfluídica digital (DMF) ya se ha adaptado fácilmente en muchos campos biológicos. ^{[38] [39] [40]} Al permitir el movimiento tridimensional dentro de la DMF, la tecnología se puede utilizar incluso más ampliamente en aplicaciones biológicas, ya que podría imitar con mayor precisión los microambientes 3-D. Una gran ventaja de emplear este tipo de método es que permite que dos entornos diferentes sean accesibles para la gota, lo que se puede aprovechar dividiendo las tareas microfluídicas entre las dos superficies. Por ejemplo, mientras que el plano inferior se puede utilizar para mover gotas, la placa superior puede llevar a cabo los procesos químicos y/o biológicos necesarios. ^[34] Esta ventaja se puede traducir en protocolos de experimentos prácticos en la comunidad biológica, como el acoplamiento con la amplificación de ADN. ^{[41] [36] [42]} Esto también permite que el chip sea más pequeño y da a los investigadores más libertad para diseñar plataformas para el análisis de microgotas. ^[34]

Accionamiento por gotas en todo terreno (ATDA)

La microfluídica todoterreno es un método utilizado para transportar gotas de líquido sobre tipos de superficies no tradicionales. ^[43] A diferencia de la plataforma de microfluídica tradicional, que generalmente se limita a superficies planas y horizontales, ATDA permite la manipulación de gotas sobre superficies curvas, no horizontales e invertidas. ^[43] Esto es posible incorporando láminas delgadas y flexibles de cobre y poliimida en la superficie a través de un método de creación rápida de prototipos. ^{[43] [44]} Este dispositivo funciona muy bien con muchos líquidos, incluidos tampones acuosos, soluciones de proteínas y ADN, y suero bovino sin diluir. ^[43] ATDA es compatible con aceite de silicona o aditivos plurónicos, como F-68, que reducen la absorción no específica y la bioincrustación cuando se trata de fluidos biológicos como proteínas, sueros biológicos y ADN. ^{[43] [45]} Una desventaja de una configuración como esta es la evaporación acelerada de las gotas. ^[43] ATDA es una forma de microfluídica digital abierta y, como tal, el dispositivo debe encapsularse en un entorno humidificado para minimizar la evaporación de gotas. ^[46]

Implementación

En una de las diversas realizaciones de biochips microfluídicos basados ​​en EWOD, investigada primero por Cytonix en 1987 [1] Archivado el 19 de septiembre de 2020 en Wayback Machine y posteriormente comercializado por Advanced Liquid Logic, hay dos placas de vidrio paralelas. La placa inferior contiene una matriz estampada de electrodos controlables individualmente y la placa superior está recubierta con un electrodo de conexión a tierra continuo . Se agrega un aislante dieléctrico recubierto con un hidrófobo a las placas para disminuir la capacidad de humectación de la superficie y agregar capacitancia entre la gota y el electrodo de control. La gota que contiene muestras bioquímicas y el medio de relleno, como el aceite de silicona , un aceite fluorado o aire, se intercalan entre las placas y las gotas viajan dentro del medio de relleno. Para mover una gota , se aplica un voltaje de control a un electrodo adyacente a la gota y, al mismo tiempo, se desactiva el electrodo justo debajo de la gota. Al variar el potencial eléctrico a lo largo de una serie lineal de electrodos, se puede utilizar la electrohumectación para mover gotas a lo largo de esta línea de electrodos.

