El experimento de Avery-MacLeod-McCarty fue una demostración experimental realizada por Oswald Avery , Colin MacLeod y Maclyn McCarty que, en 1944, informó que el ADN es la sustancia que causa la transformación bacteriana , en una era en la que se creía ampliamente que eran las proteínas las que cumplían la función de transportar información genética (con la propia palabra proteína acuñada para indicar la creencia de que su función era primaria ). Fue la culminación de la investigación en la década de 1930 y principios del siglo XX en el Instituto Rockefeller de Investigación Médica para purificar y caracterizar el "principio transformador" responsable del fenómeno de transformación descrito por primera vez en el experimento de Griffith de 1928: Streptococcus pneumoniae muerto de la cepa virulenta tipo III-S, cuando se inyectó junto con neumococos tipo II-R vivos pero no virulentos, resultó en una infección mortal de neumococos tipo III-S. En su artículo " Estudios sobre la naturaleza química de la sustancia que induce la transformación de los tipos neumocócicos: inducción de la transformación por una fracción de ácido desoxirribonucleico aislada del neumococo tipo III ", publicado en la edición de febrero de 1944 del Journal of Experimental Medicine , Avery y sus colegas sugieren que el ADN, en lugar de las proteínas como se creía ampliamente en ese momento, puede ser el material hereditario de las bacterias, y podría ser análogo a los genes y/o virus en organismos superiores. [1] [2]
Con el desarrollo de la tipificación serológica , los investigadores médicos pudieron clasificar las bacterias en diferentes cepas o tipos . Cuando a una persona o un animal de prueba (por ejemplo, un ratón ) se le inocula un tipo particular, se produce una respuesta inmunitaria que genera anticuerpos que reaccionan específicamente con los antígenos de las bacterias. Luego, se puede extraer el suero sanguíneo que contiene los anticuerpos y aplicarlo a las bacterias cultivadas . Los anticuerpos reaccionarán con otras bacterias del mismo tipo que la inoculación original. Fred Neufeld , un bacteriólogo alemán, había descubierto los tipos neumocócicos y la tipificación serológica; hasta los estudios de Frederick Griffith, los bacteriólogos creían que los tipos eran fijos e inmutables de una generación a la siguiente. [3]
El experimento de Griffith , publicado en 1928, [4] identificó que algún "principio transformador" en las bacterias neumocócicas podía transformarlas de un tipo a otro. Griffith, un oficial médico británico, había pasado años aplicando la tipificación serológica a casos de neumonía , una enfermedad frecuentemente fatal a principios del siglo XX. Descubrió que a menudo estaban presentes múltiples tipos (algunos virulentos y otros no virulentos) en el curso de un caso clínico de neumonía, y pensó que un tipo podría transformarse en otro (en lugar de que simplemente estuvieran presentes múltiples tipos todo el tiempo). Al probar esa posibilidad, descubrió que la transformación podía ocurrir cuando se inyectaban bacterias muertas de un tipo virulento y bacterias vivas de un tipo no virulento en ratones: los ratones desarrollarían una infección fatal (normalmente solo causada por bacterias vivas del tipo virulento) y morirían, y las bacterias virulentas podrían aislarse de esos ratones infectados. [5]
Los hallazgos del experimento de Griffith fueron confirmados pronto, primero por Fred Neufeld [6] en el Instituto Koch y por Martin Henry Dawson en el Instituto Rockefeller. [7] Una serie de investigadores del Instituto Rockefeller continuaron estudiando la transformación en los años siguientes. Con Richard HP Sia, Dawson desarrolló un método de transformación de bacterias in vitro (en lugar de in vivo como lo había hecho Griffith). [8] Después de la partida de Dawson en 1930, James Alloway retomó el intento de ampliar los hallazgos de Griffith, lo que resultó en la extracción de soluciones acuosas del principio transformador en 1933. Colin MacLeod trabajó para purificar tales soluciones desde 1934 hasta 1937, y el trabajo continuó en 1940 y fue completado por Maclyn McCarty. [9] [10]
El neumococo se caracteriza por presentar colonias lisas que poseen una cápsula de polisacárido que induce la formación de anticuerpos ; los diferentes tipos se clasifican según su especificidad inmunológica. [1]
