Para la biología molecular en mamíferos, la desmetilación del ADN provoca la sustitución de 5-metilcitosina (5 mC) en una secuencia de ADN por citosina (C) (ver figura de 5 mC y C). La desmetilación del ADN puede ocurrir mediante un proceso activo en el sitio de 5mC en una secuencia de ADN o, en células en replicación, evitando la adición de grupos metilo al ADN de modo que el ADN replicado tendrá en gran medida citosina en la secuencia de ADN (5mC se diluirá afuera).
La citosina metilada está frecuentemente presente en la secuencia lineal de ADN donde una citosina va seguida de una guanina en la dirección 5' → 3' (un sitio CpG ). En los mamíferos, las ADN metiltransferasas (que añaden grupos metilo a las bases del ADN) exhiben una fuerte preferencia de secuencia por las citosinas en los sitios CpG . [1] Parece haber más de 20 millones de dinucleótidos CpG en el genoma humano (ver distribución genómica ). En los mamíferos, en promedio, entre el 70% y el 80% de las citosinas CpG están metiladas, [2] aunque el nivel de metilación varía según los diferentes tejidos. Las citosinas metiladas suelen aparecer en grupos o islas CpG dentro de las regiones promotoras de los genes , donde dicha metilación puede reducir o silenciar la expresión génica (ver expresión génica ). Sin embargo, las citosinas metiladas en el cuerpo del gen se correlacionan positivamente con la expresión. [3]
Casi el 100% de la desmetilación del ADN se produce mediante una combinación de dilución pasiva y eliminación enzimática activa durante la reprogramación que se produce en la embriogénesis temprana y en la gametogénesis . Otra gran desmetilación, de aproximadamente el 3% de todos los genes, puede ocurrir mediante desmetilación activa en las neuronas durante la formación de una memoria fuerte. [4] Después de la cirugía, se encuentran desmetilaciones en células mononucleares de sangre periférica en sitios anotados para genes del sistema inmunológico. [5] Las desmetilaciones también ocurren durante la formación de cánceres. [6] Durante la hipometilación global del ADN de los genomas tumorales, hay una reducción menor a moderada del número de citosinas metiladas (5 mC), lo que equivale a una pérdida de alrededor del 5 % al 20 % en promedio de las bases de 5 mC. [7]
El genoma del esperma de ratón está metilado en un 80-90% en sus sitios CpG en el ADN, lo que representa aproximadamente 20 millones de sitios metilados. [ cita necesaria ] Después de la fertilización , el cromosoma paterno se desmetila casi por completo en seis horas mediante un proceso activo, antes de la replicación del ADN (línea azul en la Figura).
La desmetilación del genoma materno se produce mediante un proceso diferente. En el ovocito maduro , aproximadamente el 40% de sus sitios CpG en el ADN están metilados. Mientras que las células somáticas de los mamíferos tienen tres ADN metiltransferasas principales (que añaden grupos metilo a las citosinas en los sitios CpG), DNMT1 , DNMT3A y DNMT3B , en el embrión previo a la implantación hasta la etapa de blastocisto (ver Figura), la única metiltransferasa presente es una isoforma de DNMT1 denominada DNMT1o. [8] DNMT1o tiene un promotor alternativo específico de ovocitos y un primer exón (exón 1o) ubicado en 5' de los promotores somáticos y de espermatocitos. Según lo revisado por Howell et al., [8] DNMT1o está secuestrado en el citoplasma de ovocitos maduros y en embriones de 2 y 4 células, pero en la etapa de 8 células solo está presente en el núcleo. En la etapa de 16 células (la mórula ), DNMT1o nuevamente se encuentra solo en el citoplasma. Parece que la desmetilación de los cromosomas maternos se produce en gran medida mediante el bloqueo de la entrada de la enzima metilante DNMT1o al núcleo, excepto brevemente en la etapa de 8 células. El ADN de origen materno sufre así una desmetilación pasiva mediante dilución del ADN materno metilado durante la replicación (línea roja en la figura). La mórula (en la etapa de 16 células) tiene solo una pequeña cantidad de metilación del ADN (línea negra en la Figura).
DNMT3b comienza a expresarse en el blastocisto. [9] La metilación comienza a aumentar 3,5 días después de la fertilización en el blastocisto , y luego ocurre una gran ola de metilación en los días 4,5 a 5,5 en el epiblasto , pasando del 12% al 62% de metilación y alcanzando el nivel máximo después de la implantación en el útero. [10] Para el séptimo día después de la fertilización, las células germinales primordiales (PGC) recién formadas en el embrión implantado se segregan de las células somáticas restantes . En este punto, las PGC tienen aproximadamente el mismo nivel de metilación que las células somáticas.