Aplicaciones

Automatización de laboratorio

En campos de investigación como la biología sintética , donde la experimentación altamente iterativa es común, se han realizado esfuerzos considerables para automatizar los flujos de trabajo. ^{[47] [48] [49]} La microfluídica digital a menudo se promociona como una solución de automatización de laboratorio, con una serie de ventajas sobre soluciones alternativas como los robots de pipeteo y la microfluídica de gotas . ^{[50] [51] [52]} Estas ventajas declaradas a menudo incluyen una reducción en el volumen requerido de reactivos experimentales, una reducción en la probabilidad de contaminación y contaminación cruzada, posibles mejoras en la reproducibilidad, mayor rendimiento, direccionabilidad de gotas individuales y la capacidad de integrarse con módulos de sensores y detectores para realizar una automatización del flujo de trabajo de extremo a extremo o incluso de circuito cerrado. ^{[50] [51] [52] [53]}

Huella experimental reducida

Una de las principales ventajas de la microfluídica digital, y de la microfluídica en general, es el uso y la actuación de volúmenes a escala de picolitros a microlitros. Los flujos de trabajo adaptados desde el banco de trabajo a un sistema DMF están miniaturizados, lo que significa que los volúmenes de trabajo se reducen a fracciones de lo que normalmente se requiere para los métodos convencionales. Por ejemplo, Thaitrong et al. desarrollaron un sistema DMF con un módulo de electroforesis capilar (CE) con el propósito de automatizar el proceso de caracterización de la biblioteca de secuenciación de próxima generación (NGS) . En comparación con un Agilent BioAnalyzer (un instrumento comúnmente utilizado para medir la distribución del tamaño de la biblioteca de secuenciación), el sistema DMF-CE consumió diez veces menos volumen de muestra. ^[54] Reducir los volúmenes para un flujo de trabajo puede ser especialmente beneficioso si los reactivos son caros o cuando se manipulan muestras raras, como células tumorales circulantes y muestras prenatales. ^[52] La miniaturización también significa una reducción en los volúmenes de productos de desecho.

Probabilidad reducida de contaminación

Se ha demostrado que los flujos de trabajo basados ​​en DMF, en particular aquellos que utilizan una configuración cerrada con un electrodo de tierra en la placa superior, son menos susceptibles a la contaminación externa en comparación con algunos flujos de trabajo de laboratorio convencionales. Esto se puede atribuir a la mínima interacción del usuario durante los pasos automatizados y al hecho de que los volúmenes más pequeños están menos expuestos a contaminantes ambientales que los volúmenes más grandes que tendrían que estar expuestos al aire libre durante la mezcla. Ruan et al. observaron una contaminación mínima a partir de ADN no humano exógeno y ninguna contaminación cruzada entre muestras mientras utilizaban su sistema de secuenciación digital del genoma completo basado en DMF. ^[52]

Reproducibilidad mejorada

La superación de los problemas de reproducibilidad se ha convertido en un tema de creciente preocupación en todas las disciplinas científicas. ^[55] La reproducibilidad puede ser especialmente importante cuando es necesario repetir múltiples iteraciones del mismo protocolo experimental. ^[56] A menudo se utilizan robots de manipulación de líquidos que pueden minimizar la pérdida de volumen entre los pasos experimentales para reducir las tasas de error y mejorar la reproducibilidad. Sinha et al. describieron un sistema DMF automatizado para la edición del genoma CRISPR-Cas9 , que se utilizó para cultivar y modificar genéticamente células de cáncer de pulmón H1299 . Los autores observaron que no se observó ninguna variación en las eficiencias de eliminación entre los loci cuando las células se cultivaron en el dispositivo DMF, mientras que las células cultivadas en placas de pocillos mostraron variabilidad en las eficiencias de eliminación de los loci ascendentes. Esta reducción de la variabilidad se atribuyó a que el cultivo en un dispositivo DMF es más homogéneo y reproducible en comparación con los métodos de placa de pocillos. ^[57]

Mayor rendimiento

Si bien los sistemas DMF no pueden igualar el mismo rendimiento logrado por algunos robots de pipeteo de manejo de líquidos o por algunos sistemas microfluídicos basados ​​en gotas, aún existen ventajas de rendimiento en comparación con los métodos convencionales realizados manualmente. ^[58]

