Quimiostato

Un tipo de biorreactor

Recipiente quimiostato cerrado con una entrada de medio y una salida de efluente continuas y regulables, utilizado para el crecimiento controlado de microorganismos. El sistema mantiene un volumen y un nivel de aireación constantes. La tasa de crecimiento del microorganismo se controla mediante la manipulación de la entrada de medio fresco, mientras que la densidad de población se regula mediante el cambio de la concentración del nutriente limitante. Este sistema abierto permite a los investigadores mantener la fase de crecimiento exponencial de las células para su uso en experimentos fisiológicos. ^[1]

Un quimiostato (de chemical environment, que significa entorno químico , es estático ) es un biorreactor al que se añade continuamente medio nuevo, mientras que el líquido de cultivo que contiene nutrientes sobrantes, productos finales metabólicos y microorganismos se elimina continuamente a la misma velocidad para mantener constante el volumen de cultivo. ^{[2] [3]} Al cambiar la velocidad con la que se añade el medio al biorreactor, la tasa de crecimiento específica del microorganismo se puede controlar fácilmente dentro de ciertos límites.

Operación

Estado estable

Una de las características más importantes de los quimiostatos es que los microorganismos pueden crecer en un estado fisiológico estable bajo condiciones ambientales constantes. En este estado estable, el crecimiento ocurre a una tasa de crecimiento específica constante y todos los parámetros de cultivo permanecen constantes (volumen de cultivo, concentración de oxígeno disuelto, concentraciones de nutrientes y productos, pH, densidad celular, etc.). Además, las condiciones ambientales pueden ser controladas por el experimentador. ^[4] Los microorganismos que crecen en quimiostatos generalmente alcanzan un estado estable debido a una retroalimentación negativa entre la tasa de crecimiento y el consumo de nutrientes: si hay un bajo número de células presentes en el biorreactor, las células pueden crecer a tasas de crecimiento más altas que la tasa de dilución ya que consumen poco nutriente, por lo que el crecimiento está menos limitado por la adición de nutriente limitante con el medio fresco entrante. El nutriente limitante es un nutriente esencial para el crecimiento, presente en el medio en una concentración limitante (todos los demás nutrientes generalmente se suministran en exceso). Sin embargo, cuanto mayor sea el número de células, más nutriente se consume, lo que reduce la concentración del nutriente limitante. A su vez, esto reducirá la tasa de crecimiento específico de las células, lo que conducirá a una disminución en el número de células a medida que se siguen eliminando del sistema con el flujo de salida. Esto da como resultado un estado estable. Debido a la autorregulación, el estado estable es estable. Esto permite al experimentador controlar la tasa de crecimiento específico de los microorganismos modificando la velocidad de la bomba que alimenta el medio fresco al recipiente.

Bien mezclado

Otra característica importante de los quimiostatos y otros sistemas de cultivo continuo es que están bien mezclados, de modo que las condiciones ambientales son homogéneas o uniformes y los microorganismos se dispersan aleatoriamente y se encuentran entre sí de forma aleatoria. Por lo tanto, la competencia y otras interacciones en el quimiostato son globales, a diferencia de las biopelículas .

Tasa de dilución

La tasa de intercambio de nutrientes se expresa como la tasa de dilución  D . En estado estacionario, la tasa de crecimiento específica  μ del microorganismo es igual a la tasa de dilución  D . La tasa de dilución se define como el flujo de medio por unidad de tiempo, F , sobre el volumen  V de cultivo en el biorreactor.

${\displaystyle D={\frac {\text{medium flow rate}}{\text{culture volume}}}={\frac {F}{V}}}$

Tasa máxima de crecimiento y tasa crítica de dilución

La tasa de crecimiento específica  μ está inversamente relacionada con el tiempo que tarda la biomasa en duplicarse, llamado tiempo de duplicación  t _d , por:

${\displaystyle \mu ={\frac {\ln 2}{t_{d}}}}$

Por lo tanto, el tiempo de duplicación t _d se convierte en una función de la tasa de dilución  D en estado estacionario:

${\displaystyle t_{d}={\frac {\ln 2}{D}}}$

Cada microorganismo que crece en un sustrato particular tiene una tasa máxima de crecimiento específico μmax (la tasa de crecimiento observada si el crecimiento está limitado por restricciones internas en lugar de nutrientes externos). Si se elige una tasa de dilución que sea mayor que _μmax , las células no pueden crecer a una velocidad tan rápida como la velocidad con la que se las está eliminando _, por lo que el cultivo no podrá mantenerse en el biorreactor y se lavará.