Las células germinales primordiales (PGC) recién formadas en el embrión implantado derivan de las células somáticas. En este punto las PGC tienen altos niveles de metilación. Estas células migran desde el epiblasto hacia la cresta gonadal . Según lo revisado por Messerschmidt et al., [11] la mayoría de las PGC se detienen en la fase G2 del ciclo celular, mientras migran hacia el intestino posterior durante los días 7,5 a 8,5 del embrión. Luego se produce la desmetilación de las PGC en dos oleadas. [11] En el día 9,5, las células germinales primordiales comienzan a replicarse rápidamente, pasando de aproximadamente 200 PGC en el día 9,5 del embrión a aproximadamente 10.000 PGC en el día 12,5. [12] Durante los días 9,5 a 12,5, DNMT3a y DNMT3b están reprimidos y DNMT1 está presente en el núcleo en un nivel alto. Pero DNMT1 no puede metilar citosinas durante los días 9,5 a 12,5 porque el gen UHRF1 (también conocido como NP95 ) está reprimido y UHRF1 es una proteína esencial necesaria para reclutar DNMT1 en los focos de replicación donde tiene lugar la metilación del ADN de mantenimiento. [12] Esta es una forma pasiva de dilución de desmetilación.
Además, desde el día embrionario 9,5 al 13,5 existe una forma activa de desmetilación. Como se indica más adelante en "Etapas moleculares de la reprogramación activa", dos enzimas son fundamentales para la desmetilación activa. Se trata de una translocación diez-once metilcitosina dioxigenasa (TET) y timina-ADN glicosilasa (TDG). Una enzima TET particular, TET1 y TDG, están presentes en niveles elevados desde el día 9,5 al 13,5 del embrión [12] y se emplean en la desmetilación activa durante la gametogénesis. [11] Los genomas de PGC muestran los niveles más bajos de metilación del ADN de cualquier célula en todo el ciclo de vida del ratón en el día embrionario 13,5. [13]
El aprendizaje y la memoria tienen niveles de permanencia, a diferencia de otros procesos mentales como el pensamiento, el lenguaje y la conciencia, que son de naturaleza temporal. El aprendizaje y la memoria pueden acumularse lentamente (tablas de multiplicar) o rápidamente (tocar una estufa caliente), pero una vez adquiridos, pueden recuperarse para su uso consciente durante mucho tiempo. Las ratas sometidas a un caso de condicionamiento de miedo contextual crean una memoria a largo plazo especialmente fuerte. 24 horas después del entrenamiento, se encontró que el 9,17% de los genes en los genomas de las neuronas del hipocampo de rata estaban metilados diferencialmente . Esto incluyó más de 2.000 genes metilados diferencialmente 24 horas después del entrenamiento, con más de 500 genes desmetilados. [4] También se obtuvieron resultados similares a los del hipocampo de rata en ratones con condicionamiento de miedo contextual. [14]
La región del hipocampo del cerebro es donde se almacenan por primera vez los recuerdos contextuales de miedo (ver figura del cerebro en esta sección), pero este almacenamiento es transitorio y no permanece en el hipocampo. En ratas, el condicionamiento del miedo contextual queda abolido cuando el hipocampo se somete a hipocampectomía sólo un día después del condicionamiento, pero las ratas conservan una cantidad considerable de miedo contextual cuando la hipocampectomía se retrasa cuatro semanas. [15] En ratones, examinados 4 semanas después del acondicionamiento, las metilaciones y desmetilaciones del hipocampo se revirtieron (el hipocampo es necesario para formar recuerdos, pero los recuerdos no se almacenan allí), mientras que se produjo una metilación y desmetilación diferencial sustancial de CpG en las neuronas corticales durante el mantenimiento de la memoria. Había 1.223 genes metilados diferencialmente en la corteza cingulada anterior de ratones cuatro semanas después del condicionamiento de miedo contextual. Así, si bien hubo muchas metilaciones en el hipocampo poco después de que se formara la memoria, todas estas metilaciones en el hipocampo se desmetilaron apenas cuatro semanas después.
El genoma humano contiene alrededor de 28 millones de sitios CpG y aproximadamente el 60% de los sitios CpG están metilados en la posición 5 de la citosina. [16] Durante la formación de un cáncer hay una reducción promedio del número de citosinas metiladas de aproximadamente 5% a 20%, [17] o alrededor de 840,00 a 3,4 millones de desmetilaciones de sitios CpG.