Direccionamiento de gotas individuales

El DMF permite la direccionabilidad a nivel de gotitas, lo que significa que las gotitas individuales pueden tratarse como microrreactores espacialmente distintos . ^[50] Este nivel de control de gotitas es importante para los flujos de trabajo donde las reacciones son sensibles al orden de mezcla de reactivos y tiempos de incubación, pero donde los valores óptimos de estos parámetros aún pueden necesitar ser determinados. Estos tipos de flujos de trabajo son comunes en biología libre de células , y Liu et al. pudieron demostrar una estrategia basada en DMF de prueba de concepto para llevar a cabo la expresión de proteínas libres de células controlada de forma remota en un chip OpenDrop. ^[59]

Integración de módulos detectores para automatización de extremo a extremo y de circuito cerrado

Una ventaja que a menudo se cita que tienen las plataformas DMF es su potencial para integrarse con sensores en chip y módulos detectores fuera del chip. ^{[50] [59]} En teoría, los datos en tiempo real y de punto final se pueden utilizar junto con métodos de aprendizaje automático para automatizar el proceso de optimización de parámetros.

Separación y extracción

La microfluídica digital se puede utilizar para la separación y extracción de analitos objetivo. Estos métodos incluyen el uso de partículas magnéticas, ^{[60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67]} extracción líquido-líquido , ^[68] pinzas ópticas , ^[69] y efectos hidrodinámicos . ^[70]

Partículas magnéticas

Para las separaciones de partículas magnéticas, se coloca una gota de solución que contiene el analito de interés sobre una matriz de electrodos de microfluidos digitales y se mueve por los cambios en las cargas de los electrodos. La gota se mueve hacia un electrodo con un imán en un lado de la matriz con partículas magnéticas funcionalizadas para unirse al analito. Luego se mueve sobre el electrodo, se elimina el campo magnético y las partículas se suspenden en la gota. La gota se hace girar sobre la matriz de electrodos para asegurar la mezcla. Se vuelve a introducir el imán y las partículas se inmovilizan y la gota se aleja. Este proceso se repite con tampones de lavado y elución para extraer el analito. ^{[60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67]}

Las partículas magnéticas recubiertas con anticuerpos antialbúmina sérica humana se han utilizado para aislar la albúmina sérica humana, como trabajo de prueba de concepto para la inmunoprecipitación utilizando microfluídica digital. ⁵ La extracción de ADN de una muestra de sangre completa también se ha realizado con microfluídica digital. ³ El procedimiento sigue la metodología general de las partículas magnéticas, pero incluye un pretratamiento en la plataforma de microfluídica digital para lisar las células antes de la extracción de ADN. ^[62]

Extracción líquido-líquido

Las extracciones líquido-líquido se pueden realizar en un dispositivo microfluídico digital aprovechando los líquidos inmiscibles. ⁹ Dos gotas, una que contiene el analito en fase acuosa y la otra un líquido iónico inmiscible, están presentes en el conjunto de electrodos. Las dos gotas se mezclan y el líquido iónico extrae el analito, y las gotas son fácilmente separables. ^[68]

Pinzas ópticas

También se han utilizado pinzas ópticas para separar células en gotitas. Se mezclan dos gotitas en un conjunto de electrodos, una que contiene las células y la otra con nutrientes o fármacos. Las gotitas se mezclan y luego se utilizan pinzas ópticas para mover las células a un lado de la gotita más grande antes de que se divida. ^{[71] [69]} Para una explicación más detallada de los principios subyacentes, consulte Pinzas ópticas .

Separación hidrodinámica

Las partículas se han utilizado fuera de la separación magnética, con fuerzas hidrodinámicas para separarlas del volumen de una gota. ^[70] Esto se realiza en conjuntos de electrodos con un electrodo central y "rebanadas" de electrodos que lo rodean. Las gotas se agregan al conjunto y se arremolinan en un patrón circular, y las fuerzas hidrodinámicas del arremolinado hacen que las partículas se agreguen en el electrodo central. ^[70]

