Las ureasas ( EC 3.5.1.5), funcionalmente, pertenecen a la superfamilia de amidohidrolasas y fosfotriesterasas. [2] Las ureasas se encuentran en numerosas bacterias , hongos , algas , plantas y algunos invertebrados , así como en los suelos, como enzima del suelo . Son metaloenzimas que contienen níquel y de alto peso molecular. [3]
Estas enzimas catalizan la hidrólisis de la urea en dióxido de carbono y amoníaco :
La hidrólisis de la urea se produce en dos etapas. En la primera etapa se producen amoníaco y ácido carbámico . El carbamato se hidroliza espontánea y rápidamente a amoníaco y ácido carbónico . La actividad de la ureasa aumenta el pH de su entorno a medida que se produce amoníaco, que es básico.
Su actividad fue identificada por primera vez en 1876 por Frédéric Alphonse Musculus como fermento soluble. [4] En 1926, James B. Sumner , demostró que la ureasa es una proteína examinando su forma cristalizada. [5] El trabajo de Sumner fue la primera demostración de que una proteína puede funcionar como una enzima y finalmente condujo al reconocimiento de que la mayoría de las enzimas son, de hecho, proteínas. La ureasa fue la primera enzima cristalizada. Por este trabajo, Sumner recibió el Premio Nobel de Química en 1946. [6] La estructura cristalina de la ureasa fue resuelta por primera vez por PA Karplus en 1995. [5]
Un estudio de 1984 centrado en la ureasa de la haba encontró que el sitio activo contiene un par de centros de níquel . [7] La activación in vitro también se ha logrado con manganeso y cobalto en lugar de níquel. [8] Las sales de plomo son inhibidoras .
El peso molecular es 480 kDa o 545 kDa para la ureasa de frijol (masa calculada a partir de la secuencia de aminoácidos). 840 aminoácidos por molécula, de los cuales 90 son residuos de cisteína. [9]
El pH óptimo es 7,4 y la temperatura óptima es 60 °C. Los sustratos incluyen urea e hidroxiurea .
Las ureasas bacterianas se componen de tres subunidades distintas, una catalítica grande (α 60–76 kDa) y dos pequeñas (β 8–21 kDa, γ 6–14 kDa) que comúnmente forman (αβγ) una estequiometría de 3 trímeros con una estructura simétrica doble ( tenga en cuenta que la imagen de arriba muestra la estructura de la unidad asimétrica, un tercio del verdadero conjunto biológico), son enzimas ricas en cisteína, lo que da como resultado masas molares de la enzima entre 190 y 300 kDa. [9]
Una ureasa excepcional se obtiene de Helicobacter sp. Estas están compuestas por dos subunidades, α(26–31 kDa)-β(61–66 kDa). Estas subunidades forman un complejo dodecamérico supramolecular (αβ) 12 . [10] de subunidades α-β repetidas, cada par de subunidades acopladas tiene un sitio activo, para un total de 12 sitios activos. [10] Desempeña una función esencial para la supervivencia, neutralizando el ácido gástrico al permitir que la urea ingrese al periplasma a través de un canal de urea activado por protones . [11] La presencia de ureasa se utiliza en el diagnóstico de especies de Helicobacter .
Todas las ureasas bacterianas son únicamente citoplasmáticas, excepto las de Helicobacter pylori , que junto con su actividad citoplasmática, tiene actividad externa con las células huésped. Por el contrario, todas las ureasas vegetales son citoplasmáticas. [9]
Las ureasas de hongos y plantas están formadas por subunidades idénticas (~90 kDa cada una), más comúnmente ensambladas como trímeros y hexámeros. Por ejemplo, la ureasa de frijol tiene dos subunidades estructurales y una catalítica. La subunidad α contiene el sitio activo, está compuesta por 840 aminoácidos por molécula (90 cisteínas), su masa molecular sin iones Ni(II) asciende a 90,77 kDa. La masa del hexámero con los 12 iones de níquel es de 545,34 kDa. Otros ejemplos de estructuras homohexaméricas de ureasas vegetales son las enzimas de la soja, el gandul y las semillas de algodón. [9]