DNMT1 metila CpG en ADN hemimetilado durante la replicación del ADN. Por lo tanto, cuando una cadena de ADN tiene un CpG metilado y la cadena recientemente replicada durante la replicación semiconservadora carece de un grupo metilo en el CpG complementario, DNMT1 normalmente se recluta en el sitio hemimetilado y agrega un grupo metilo a la citosina en el CpG recién sintetizado. . Sin embargo, el reclutamiento de DNMT1 en sitios CpG hemimetilados durante la replicación del ADN depende de la proteína UHRF1 . Si UHRF1 no se une a un sitio CpG hemimetilado, entonces DNMT1 no se recluta y no puede metilar el sitio CpG recién sintetizado. La arginina metiltransferasa PRMT6 regula la metilación del ADN metilando la arginina en la posición 2 de la histona 3 (H3R2me2a). [18] (Ver Metilación de proteínas#Arginina ). En presencia de H3R2me2a, UHRF1 no puede unirse a un sitio CpG hemimetilado, y luego DNMT1 no se recluta en el sitio y el sitio permanece hemimetilado. Tras más rondas de replicación, el CpG metilado se diluye pasivamente. PRMT6 se sobreexpresa con frecuencia en muchos tipos de células cancerosas. [19] La sobreexpresión de PRMT6 puede ser una fuente de desmetilación del ADN en el cáncer.
Para la reprogramación enzimática activa del metiloma del ADN se necesitan tres etapas moleculares . Etapa 1: Reclutamiento. Las enzimas necesarias para la reprogramación se reclutan en sitios del genoma que requieren desmetilación o metilación. Etapa 2: Implementación. Se producen las reacciones enzimáticas iniciales. En el caso de la metilación, este es un paso corto que resulta en la metilación de la citosina a 5-metilcitosina. Etapa 3: Reparación del ADN por escisión de bases. Los productos intermedios de la desmetilación son catalizados por enzimas específicas de la vía de reparación del ADN por escisión de bases que finalmente restauran la cistosina en la secuencia del ADN.
La desmetilación de 5-metilcitosina para generar 5-hidroximetilcitosina (5hmC) muy a menudo implica inicialmente la oxidación de 5mC (consulte la figura en esta sección) mediante metilcitosina dioxigenasas de translocación de diez a once ( enzimas TET ). [21] Los pasos moleculares de esta desmetilación inicial se muestran en detalle en las enzimas TET . En pasos sucesivos (ver Figura), las enzimas TET hidroxilan aún más 5hmC para generar 5-formilcitosina (5fC) y 5-carboxilcitosina (5caC). La timina-ADN glicosilasa (TDG) reconoce las bases intermedias 5fC y 5caC y escinde el enlace glicosídico dando como resultado un sitio apirimidínico (sitio AP). A esto le sigue la reparación por escisión de la base (etapa 3). En una vía de desaminación oxidativa alternativa, las desaminasas APOBEC (AID/APOBEC) pueden desaminar oxidativamente 5 hmC para formar 5-hidroximetiluracilo (5 hmU). Además, 5 mC se pueden convertir en timina (Thy). 5hmU puede ser escindido por TDG, MBD4 , NEIL1 o SMUG1 . Los sitios AP y los desajustes T:G se reparan luego mediante enzimas reparadoras por escisión de bases (BER) para producir citosina (Cyt). La familia TET de dioxigenasas se emplea en el tipo más frecuente de reacciones de desmetilación. [21]
Las isoformas de TET dioxigenasa incluyen al menos dos isoformas de TET1, una de TET2 y tres isoformas de TET3. [22] [23] La isoforma TET1 canónica de longitud completa parece prácticamente restringida a embriones tempranos, células madre embrionarias y células germinales primordiales (PGC). La isoforma TET1 dominante en la mayoría de los tejidos somáticos, al menos en el ratón, surge del uso de un promotor alternativo que da lugar a una transcripción corta y una proteína truncada denominada TET1. Las isoformas de TET3 son la forma de longitud completa TET3FL, una variante de empalme de forma corta de TET3 y una forma que se presenta en ovocitos y neuronas denominada TET3o. TET3o se crea mediante el uso de un promotor alternativo y contiene un primer exón N-terminal adicional que codifica 11 aminoácidos. TET3o solo ocurre en ovocitos y neuronas y no se expresa en células madre embrionarias ni en ningún otro tipo de célula o tejido de ratón adulto analizado. Mientras que la expresión de TET1 apenas se puede detectar en ovocitos y cigotos, y TET2 solo se expresa moderadamente, la variante TET3 TET3o muestra niveles de expresión extremadamente altos en ovocitos y cigotos, pero está casi ausente en la etapa de 2 células. Es posible que la TET3o, rica en neuronas, ovocitos y cigotos en la etapa de una célula, sea la principal enzima TET utilizada cuando se producen desmetilaciones rápidas a gran escala en estas células.