Síntesis química

La microfluídica digital (DMF) permite una manipulación y coordinación precisas en reacciones de síntesis química a pequeña escala debido a su capacidad para controlar volúmenes a microescala de reactivos líquidos, lo que permite un menor uso y desperdicio de reactivos en general. ^[72] Esta tecnología se puede utilizar en la síntesis de compuestos como peptidomiméticos y trazadores PET . ^{[73] [74] [75] Los trazadores} PET requieren cantidades de nanogramos y, como tal, la DMF permite una síntesis automatizada y rápida de trazadores con una eficiencia del 90-95% en comparación con las técnicas convencionales a macroescala. ^{[74] [76]}

Los reactivos orgánicos no se utilizan comúnmente en DMF porque tienden a humedecer el dispositivo DMF y causar inundaciones; sin embargo, la síntesis de reactivos orgánicos se puede lograr a través de técnicas DMF al transportar los reactivos orgánicos a través de una gota de líquido iónico, evitando así que el reactivo orgánico inunde el dispositivo DMF. ^[77] Las gotas se combinan entre sí al inducir cargas opuestas, lo que las atrae entre sí. ^[78] Esto permite la mezcla automatizada de gotas. La mezcla de gotas también se utiliza para depositar cristales MOF para imprimir mediante la entrega de reactivos en pocillos y evaporando las soluciones para la deposición de cristales. ^[79] Este método de deposición de cristales MOF es relativamente barato y no requiere un amplio equipo robótico. ^[79]

La síntesis química mediante microfluidos digitales (DMF) se ha aplicado a muchas reacciones biológicas notables. Estas incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), así como la formación de ADN y péptidos . ^{[77] [80]} La reducción, alquilación y digestión enzimática también han demostrado robustez y reproducibilidad utilizando DMF, lo que indica potencial en la síntesis y manipulación de la proteómica . ^[81] Los espectros obtenidos a partir de los productos de estas reacciones a menudo son idénticos a sus espectros de biblioteca, mientras que solo utilizan una pequeña fracción de reactivos a escala de laboratorio. ^[73] Por lo tanto, realizar estas síntesis a microescala tiene el beneficio de limitar el dinero gastado en la compra de reactivos y productos de desecho producidos al mismo tiempo que se obtienen resultados experimentales deseables. Sin embargo, se deben superar numerosos desafíos para impulsar estas reacciones hasta su finalización a través de DMF. Ha habido informes de eficiencia reducida en reacciones químicas en comparación con las versiones a escala de laboratorio de las mismas síntesis, ya que se han observado rendimientos de producto más bajos. ^[80] Además, dado que se deben analizar muestras de tamaño de picolitros y nanolitros, cualquier instrumento utilizado en el análisis debe tener una alta sensibilidad. Además, la configuración del sistema suele ser difícil debido a la gran cantidad de cableado y bombas que se requieren para operar los microcanales y los depósitos. ^[80] Finalmente, las muestras suelen estar sujetas a la evaporación del disolvente, lo que provoca cambios en el volumen y la concentración de los reactivos y, en algunos casos, que las reacciones no se completen. ^[82]

La composición y pureza de las moléculas sintetizadas por DMF se determinan a menudo utilizando técnicas analíticas clásicas. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se ha aplicado con éxito para analizar los intermediarios, productos y cinéticas de reacción correspondientes. ^{[73] [83]} Un problema potencial que surge a través del uso de RMN es la baja sensibilidad de masa, sin embargo, esto se puede corregir mediante el empleo de microbobinas que ayudan a distinguir moléculas de diferentes masas. ^[73] Esto es necesario ya que la relación señal-ruido de los tamaños de muestra en el rango de microlitros a nanolitros se reduce drásticamente en comparación con los tamaños de muestra a escala de banco, y se ha demostrado que las microbobinas resuelven este problema. ^[84] La espectrometría de masas (MS) y la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) también se han utilizado para superar este desafío. ^{[77] [73]} Aunque la MS es una técnica analítica atractiva para distinguir los productos de las reacciones realizadas a través de DMF, plantea sus propias debilidades. Recientemente , la desorción por ionización láser asistida por matriz (MALDI) y la ionización por electrospray (ESI) MS se han combinado con el análisis de reacciones químicas microfluídicas. Sin embargo, la cristalización y la dilución asociadas con estos métodos a menudo conducen a efectos secundarios desfavorables, como la pérdida de muestra y la aparición de reacciones secundarias. ^[17] El uso de MS en DMF se analiza con más detalle en una sección posterior.