Es importante señalar que, aunque están compuestas por diferentes tipos de subunidades, las ureasas de diferentes fuentes, que se extienden desde bacterias hasta plantas y hongos, exhiben una alta homología de secuencias de aminoácidos. La cadena única de ureasa vegetal es equivalente a una organización γ-β-α fusionada. El Helicobacter "α" es equivalente a una fusión de las subunidades γ-β bacterianas normales, mientras que su subunidad "β" es equivalente a la α bacteriana normal. [9] La organización de tres cadenas probablemente sea ancestral. [12]
El k cat / K m de ureasa en el procesamiento de urea es 10 14 veces mayor que la velocidad de la reacción de eliminación no catalizada de urea . [5] Hay muchas razones para esta observación en la naturaleza. La proximidad de la urea a los grupos activos en el sitio activo junto con la orientación correcta de la urea permiten que la hidrólisis se produzca rápidamente. La urea por sí sola es muy estable debido a las formas de resonancia que puede adoptar. Se entiende que la estabilidad de la urea se debe a su energía de resonancia , que se ha estimado en 30 a 40 kcal/mol. [5] Esto se debe a que las formas de resonancia zwitteriónica donan electrones al carbono carbonilo , lo que lo hace menos electrófilo y, por lo tanto, menos reactivo al ataque nucleofílico. [5]
El sitio activo de las ureasas se localiza en las subunidades α (alfa) . Es un centro de níquel bis-μ-hidroxodimérico , con una distancia interatómica de ~3,5 Å. [5] > El par Ni(II) está débilmente acoplado antiferromagnéticamente . [13] Los estudios de espectroscopia de absorción de rayos X (XAS) de Canavalia ensiformis (judía), Klebsiella aerogenes y Sporosarcina pasturii (anteriormente conocida como Bacillus pasturii ) [14] confirman 5-6 iones de níquel coordinados con ligadura exclusivamente O/N, incluyendo dos ligandos de imidazol por níquel. [8] Se propone un sustrato de urea para desplazar los ligandos acuosos .
Las moléculas de agua ubicadas hacia la apertura del sitio activo forman un grupo tetraédrico que llena el sitio de la cavidad a través de enlaces de hidrógeno . Se propone que algunos residuos de aminoácidos formen un colgajo móvil del sitio, que sirve de puerta para el sustrato. [3] Los residuos de cisteína son comunes en la región de la aleta de las enzimas, que se ha determinado que no son esenciales en la catálisis, aunque participan en el posicionamiento apropiado de otros residuos clave en el sitio activo. [15] En la ureasa de Sporosarcina pasteurii , el colgajo se encontró en la conformación abierta, mientras que su conformación cerrada aparentemente es necesaria para la reacción. [14]
En comparación, las subunidades α de la ureasa de Helicobacter pylori y otras ureasas bacterianas se alinean con las ureasas de frijol. [15]
No se ha observado la unión de la urea al sitio activo de la ureasa. [9]
Blakely y Zerner propusieron un mecanismo para la catálisis de esta reacción mediante la ureasa. [16] Comienza con un ataque nucleofílico por parte del oxígeno carbonílico de la molécula de urea sobre la coordenada 5 Ni (Ni-1). En su lugar se desplaza un ligando de agua débilmente coordinado. Un par solitario de electrones de uno de los átomos de nitrógeno de la molécula de urea crea un doble enlace con el carbono central, y el NH 2 − resultante del sustrato coordinado interactúa con un grupo cercano con carga positiva. Blakeley y Zerner propusieron que este grupo cercano fuera un ion carboxilato , aunque los carboxilatos desprotonados tienen carga negativa.
Un ligando de hidróxido en el Ni de seis coordenadas es desprotonado por una base. A continuación, el carbono carbonílico es atacado por el oxígeno electronegativo. Un par de electrones del doble enlace nitrógeno-carbono regresa al nitrógeno y neutraliza la carga en él, mientras que el carbono, ahora de 4 coordenadas, asume una orientación tetraédrica intermedia.
La descomposición de este intermediario se ve favorecida por un grupo sulfhidrilo de una cisteína ubicado cerca del sitio activo. Un hidrógeno se une a uno de los átomos de nitrógeno, rompiendo su enlace con el carbono y liberando una molécula de NH 3 . Al mismo tiempo se rompe el enlace entre el oxígeno y el níquel de 6 coordenadas. Esto deja un ion carbamato coordinado con la coordenada 5 Ni, que luego es desplazado por una molécula de agua, regenerando la enzima.