Sin embargo, dado que la concentración del nutriente limitante en el quimiostato no puede superar la concentración en el alimento, la tasa de crecimiento específico que las células pueden alcanzar en el quimiostato suele ser ligeramente inferior a la tasa de crecimiento específico máxima, porque la tasa de crecimiento específico suele aumentar con la concentración de nutrientes, como se describe en la cinética de la ecuación de Monod . ^{[ cita requerida ]} Las tasas de crecimiento específico más altas ( μ _max ) que las células pueden alcanzar son iguales a la tasa de dilución crítica ( D' _c ):

${\displaystyle D=\mu _{\max }{S \over K_{S}+S},}$

donde S es la concentración de sustrato o nutriente en el quimiostato y K _S es la constante de semisaturación (esta ecuación supone una cinética Monod).

Aplicaciones

Investigación

Los quimiostatos se utilizan en la investigación para realizar investigaciones en biología celular, como fuente de grandes volúmenes de células o proteínas uniformes. El quimiostato se utiliza a menudo para recopilar datos de estado estable sobre un organismo con el fin de generar un modelo matemático relacionado con sus procesos metabólicos. Los quimiostatos también se utilizan como microcosmos en ecología ^{[5] [6]} y biología evolutiva. ^{[7] [8] [9] [10]} En un caso, la mutación/selección es una molestia, en el otro caso, es el proceso deseado en estudio. Los quimiostatos también se pueden utilizar para enriquecer tipos específicos de mutantes bacterianos en cultivo, como auxótrofos o aquellos que son resistentes a antibióticos o bacteriófagos para estudios científicos posteriores. ^[11] Las variaciones en la tasa de dilución permiten el estudio de las estrategias metabólicas seguidas por los organismos a diferentes tasas de crecimiento. ^{[12] [13]}

La competencia por recursos individuales y múltiples, la evolución de las vías de adquisición y utilización de recursos, la alimentación cruzada/simbiosis, ^{[14] [15]} el antagonismo, la depredación y la competencia entre depredadores se han estudiado en ecología y biología evolutiva utilizando quimiostatos. ^{[16] [17] [18]}

Industria

Los quimiostatos se utilizan con frecuencia en la fabricación industrial de etanol . En este caso, se utilizan varios quimiostatos en serie, cada uno de ellos mantenido a concentraciones de azúcar decrecientes. ^{[ cita requerida ]} El quimiostato también sirve como modelo experimental de cultivos celulares continuos en la industria biotecnológica. ^{[ 13 ]}

Preocupaciones técnicas

• La formación de espuma produce un desbordamiento con un volumen de líquido que no es exactamente constante.
• Algunas células muy frágiles se rompen durante la agitación y la aireación .
• Las células pueden crecer en las paredes o adherirse a otras superficies, ^[19] lo que se puede solucionar tratando las paredes de vidrio del recipiente con un silano para volverlas hidrófobas. Sin embargo, se seleccionarán células para que se adhieran a las paredes, ya que las que lo hagan no se eliminarán del sistema. Las bacterias que se adhieren firmemente a las paredes formando una biopelícula son difíciles de estudiar en condiciones de quimiostato.
• Es posible que la mezcla no sea totalmente uniforme, alterando la propiedad "estática" del quimiostato.
• Al dejar caer el medio en la cámara se generan pequeños pulsos de nutrientes y, por lo tanto, oscilaciones en las concentraciones, alterando nuevamente la propiedad "estática" del quimiostato.
• Las bacterias se desplazan con bastante facilidad en sentido ascendente y alcanzan rápidamente el depósito de medio estéril, a menos que el recorrido del líquido se interrumpa por una interrupción de aire en la que el medio caiga en gotas a través del aire.