Cultivo celular

La conexión del chip DMF para su uso en el campo o en interfaces mundo-chip se ha logrado por medio de bombas y reservorios manuales que suministran microbios, células y medios al dispositivo. ^[85] La falta de bombas y válvulas extensas permite aplicaciones elaboradas de múltiples pasos que involucran células realizadas en un sistema simple y compacto. ^[58] En una aplicación, se transfirieron cultivos microbianos al chip y se les permitió crecer con el uso de procedimientos estériles y la temperatura requerida para la incubación microbiana. Para validar que este era un espacio viable para el crecimiento microbiano, se realizó un ensayo de transformación en el dispositivo. ^[85] Esto implica exponer E. coli a un vector y someter a las bacterias a un choque térmico hasta que absorban el ADN. A esto le sigue la ejecución de un gel de ADN para asegurar que las bacterias absorbieran el vector deseado . Este estudio encontró que el ADN efectivamente fue absorbido por las bacterias y expresado como se predijo.

Las células humanas también se han manipulado en inmunocitoquímica microfluídica digital en células individuales (DISC), donde se utilizaron plataformas DMF para cultivar y usar anticuerpos para marcar proteínas fosforiladas en la célula. ^[86] Luego, las células cultivadas se retiran y se sacan del chip para su cribado. Otra técnica sintetiza hidrogeles dentro de plataformas DMF. Este proceso utiliza electrodos para suministrar reactivos para producir el hidrogel y la entrega de reactivos de cultivo celular para su absorción en el gel. ^{[75] [45]} Los hidrogeles son una mejora con respecto al cultivo celular 2D porque el cultivo celular 3D ha aumentado las interacciones célula-célula y las interacciones célula-matriz extracelular. ^[45] Los cultivos celulares esféricos son otro método desarrollado en torno a la capacidad del DMF para entregar gotitas a las células. La aplicación de un potencial eléctrico permite la automatización de la transferencia de gotitas directamente al cultivo celular colgante. ^[75] ] ^[87] Esto es beneficioso ya que el cultivo celular tridimensional y los esferoides imitan mejor el tejido in vivo al permitir cultivos biológicamente más relevantes que tienen células creciendo en una matriz extracelular similar a la del cuerpo humano. ^[87] Otro uso de las plataformas DMF en el cultivo celular es su capacidad para realizar clonación in vitro sin células utilizando PCR de una sola molécula dentro de gotitas. ^{[88] Los productos amplificados} por PCR se validan luego mediante transfección en células de levadura y una identificación de proteínas mediante transferencia Western. ^[88]

Los problemas que surgen de las aplicaciones de cultivo celular que utilizan DMF incluyen la adsorción de proteínas al fondo del dispositivo y la citotoxicidad para las células. Para evitar la adsorción de proteínas al fondo de la plataforma, se utilizó un aceite de silicona estabilizado con surfactante o hexano para recubrir la superficie del dispositivo y se manipularon las gotas sobre el aceite o el hexano. ^[86] Posteriormente, el hexano se evaporó rápidamente de los cultivos para evitar un efecto tóxico en los cultivos celulares. ^[89] Otro enfoque para resolver la adhesión de proteínas es la adición de aditivos Pluronic a las gotas en el dispositivo. ^[90] Los aditivos Pluronic generalmente no son citotóxicos, pero se ha demostrado que algunos son dañinos para los cultivos celulares. ^[46]

La biocompatibilidad de la configuración del dispositivo es importante para los análisis biológicos. Además de encontrar aditivos Pluronic que no sean citotóxicos, se logró crear un dispositivo cuyo voltaje y movimiento disruptivo no afectaran la viabilidad celular. A través de la lectura de ensayos de células vivas/muertas, se demostró que ni el voltaje necesario para mover las gotitas ni el movimiento de los cultivos en movimiento afectaban la viabilidad celular. ^[46]