El carbamato producido se degrada espontáneamente para producir otro amoníaco y ácido carbónico . [17]
El mecanismo propuesto por Hausinger y Karplus intenta revisar algunas de las cuestiones evidentes en la vía de Blakely y Zerner y se centra en las posiciones de las cadenas laterales que forman la bolsa de unión de urea. [5] A partir de las estructuras cristalinas de la ureasa de K. aerogenes , se argumentó que la base general utilizada en el mecanismo de Blakely, His 320 , estaba demasiado lejos del agua unida a Ni2 para desprotonarse y formar el resto hidróxido atacante. Además, no se identificó el ligando ácido general necesario para protonar el nitrógeno ureico. [18] Hausinger y Karplus sugieren un esquema de protonación inversa, donde una forma protonada del ligando His 320 desempeña el papel del ácido general y el agua unida a Ni2 ya está en el estado desprotonado. [5] El mecanismo sigue el mismo camino, con la base general omitida (ya que ya no es necesaria) y His 320 donando su protón para formar la molécula de amoníaco, que luego se libera de la enzima. Si bien la mayoría de los ligandos His 320 y el agua unida no estarán en sus formas activas (protonados y desprotonados, respectivamente), se calculó que aproximadamente el 0,3% de la enzima ureasa total estaría activa en cualquier momento. [5] Si bien, lógicamente, esto implicaría que la enzima no es muy eficiente, contrariamente al conocimiento establecido, el uso del esquema de protonación inversa proporciona una ventaja en cuanto a una mayor reactividad para la forma activa, lo que compensa la desventaja. [5] La colocación del ligando His 320 como componente esencial en el mecanismo también tiene en cuenta la región del colgajo móvil de la enzima. Como este ligando de histidina es parte del colgajo móvil, la unión del sustrato de urea para la catálisis cierra este colgajo sobre el sitio activo y con la adición del patrón de enlaces de hidrógeno a la urea desde otros ligandos en el bolsillo, habla de la selectividad de la ureasa. enzima para la urea. [5]
El mecanismo propuesto por Ciurli y Mangani [19] es una de las opiniones más recientes y actualmente aceptadas sobre el mecanismo de la ureasa y se basa principalmente en las diferentes funciones de los dos iones de níquel en el sitio activo. [14] Uno de los cuales se une y activa la urea, el otro ion níquel se une y activa la molécula de agua nucleofílica. [14] Con respecto a esta propuesta, la urea ingresa a la cavidad del sitio activo cuando el 'flap' móvil (que permite la entrada de urea al sitio activo) está abierto. La estabilidad de la unión de la urea al sitio activo se logra mediante una red de enlaces de hidrógeno , orientando el sustrato hacia la cavidad catalítica. [14] La urea se une al níquel cinco coordinado (Ni1) con el átomo de oxígeno del carbonilo . Se acerca con uno de sus grupos amino al níquel de seis coordenadas (Ni2) y posteriormente une los dos centros de níquel. [14] La unión del átomo de oxígeno del carbonilo de la urea al Ni1 se estabiliza mediante el estado de protonación de His α222 N. Además, el cambio conformacional del estado abierto al cerrado del flap móvil genera un reordenamiento del grupo carbonilo Ala α222 de tal manera que su átomo de oxígeno apunta a Ni2. [14] El Ala α170 y el Ala α366 ahora están orientados de manera que sus grupos carbonilo actúan como aceptores de enlaces de hidrógeno hacia el grupo NH 2 de la urea, ayudando así a su unión al Ni2. [14] La urea es un ligando quelante muy pobre debido al bajo carácter de base de Lewis de sus grupos NH2 . Sin embargo, los oxígenos carbonílicos de Ala α170 y Ala α366 mejoran la basicidad de los grupos NH2 y permiten la unión a Ni2. [14] Por lo tanto, en este mecanismo propuesto, el posicionamiento de la urea en el sitio activo es inducido por las características estructurales de los residuos del sitio activo que están posicionados para actuar como donantes de enlaces de hidrógeno en las proximidades de Ni1 y como aceptores en las proximidades. de Ni2. [14] La principal diferencia estructural entre el mecanismo Ciurli/Mangani y los otros dos es que incorpora una urea puente de nitrógeno y oxígeno que es atacada por un hidróxido puente . [17]
Las ureasas bacterianas suelen ser el modo de patogénesis de muchas afecciones médicas. Se asocian con encefalopatía hepática / coma hepático , cálculos infecciosos y ulceración péptica. [20]
Los cálculos urinarios inducidos por infección son una mezcla de estruvita (MgNH 4 PO 4 •6H 2 O) y carbonato de apatita [Ca 10 (PO 4 )6•CO 3 ]. [20] Estos iones polivalentes son solubles pero se vuelven insolubles cuando se produce amoníaco a partir de la ureasa microbiana durante la hidrólisis de la urea , ya que esto aumenta el pH del ambiente circundante de aproximadamente 6,5 a 9. [20] La alcalinización resultante da como resultado la cristalización de la piedra . [20] En los seres humanos, la ureasa microbiana, Proteus mirabilis , es la más común en los cálculos urinarios inducidos por infección. [21]