El procedimiento de purificación que llevó a cabo Avery consistió en matar primero las bacterias con calor y extraer los componentes solubles en solución salina . A continuación, se precipitó la proteína utilizando cloroformo y las cápsulas de polisacárido se hidrolizaron con una enzima . Se utilizó una precipitación inmunológica causada por anticuerpos específicos del tipo para verificar la destrucción completa de las cápsulas. Luego, la porción activa se precipitó mediante fraccionamiento con alcohol , lo que dio como resultado hebras fibrosas que se podían eliminar con una varilla agitadora. [1]
El análisis químico mostró que las proporciones de carbono, hidrógeno, nitrógeno y fósforo en esta porción activa eran consistentes con la composición química del ADN. Para demostrar que era el ADN y no una pequeña cantidad de ARN , proteína o algún otro componente celular el responsable de la transformación, Avery y sus colegas utilizaron una serie de pruebas bioquímicas. Descubrieron que la tripsina , la quimotripsina y la ribonucleasa (enzimas que descomponen las proteínas o el ARN) no la afectaban, pero una preparación enzimática de "desoxirribonucleodespolimerasa" (una preparación cruda, obtenible a partir de varias fuentes animales, que podía descomponer el ADN) destruyó el poder transformador del extracto. [1]
Los trabajos de seguimiento en respuesta a las críticas y los desafíos incluyeron la purificación y cristalización, por Moses Kunitz en 1948, de una despolimerasa de ADN ( desoxirribonucleasa I ), y el trabajo preciso de Rollin Hotchkiss que mostró que prácticamente todo el nitrógeno detectado en el ADN purificado provenía de glicina , un producto de degradación de la base nucleotídica adenina , y que la contaminación proteica no detectada era como máximo del 0,02% según la estimación de Hotchkiss. [11] [12]
Los hallazgos experimentales del experimento de Avery-MacLeod-McCarty se confirmaron rápidamente y se extendieron a otras características hereditarias además de las cápsulas de polisacáridos. Sin embargo, hubo una reticencia considerable a aceptar la conclusión de que el ADN era el material genético. Según la influyente " hipótesis del tetranucleótido " de Phoebus Levene , el ADN consistía en unidades repetidas de las cuatro bases de nucleótidos y tenía poca especificidad biológica. Por lo tanto, se pensaba que el ADN era el componente estructural de los cromosomas , mientras que se pensaba que los genes probablemente estaban hechos del componente proteico de los cromosomas. [13] [14] Esta línea de pensamiento se vio reforzada por la cristalización del virus del mosaico del tabaco en 1935 por Wendell Stanley , [15] y los paralelismos entre virus, genes y enzimas; muchos biólogos pensaron que los genes podrían ser una especie de "superenzima", y se demostró que los virus, según Stanley, eran proteínas y compartían la propiedad de la autocatálisis con muchas enzimas. [16] Además, pocos biólogos pensaban que la genética podía aplicarse a las bacterias, ya que carecían de cromosomas y reproducción sexual . En particular, muchos de los genetistas conocidos informalmente como el grupo de los fagos , que se volverían influyentes en la nueva disciplina de la biología molecular en la década de 1950, rechazaban el ADN como material genético (y se inclinaban a evitar los enfoques bioquímicos "desordenados" de Avery y sus colegas). Algunos biólogos, incluido su compañero del Instituto Rockefeller Alfred Mirsky , desafiaron el hallazgo de Avery de que el principio transformador era ADN puro, sugiriendo que los contaminantes proteicos eran los responsables. [13] [14] Aunque la transformación ocurrió en algunos tipos de bacterias, no pudo replicarse en otras bacterias (ni en ningún organismo superior), y su importancia parecía limitada principalmente a la medicina. [13] [17]
Los científicos que analizan el experimento de Avery-MacLeod-McCarty no se ponen de acuerdo sobre su influencia en los años 1940 y principios de los 1950. Gunther Stent sugirió que fue ignorado en gran medida y que solo se celebró después, de manera similar al trabajo de Gregor Mendel décadas antes del surgimiento de la genética . Otros, como Joshua Lederberg y Leslie C. Dunn , dan fe de su importancia temprana y citan el experimento como el comienzo de la genética molecular . [18]