Extracción biológica

Las separaciones biológicas suelen implicar muestras de gran volumen y baja concentración. Esto puede suponer un problema para la microfluídica digital debido al pequeño volumen de muestra necesario. ^[63] Los sistemas de microfluídica digital se pueden combinar con un sistema de macrofluídica diseñado para disminuir el volumen de la muestra, lo que a su vez aumenta la concentración del analito. ^[63] Sigue los mismos principios que las partículas magnéticas para la separación, pero incluye el bombeo de la gota para hacer circular un mayor volumen de fluido alrededor de las partículas magnéticas. ^[63] También se ha informado de la extracción de analitos de fármacos a partir de muestras de orina seca. Una gota de disolvente de extracción, en este caso metanol, se hace fluir repetidamente sobre una muestra de orina seca y luego se mueve a un electrodo final donde el líquido se extrae a través de un capilar y luego se analiza mediante espectrometría de masas. ^[91]

Inmunoensayos

Las capacidades avanzadas de manipulación de fluidos de la microfluídica digital (DMF) permiten la adopción de DMF como una plataforma de inmunoensayo , ya que los dispositivos DMF pueden manipular con precisión pequeñas cantidades de reactivos líquidos. Se han desarrollado inmunoensayos heterogéneos (antígenos que interactúan con anticuerpos inmovilizados) e inmunoensayos homogéneos (antígenos que interactúan con anticuerpos en solución) utilizando una plataforma DMF. ^[92] Con respecto a los inmunoensayos heterogéneos, DMF puede simplificar los pasos de procedimiento extensos e intensivos al realizar todos los pasos de suministro, mezcla, incubación y lavado en la superficie del dispositivo (en el chip). Además, las técnicas y métodos de inmunoensayo existentes, como los ensayos basados ​​en perlas magnéticas, ELISA y detección electroquímica, se han incorporado a las plataformas de inmunoensayo DMF. ^{[93] [94] [95] [96]}

La incorporación de ensayos basados ​​en perlas magnéticas en una plataforma de inmunoensayo DMF se ha demostrado para la detección de múltiples analitos, como la insulina humana, IL-6, el marcador cardíaco Troponina I (cTnI), la hormona estimulante de la tiroides (TSH), sTNF-RI y 17β-estradiol. ^{[95] [97] [98] [99]} Por ejemplo, se ha utilizado un enfoque basado en perlas magnéticas para la detección de cTnI de sangre completa en menos de 8 minutos. ^[97] Brevemente, las perlas magnéticas que contenían anticuerpos primarios se mezclaron con anticuerpos secundarios marcados, se incubaron y se inmovilizaron con un imán para los pasos de lavado. Luego, la gota se mezcló con un reactivo quimioluminiscente y la detección de la reacción enzimática acompañante se midió en el chip con un tubo fotomultiplicador .

La plantilla ELISA, comúnmente utilizada para realizar inmunoensayos y otros ensayos bioquímicos basados ​​en enzimas, se ha adaptado para su uso con la plataforma DMF para la detección de analitos como IgE e IgG. ^{[100] [101]} En un ejemplo, ^[93] se realizó una serie de bioensayos para establecer las capacidades de cuantificación de los dispositivos DMF, incluido un inmunoensayo basado en ELISA para la detección de IgE. Se inmovilizaron nanopartículas superparamagnéticas con anticuerpos anti-IgE y aptámeros marcados con fluorescencia para cuantificar IgE utilizando una plantilla ELISA. De manera similar, para la detección de IgG, la IgG se puede inmovilizar en un chip DMF, conjugarse con IgG marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) y luego cuantificarse a través de la medición del cambio de color asociado con la formación del producto de la reacción entre HRP y tetrametilbencidina. ^[100]