Los esfuerzos continuos por solucionar cada defecto conducen a variaciones del quimiostato básico con bastante regularidad. Hay numerosos ejemplos en la literatura.

• Los agentes antiespumantes se utilizan para suprimir la formación de espuma.
• La agitación y la aireación se pueden realizar con suavidad.
• Se han adoptado muchos enfoques para reducir el crecimiento de las paredes ^{[20] [21]}
• Varias aplicaciones utilizan paletas, burbujeo u otros mecanismos para mezclar ^[22]
• El goteo se puede hacer menos drástico con gotas más pequeñas y volúmenes de recipientes más grandes.
• Muchas mejoras apuntan a la amenaza de la contaminación

Consideraciones sobre el diseño experimental

Elección y configuración de parámetros

^[23]

• La concentración en estado estacionario del sustrato limitante en el quimiostato es independiente de la concentración de entrada. La concentración de entrada afectará la concentración celular y, por lo tanto, la DO en estado estacionario.
• Aunque la concentración limitante del sustrato en el quimiostato suele ser muy baja y se mantiene mediante pulsos de entrada discretos y altamente concentrados, en la práctica la variación temporal de la concentración dentro del quimiostato es pequeña (un pequeño porcentaje o menos) y, por lo tanto, puede considerarse como un estado cuasi estable.
• El tiempo que tarda la densidad celular (DO) en converger a un valor de estado estable (sobrepasar/subpasar) suele ser largo (múltiples cambios de quimiostato), especialmente cuando el inóculo inicial es grande. Sin embargo, el tiempo se puede minimizar con la elección adecuada de los parámetros.

Crecimiento en estado estacionario

^[23]

• Un quimiostato puede parecer estar en estado estable, pero las cepas mutantes pueden tomar el control de manera continua, incluso si no son detectables al monitorear parámetros de escala macro como la DO o las concentraciones del producto.
• El sustrato limitante suele estar en concentraciones tan bajas que es indetectable. Como resultado, la concentración del sustrato limitante puede variar mucho con el tiempo (en términos porcentuales) a medida que diferentes cepas se apoderan de la población, incluso si los cambios resultantes en la DO son demasiado pequeños para detectarlos.
• Un quimiostato “pulsado” (con pulsos de entrada muy grandes) tiene una capacidad selectiva sustancialmente menor que un quimiostato cuasi continuo estándar, para una cepa mutante con mayor aptitud en condiciones limitantes.
• Al reducir abruptamente la concentración de sustrato limitante de entrada, es posible someter temporalmente las células a condiciones relativamente más duras, hasta que el quimiostato se estabilice nuevamente al estado estable (en el orden de tiempo de la tasa de dilución D).

Mutación

^[23]

• Algunos tipos de cepas mutantes aparecerán rápidamente:
  • Si hay un SNP que puede aumentar la aptitud, debería aparecer en la población después de sólo unas pocas duplicaciones de quimiostatos, para quimiostatos característicamente grandes (por ejemplo, 10^11 células de E. coli ).
  • Es probable que una cepa que requiere dos SNP específicos donde solo su combinación otorga una ventaja de aptitud (mientras que cada uno por separado es neutral) aparezca solo si el tamaño objetivo (la cantidad de ubicaciones de SNP diferentes que dan lugar a una mutación ventajosa) para cada SNP es muy grande.
• Es muy poco probable que aparezcan otros tipos de cepas mutantes (por ejemplo, dos SNP con un tamaño de objetivo pequeño, más SNP o en quimiostatos más pequeños).
  • Estas otras mutaciones se esperan sólo a través de sucesivas invasiones de mutantes con una ventaja de aptitud. Sólo se puede esperar que surjan múltiples mutantes si cada mutación es beneficiosa independientemente, y no en casos en que las mutaciones son individualmente neutrales pero juntas ventajosas. Las invasiones sucesivas son la única forma confiable de que la evolución avance en un quimiostato.
• El escenario aparentemente extremo en el que necesitamos que todos los SNP posibles coexistan al menos una vez en el quimiostato es en realidad bastante probable. Es muy probable que un quimiostato grande alcance este estado.
• En el caso de un quimiostato grande, el tiempo esperado hasta que se produce una mutación ventajosa es del orden del tiempo de recambio del quimiostato. Cabe señalar que este tiempo suele ser sustancialmente más corto que el tiempo que tarda una cepa ventajosa en apoderarse de la población de quimiostatos. Esto no es necesariamente así en un quimiostato pequeño.
• Se espera que los puntos anteriores sean los mismos en diferentes especies con reproducción asexual ( E. coli , S. cerevisiae , etc.).
• Además, el tiempo hasta la aparición de la mutación es independiente del tamaño del genoma, pero depende de la tasa de mutación por BP.
• En el caso de quimiostatos de gran tamaño, una cepa hipermutante no ofrece una ventaja suficiente como para justificar su uso. Además, no tiene una ventaja selectiva suficiente como para esperar que siempre aparezca mediante una mutación aleatoria y se apodere del quimiostato.