Algunos microbiólogos y genetistas se habían interesado por la naturaleza física y química de los genes antes de 1944, pero el experimento de Avery-MacLeod-McCarty despertó un renovado y más amplio interés en el tema. Aunque la publicación original no mencionaba específicamente la genética, Avery, así como muchos de los genetistas que leyeron el artículo, eran conscientes de las implicaciones genéticas: que Avery podría haber aislado el gen en sí mismo como ADN puro. El bioquímico Erwin Chargaff , el genetista HJ Muller y otros elogiaron el resultado por establecer la especificidad biológica del ADN y por tener importantes implicaciones para la genética si el ADN desempeñaba un papel similar en organismos superiores. En 1945, la Royal Society otorgó a Avery la Medalla Copley , en parte por su trabajo sobre la transformación bacteriana. [19]
Entre 1944 y 1954, el artículo fue citado al menos 239 veces (con citas distribuidas uniformemente a lo largo de esos años), principalmente en artículos sobre microbiología, inmunoquímica y bioquímica. Además del trabajo de seguimiento de McCarty y otros en el Instituto Rockefeller en respuesta a las críticas de Mirsky, el experimento estimuló un trabajo considerable en microbiología, donde arrojó nueva luz sobre las analogías entre la herencia bacteriana y la genética de los organismos que se reproducen sexualmente. [17] El microbiólogo francés André Boivin afirmó extender los hallazgos de transformación bacteriana de Avery a Escherichia coli , [20] aunque esto no pudo ser confirmado por otros investigadores. [17] Sin embargo, en 1946, Joshua Lederberg y Edward Tatum demostraron la conjugación bacteriana en E. coli y mostraron que la genética podía aplicarse a las bacterias, incluso si el método específico de transformación de Avery no era general. [21] El trabajo de Avery también motivó a Maurice Wilkins a continuar con los estudios cristalográficos de rayos X del ADN, incluso cuando enfrentaba la presión de los financiadores para centrar su investigación en células enteras, en lugar de biomoléculas. [17]
A pesar de la cantidad significativa de citas al artículo y las respuestas positivas que recibió en los años posteriores a su publicación, el trabajo de Avery fue en gran medida ignorado por gran parte de la comunidad científica. Aunque fue recibido positivamente por muchos científicos, el experimento no afectó seriamente a la investigación genética convencional, en parte porque hizo poca diferencia para los experimentos de genética clásica en los que los genes se definían por su comportamiento en experimentos de reproducción en lugar de su composición química. H. J. Muller, aunque interesado, se centró más en estudios físicos que químicos del gen, al igual que la mayoría de los miembros del grupo de los fagos . El trabajo de Avery también fue ignorado por la Fundación Nobel , que más tarde expresó su pesar público por no otorgarle a Avery un Premio Nobel . [22]
En el momento del experimento de Hershey-Chase de 1952 , los genetistas estaban más inclinados a considerar el ADN como el material genético, y Alfred Hershey era un miembro influyente del grupo de los fagos. [23] [24] Erwin Chargaff había demostrado que la composición de bases del ADN varía según la especie (contrariamente a la hipótesis del tetranucleótido), [25] y en 1952 Rollin Hotchkiss publicó su evidencia experimental confirmando el trabajo de Chargaff y demostrando la ausencia de proteína en el principio transformante de Avery. [26] Además, el campo de la genética bacteriana se estaba estableciendo rápidamente, y los biólogos estaban más inclinados a pensar en la herencia en los mismos términos para las bacterias y los organismos superiores. [23] [24] Después de que Hershey y Chase usaran isótopos radiactivos para demostrar que era principalmente ADN, en lugar de proteína, lo que ingresaba a las bacterias tras la infección con bacteriófagos , [27] pronto se aceptó ampliamente que el ADN era el material. A pesar de los resultados experimentales mucho menos precisos (encontraron una cantidad no despreciable de proteínas que entraban en las células además de ADN), el experimento de Hershey-Chase no estuvo sujeto al mismo grado de desafío. Su influencia se vio impulsada por la creciente red del grupo de los fagos y, al año siguiente, por la publicidad en torno a la estructura del ADN propuesta por Watson y Crick (Watson también era miembro del grupo de los fagos). Sin embargo, solo en retrospectiva, ambos experimentos demostraron definitivamente que el ADN es el material genético. [23] [24]