Para ampliar aún más las capacidades y aplicaciones de los inmunoensayos DMF más allá de la detección colorimétrica (es decir, ELISA, ensayos basados ​​en perlas magnéticas), se han incorporado herramientas de detección electroquímica (por ejemplo, microelectrodos) en chips DMF para la detección de analitos como TSH y virus de la rubéola. ^{[96] [102] [103]} Por ejemplo, Rackus et al. ^[102] integraron microelectrodos en una superficie de chip DMF y sustituyeron un inmunoensayo de IgG quimioluminiscente informado previamente ^[104] con una especie electroactiva, lo que permitió la detección del virus de la rubéola. Recubrieron perlas magnéticas con virus de la rubéola, IgG anti-rubéola e IgG anti-humana acoplados con fosfatasa alcalina, que a su vez catalizaron una reacción de transferencia de electrones que fue detectada por los microelectrodos en el chip.

Espectrometría de masas

El acoplamiento de la microfluídica digital (DMF) y la espectrometría de masas se puede clasificar en gran medida en análisis indirecto fuera de línea, análisis directo fuera de línea y análisis en línea ^[17] y las principales ventajas de este acoplamiento son la disminución del uso de disolventes y reactivos, así como la disminución de los tiempos de análisis. ^[105]

El análisis indirecto fuera de línea consiste en utilizar dispositivos DMF para combinar reactivos y aislar productos, que luego se eliminan y se transfieren manualmente a un espectrómetro de masas. Este enfoque aprovecha el DMF para el paso de preparación de la muestra, pero también presenta oportunidades de contaminación, ya que se requiere una intervención manual para transferir la muestra. En un ejemplo de esta técnica, se realizó una condensación de tres componentes de Grieco en un chip y se extrajo del chip con una micropipeta para su extinción y posterior análisis. ^[77]

El análisis directo fuera de línea es el uso de dispositivos DMF que se han fabricado e incorporado parcial o totalmente en un espectrómetro de masas. Este proceso todavía se considera fuera de línea, sin embargo, algunos procedimientos posteriores a la reacción se pueden llevar a cabo manualmente (pero en el chip), sin el uso de las capacidades digitales del dispositivo. Estos dispositivos se utilizan con mayor frecuencia en conjugación con MALDI-MS . En los dispositivos fuera de línea directos basados ​​en MALDI, la gota debe secarse y recristalizarse junto con la matriz, operaciones que a menudo requieren cámaras de vacío. ^{[17] [106]} El chip con el analito cristalizado se coloca luego en el MALDI-MS para su análisis. Un problema que se plantea con el acoplamiento de MALDI-MS a DMF es que la matriz necesaria para MALDI-MS puede ser altamente ácida, lo que puede interferir con las reacciones en el chip ^[107].

El análisis en línea es el uso de dispositivos que se alimentan directamente a los espectrómetros de masas, eliminando así cualquier manipulación manual. El análisis en línea puede requerir dispositivos especialmente fabricados y hardware de conexión entre el dispositivo y el espectrómetro de masas. ^[17] El análisis en línea a menudo se combina con la ionización por electrospray . En un ejemplo, se fabricó un chip DMF con un orificio que conducía a un microcanal ^[108] Este microcanal, a su vez, se conectó a un ionizador por electrospray que emitía directamente en un espectrómetro de masas. Las técnicas de ionización ambiental de integración donde los iones se forman fuera del espectrómetro de masas con poco o ningún tratamiento se combinan bien con la naturaleza microfluídica abierta o semiabierta del DMF y permiten un fácil acoplamiento en línea entre los sistemas DMF y MS. Las técnicas de ionización ambiental como la ionización por ondas acústicas de superficie (SAW) generan ondas superficiales en una superficie piezoeléctrica plana que imparte suficiente energía acústica en la interfaz del líquido para superar la tensión superficial y desorber los iones del chip hacia el analizador de masas. ^{[109] [17]} Algunos acoplamientos utilizan una fuente de pulso de alto voltaje externa en la entrada física del espectrómetro de masas ^[110] pero el verdadero papel de tales adiciones es incierto. ^[111]