Adquisición única

^[23]

• El tiempo de adquisición es predecible dados los parámetros de tensión relevantes.
• Diferentes tasas de dilución favorecen selectivamente que distintas cepas mutantes se apoderen de la población de quimiostatos, si es que existe dicha cepa. Por ejemplo:
  • Una tasa de dilución rápida crea una presión de selección para una cepa mutante con una tasa de crecimiento máxima elevada;
  • Una tasa de dilución de rango medio crea una presión de selección para una cepa mutante con una mayor afinidad al sustrato limitante;
  • Una tasa de dilución lenta crea una presión de selección para una cepa mutante que puede crecer en medios sin sustrato limitante (presumiblemente consumiendo un sustrato diferente presente en el medio);
• El tiempo que tarda un mutante superior en tomar el control será bastante constante en una variedad de parámetros operativos. Para valores operativos característicos, el tiempo de toma de control es del orden de días a semanas.

Adquisiciones sucesivas

^[23]

• Cuando las condiciones son las adecuadas (una población lo suficientemente grande y múltiples objetivos en el genoma para mutaciones ventajosas simples), se espera que múltiples cepas se apoderen sucesivamente de la población, y que lo hagan de una manera relativamente cronometrada y a un ritmo determinado. El momento depende del tipo de mutaciones.
• En una sucesión de adquisiciones, incluso si la mejora selectiva de cada una de las cepas permanece constante (por ejemplo, cada nueva cepa es mejor que la cepa anterior por un factor constante), la tasa de adquisición no permanece constante, sino que disminuye de una cepa a otra.
• Hay casos en los que las sucesivas adquisiciones se producen tan rápidamente que es muy difícil diferenciar entre cepas, incluso al examinar la frecuencia de los alelos. Por lo tanto, un linaje de múltiples adquisiciones de cepas consecutivas podría aparecer como la adquisición de una única cepa con una cohorte de mutaciones.

Variaciones

Los sistemas de fermentación estrechamente relacionados con los quimiostatos son el turbidostato , el auxostato y el retentostato. En los retentostatos, el líquido de cultivo también se retira del biorreactor, pero un filtro retiene la biomasa. En este caso, la concentración de biomasa aumenta hasta que el requerimiento de nutrientes para el mantenimiento de la biomasa se vuelve igual a la cantidad de nutrientes limitantes que se pueden consumir.

Véase también

• Crecimiento bacteriano
• Ingeniería bioquímica
• Cambio de estado
• Reactor de tanque agitado continuo (CSTR)
• Experimento de evolución a largo plazo de E. coli
• Lote de alimentación

Referencias

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Enlaces externos

1. http://www.pererikstrandberg.se/examensarbete/chemostat.pdf
2. https://web.archive.org/web/20060504172359/http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/Contin/chemosta.htm
3. Tesis final que incluye modelos matemáticos del quimiostato y otros biorreactores.
4. Una página sobre el diseño de un quimiostato de laboratorio
5. Manual completo del quimiostato (laboratorio Dunham). Los procedimientos y principios son generales.