Las enzimas TET no se unen específicamente a la 5-metilcitosina excepto cuando son reclutadas. Sin reclutamiento ni focalización, TET1 se une predominantemente a promotores con alto contenido de CG e islas CpG (CGI) en todo el genoma mediante su dominio CXXC que puede reconocer CGI no metilados . [24] TET2 no tiene afinidad por la 5-metilcitosina en el ADN. [25] El dominio CXXC del TET3 de longitud completa, que es la forma predominante expresada en las neuronas, se une con mayor fuerza a las CpG donde la C se convirtió en 5-carboxicitosina (5caC). Sin embargo, también se une a CpG no metilados . [23]
Para que una enzima TET inicie la desmetilación, primero debe reclutarse en un sitio CpG metilado en el ADN. Dos de las proteínas que reclutan una enzima TET para una citosina metilada en el ADN son OGG1 (ver figura Inicio de la desmetilación del ADN en un sitio CpG) [26] y EGR1 . [27]
La oxoguanina glicosilasa (OGG1) cataliza el primer paso en la reparación por escisión de la base 8-OHdG dañada por oxidación . OGG1 encuentra 8-OHdG deslizándose a lo largo del ADN lineal en 1.000 pares de bases de ADN en 0,1 segundos. [28] OGG1 encuentra muy rápidamente 8-OHdG. Las proteínas OGG1 se unen al ADN dañado por oxidación en un tiempo medio máximo de unos 6 segundos. [29] Cuando OGG1 encuentra 8-OHdG, cambia de conformación y forma complejos con 8-OHdG en su bolsillo de unión. [30] OGG1 no actúa inmediatamente para eliminar el 8-OHdG. La eliminación media máxima de 8-OHdG tarda unos 30 minutos en células HeLa in vitro , [31] o unos 11 minutos en los hígados de ratones irradiados. [32] La oxidación del ADN por especies reactivas de oxígeno ocurre preferentemente en una guanina en un sitio CpG metilado, debido a un potencial de ionización reducido de las bases de guanina adyacentes a la 5-metilcitosina. [33] TET1 se une (se recluta a) el OGG1 unido a 8-OHdG (ver figura). [26] Esto probablemente permite que TET1 desmetile una citosina metilada adyacente. Cuando las células epiteliales mamarias humanas (MCF- 10A ) se trataron con H2O2 , la 8-OHdG aumentó 3,5 veces en el ADN y esto provocó aproximadamente un 80% de desmetilación de las 5-metilcitosinas en el genoma de MCF-10A . [26]
El gen de la proteína 1 de respuesta temprana al crecimiento ( EGR1 ) es un gen temprano inmediato (IEG). EGR1 puede ser inducido rápidamente por la actividad neuronal. [34] La característica definitoria de los IEG es la rápida y transitoria regulación positiva (en cuestión de minutos) de sus niveles de ARNm independientemente de la síntesis de proteínas. [35] En la edad adulta, EGR1 se expresa ampliamente en todo el cerebro, manteniendo los niveles de expresión básicos en varias áreas clave del cerebro, incluida la corteza prefrontal medial, el cuerpo estriado, el hipocampo y la amígdala. [35] Esta expresión está vinculada al control de la cognición, la respuesta emocional, el comportamiento social y la sensibilidad a la recompensa. [35] EGR1 se une al ADN en sitios con los motivos 5′-GCGTGGCG-3' y 5'-GCGGGGGCGG-3' y estos motivos ocurren principalmente en regiones promotoras de genes. [34] La isoforma corta TET1 se expresa en el cerebro. EGR1 y TET1 forman un complejo mediado por las regiones C-terminales de ambas proteínas, independientemente de su asociación con el ADN. [34] EGR1 recluta TET1 en regiones genómicas que flanquean los sitios de unión de EGR1. [34] En presencia de EGR1, TET1 es capaz de desmetilar un locus específico y activar la expresión de genes posteriores regulados por EGR1. [34]
Como se indica en la figura anterior, titulada "Desmetilación de 5-metilcitosina", el primer paso en la desmetilación activa es una oxidación TET de 5-metilcitosina (5 mC) a 5-hidroximetilcitosina (5 hmC). El proceso de desmetilación, en algunos tejidos y en algunas localizaciones del genoma, puede detenerse en ese punto. Según lo revisado por Uribe-Lewis et al., [36] además de ser un intermediario en la desmetilación activa del ADN, 5hmC es a menudo una modificación estable del ADN. Dentro del genoma, 5hmC se encuentra en genes transcripcionalmente activos, elementos reguladores y complejos asociados a la cromatina. En particular, 5hmC cambia dinámicamente y se correlaciona positivamente con la transcripción activa de genes durante la especificación del linaje celular , y se encuentran altos niveles de 5hmC en las células madre embrionarias y en el sistema nervioso central . [37] En los seres humanos, la actividad defectuosa de la 5-hidroximetilación se asocia con un fenotipo de linfoproliferación, inmunodeficiencia y autoinmunidad. [38]