Los estudios han demostrado que Helicobacter pylori junto con la cirrosis hepática causan encefalopatía hepática y coma hepático . [22] Helicobacter pylori libera ureasas microbianas en el estómago. La ureasa hidroliza la urea para producir amoníaco y ácido carbónico . A medida que las bacterias se localizan en el estómago, el sistema circulatorio absorbe fácilmente el amoníaco producido desde la luz gástrica . [22] Esto da como resultado niveles elevados de amoníaco en la sangre, una condición conocida como hiperamonemia ; La erradicación de Helicobacter pylori muestra marcadas disminuciones en los niveles de amoníaco . [22]
Helicobacter pylori también es la causa de úlceras pépticas y se manifiesta en 55 a 68% de los casos reportados. [23] Esto se confirmó por la disminución del sangrado de la úlcera y la recurrencia de la úlcera después de la erradicación del patógeno . [23] En el estómago hay un aumento en el pH del revestimiento mucoso como resultado de la hidrólisis de la urea , que impide el movimiento de iones de hidrógeno entre las glándulas gástricas y la luz gástrica . [20] Además, las altas concentraciones de amoníaco tienen un efecto sobre las uniones estrechas intercelulares , aumentando la permeabilidad y también alterando la membrana mucosa gástrica del estómago. [20] [24]
La urea se encuentra de forma natural en el medio ambiente y también se introduce artificialmente, y constituye más de la mitad de todos los fertilizantes nitrogenados sintéticos utilizados a nivel mundial. [25] Se cree que el uso intensivo de urea promueve la eutrofización , a pesar de la observación de que la urea se transforma rápidamente por las ureasas microbianas y, por lo tanto, generalmente no persiste. [26] La actividad de la ureasa ambiental a menudo se mide como un indicador de la salud de las comunidades microbianas. En ausencia de plantas, la actividad de la ureasa en el suelo generalmente se atribuye a microorganismos heterótrofos, aunque se ha demostrado que algunas bacterias quimioautótrofas oxidantes de amonio son capaces de crecer sobre la urea como única fuente de carbono, nitrógeno y energía. [27]
La inhibición de la ureasa es un objetivo importante en la agricultura porque la rápida descomposición de los fertilizantes a base de urea es un desperdicio y perjudicial para el medio ambiente. [28] El fosforodiamidato de fenilo y la triamida N-(n-butil)tiofosfórica son dos de esos inhibidores. [29]
Al promover la formación de carbonato de calcio , las ureasas son potencialmente útiles para procesos inspirados en la biomineralización . [30] En particular, la formación de carbonato de calcio inducida microbiológicamente se puede utilizar para fabricar biohormigón . [31]
Además de actuar como enzima, algunas ureasas (especialmente las vegetales) tienen efectos adicionales que persisten incluso cuando la función catalítica está desactivada. Estos incluyen entomotoxicidad, inhibición de hongos, neurotoxicidad en mamíferos, promoción de endocitosis y producción de eicosanoides inflamatorios en mamíferos e inducción de quimiotaxis en bacterias. Estas actividades pueden ser parte de un mecanismo de defensa. [12]
La toxicidad de la ureasa contra los insectos se observó originalmente en la canatoxina, una isoforma ortóloga de la ureasa de frijol. La digestión del péptido identificó una porción de 10 kDa más responsable de este efecto, denominada jaburetox. Una porción similar de la ureasa de soja se llama soyuretox. Sin embargo, los estudios en insectos muestran que toda la proteína es tóxica sin necesidad de digestión. Sin embargo, los péptidos "uretox", al tener una toxicidad más concentrada, se muestran prometedores como biopesticidas . [12]
Muchos patógenos del tracto gastrointestinal o urinario producen ureasa, lo que permite utilizar la detección de ureasa como diagnóstico para detectar la presencia de patógenos.
Los patógenos positivos para ureasa incluyen:
Se conoce una amplia gama de inhibidores de la ureasa de diferentes familias estructurales. La inhibición de la ureasa no sólo es de interés para la agricultura, sino también para la medicina, ya que patógenos como H. pylori producen ureasa como mecanismo de supervivencia. Las clases estructurales conocidas de inhibidores incluyen: [33] [34]
Aislado por primera vez como cristal en 1926 por Sumner, mediante solvatación con acetona y centrifugación. [36] La bioquímica moderna ha aumentado su demanda de ureasa. La harina de frijol , [37] las semillas de sandía , [38] y las semillas de guisantes [39] han demostrado ser fuentes útiles de ureasa.