Una barrera importante para la integración generalizada de DMF con espectrometría de masas es la contaminación biológica, a menudo denominada bioincrustación. ^[17] El análisis de alto rendimiento es una ventaja significativa en el uso de sistemas DMF, ^[105] pero significa que son particularmente susceptibles a la contaminación cruzada entre experimentos. Como resultado, el acoplamiento de DMF con espectrometría de masas a menudo requiere la integración de una variedad de métodos para prevenir la contaminación cruzada, como múltiples pasos de lavado, ^{[112] [113]} surfactantes biológicamente compatibles, ^[114] y/o superficies superhidrofóbicas para prevenir la adsorción de gotitas. ^{[115] [116]} En un ejemplo, una reducción en la señal de contaminante cruzado durante la caracterización de un aminoácido requirió de 4 a 5 pasos de lavado entre cada gotita de muestra para que la intensidad de la contaminación cayera por debajo del límite de detección. ^[113]

Espectrómetros de masas en miniatura

Los espectrómetros de masas convencionales suelen ser grandes, además de prohibitivamente caros y complejos en su funcionamiento, lo que ha llevado al aumento del atractivo de los espectrómetros de masas en miniatura (MMS) para una variedad de aplicaciones. Los MMS están optimizados para ser asequibles y de funcionamiento sencillo, a menudo prescindiendo de la necesidad de técnicos experimentados, teniendo un bajo coste de fabricación y siendo lo suficientemente pequeños en tamaño para permitir la transferencia de la recopilación de datos del laboratorio al campo. ^[117] Estas ventajas a menudo se producen a costa de un rendimiento reducido donde la resolución de los MMS, así como los límites de detección y cuantificación, a menudo son apenas adecuados para realizar tareas especializadas. La integración de DMF con MMS tiene el potencial de mejorar significativamente los sistemas MMS al aumentar el rendimiento, la resolución y la automatización, al tiempo que reduce el coste del disolvente, lo que permite un análisis de grado de laboratorio a un coste mucho menor. En un ejemplo, el uso de un sistema DMF personalizado para pruebas de drogas en orina permitió la creación de un instrumento que pesa solo 25 kg con un rendimiento comparable al análisis de laboratorio estándar. ^[118]

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se puede utilizar en combinación con la microfluídica digital (DMF) mediante el uso de microbobinas de RMN, que son bobinas conductoras electromagnéticas de menos de 1 mm de tamaño. Debido a su tamaño, estas microbobinas tienen varias limitaciones que influyen directamente en la sensibilidad de la maquinaria en la que operan.

Las interfaces de microcanales/microbobinas, anteriores a la microfluídica digital, tenían varios inconvenientes, como que muchas creaban grandes cantidades de residuos de solventes y se contaminaban fácilmente. ^{[119] [120]} De esta manera, el uso de la microfluídica digital y su capacidad para manipular gotas singlete es prometedor.

La interfaz entre la microfluídica digital y la relaxometría de RMN ha llevado a la creación de sistemas como los que se utilizan para detectar y cuantificar las concentraciones de moléculas específicas en microescalas ^[120], y algunos de estos sistemas utilizan procesos de dos pasos en los que los dispositivos DMF guían las gotitas al sitio de detección de RMN. ^[121] También se han desarrollado sistemas introductorios de RMN de alto campo y RMN 2D junto con la microfluídica. ^[119] Estos sistemas utilizan dispositivos DMF de placa única con microbobinas de RMN en lugar de la segunda placa. Recientemente, una versión modificada adicional de esta interfaz incluyó unidades de gradientes de campo pulsado (PFG) que permitieron a esta plataforma realizar mediciones de RMN más sofisticadas (por ejemplo, difusometría de RMN, mediciones de pulsos codificados por gradientes). ^[122] Este sistema se ha aplicado con éxito en el monitoreo de reacciones orgánicas rápidas. ^[123]

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