La tercera etapa de la desmetilación del ADN es la eliminación de los productos intermedios de la desmetilación generados por una enzima TET mediante reparación por escisión de bases . Como se indicó anteriormente en la Etapa 2, después de que un TET oxida primero 5 mC para formar 5 hmC, la oxidación adicional de 5 hmC por TET produce 5 fC y la oxidación de 5 fC por TET produce 5caC. Tanto 5fC como 5caC son reconocidos por una ADN glicosilasa , TDG , una enzima reparadora de escisión de bases , como una base anormal. Como se muestra en la Figura de esta sección, TDG elimina la base anormal (p. ej., 5fC) mientras deja intacta la columna vertebral de azúcar-fosfato, creando un sitio apurínico/apirimidínico, comúnmente denominado sitio AP . En esta Figura, el 8-OHdG queda en el ADN, ya que puede haber estado presente cuando OGG1 atrajo a TET1 al sitio CpG con una citosina metilada. Después de que se forma un sitio AP, la endonucleasa AP crea una mella en la columna vertebral de fosfodiéster del sitio AP que se formó cuando la ADN glicosilasa TDG eliminó el 5fC o el 5caC. La endonucleasa AP humana corta el ADN en 5' con respecto al sitio AP mediante un mecanismo hidrolítico, dejando un residuo de 3'-hidroxilo y 5'-desoxirribosa fosfato (5'dRP). [39] A esto le sigue una reparación con parche corto o con parche largo. En la reparación de parches cortos, la 5′ dRP liasa recorta el extremo 5′ dRP para formar un extremo 5′ fosforilado. A esto le sigue la ADN polimerasa β (pol β) que agrega una sola citosina para emparejarse con la guanina preexistente en la cadena complementaria y luego la ADN ligasa para sellar la cadena cortada. En la reparación de parches largos, se cree que la síntesis de ADN está mediada por la polimerasa δ y la polimerasa ε que realizan la síntesis de desplazamiento para formar un colgajo. Pol β también puede realizar síntesis de desplazamiento de parches largos. La síntesis de parche largo normalmente inserta de 2 a 10 nucleótidos nuevos. Luego, la endonucleasa del colgajo elimina el colgajo, seguido de la ADN ligasa para sellar la hebra. En este punto se ha producido una sustitución completa de la 5-metilcitosina por citosina (desmetilación) en la secuencia de ADN.
El ejercicio físico tiene efectos beneficiosos bien establecidos sobre el aprendizaje y la memoria (ver Efectos neurobiológicos del ejercicio físico ). BDNF es un regulador particularmente importante del aprendizaje y la memoria. [40] Según lo revisado por Fernandes et al., [41] en ratas, el ejercicio mejora la expresión en el hipocampo del gen Bdnf , que tiene un papel esencial en la formación de la memoria. La expresión mejorada de Bdnf se produce mediante la desmetilación de su promotor de la isla CpG en el exón IV [41] y esta desmetilación depende de los pasos ilustrados en las dos figuras. [20]
En un panel de adultos sanos, se encontraron asociaciones negativas entre la metilación total del ADN y la exposición a la contaminación del aire relacionada con el tráfico. Los niveles de metilación del ADN se asociaron tanto con la exposición reciente como crónica al carbono negro y al benceno. [42]
Después de una lesión, las neuronas del sistema nervioso periférico adulto pueden pasar de un estado latente con poco crecimiento axonal a una regeneración axónica robusta . La desmetilación del ADN en neuronas maduras de mamíferos elimina las barreras a la regeneración axonal. [43] Esta desmetilación, en la regeneración de neuronas periféricas de ratón, depende de TET3 para generar 5-hidroximetilcitosina (5hmC) en el ADN. [43] [44] 5hmC se alteró en un gran conjunto de genes asociados a la regeneración (RAG), incluidos RAG bien conocidos como Atf3 , Bdnf y Smad1 , que regulan el potencial de crecimiento de los axones de las neuronas. [44]