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Silenciamiento de ARN

El silenciamiento de ARN o la interferencia de ARN se refieren a una familia de efectos de silenciamiento de genes por los cuales la expresión génica es regulada negativamente por ARN no codificantes como los microARN . El silenciamiento de ARN también puede definirse como la regulación específica de la secuencia de la expresión génica desencadenada por ARN bicatenario ( dsRNA ). [1] Los mecanismos de silenciamiento de ARN se conservan entre la mayoría de los eucariotas . [2] El ejemplo más común y bien estudiado es la interferencia de ARN ( RNAi ), en la que el microARN expresado endógenamente ( miRNA ) o el ARN interferente pequeño derivado exógenamente ( siRNA ) induce la degradación del ARN mensajero complementario . Se han identificado otras clases de ARN pequeño, incluido el ARN que interactúa con piwi ( piRNA ) [3] y su subespecie, el ARN interferente pequeño asociado a la repetición ( rasiRNA ). [4]

Fondo

El silenciamiento de ARN describe varias vías relacionadas mecánicamente que están involucradas en el control y regulación de la expresión génica. [5] [6] [7] Las vías de silenciamiento de ARN están asociadas con la actividad reguladora de ARN pequeños no codificantes (aproximadamente de 20 a 30 nucleótidos de longitud) que funcionan como factores involucrados en la inactivación de secuencias homólogas, promoviendo la actividad de endonucleasa, el arresto de la traducción y/o la modificación cromática o del ADN. [8] [9] [10] En el contexto en el que se estudió el fenómeno por primera vez, se encontró que el ARN pequeño desempeñaba un papel importante en la defensa de las plantas contra los virus. Por ejemplo, estos estudios demostraron que las enzimas detectan el ARN bicatenario ( dsRNA ) que normalmente no se encuentra en las células y lo digieren en pequeños trozos que no pueden causar enfermedades. [11] [12] [13] [14] [2]

Aunque se conocen algunas funciones del silenciamiento del ARN y su mecanismo, muchas otras no. Por ejemplo, se ha demostrado que el silenciamiento del ARN es importante en la regulación del desarrollo y en el control de los eventos de transposición. [15] Se ha demostrado que el silenciamiento del ARN desempeña un papel en la protección antiviral en plantas e insectos. [16] También en la levadura, se ha demostrado que el silenciamiento del ARN mantiene la estructura de la heterocromatina. [17] Sin embargo, el papel variado y matizado del silenciamiento del ARN en la regulación de la expresión génica sigue siendo una investigación científica en curso. Se ha propuesto una gama de funciones diversas para un número creciente de secuencias de ARN pequeñas caracterizadas, por ejemplo, regulación del desarrollo, destino celular neuronal, muerte celular, proliferación, almacenamiento de grasa, destino celular hematopoyético, secreción de insulina. [18]

El silenciamiento del ARN funciona reprimiendo la traducción o escindiendo el ARN mensajero ( ARNm ), dependiendo de la cantidad de complementariedad del apareamiento de bases. El ARN se ha investigado en gran medida en su papel como intermediario en la traducción de genes a proteínas. [19] Sin embargo, las funciones reguladoras más activas solo comenzaron a ser abordadas por los investigadores a fines de la década de 1990. [20] El estudio de referencia que proporcionó una comprensión del primer mecanismo identificado fue publicado en 1998 por Fire et al. [1] , demostrando que el ARN bicatenario podría actuar como un desencadenante para el silenciamiento génico. [20] Desde entonces, se han identificado y caracterizado varias otras clases de silenciamiento del ARN. [5] Actualmente, se está explorando el potencial terapéutico de estos descubrimientos, por ejemplo, en el contexto de la terapia génica dirigida. [21] [22]

Si bien el silenciamiento de ARN es una clase de mecanismos en evolución, un tema común es la relación fundamental entre los ARN pequeños y la expresión génica. [9] También se ha observado que las principales vías de silenciamiento de ARN identificadas actualmente tienen mecanismos de acción que pueden involucrar tanto el silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) [23] como las vías de silenciamiento génico dependiente de la cromatina (CDGS). [5] El CDGS involucra el ensamblaje de pequeños complejos de ARN en transcripciones nacientes y se considera que abarca mecanismos de acción que implican eventos de silenciamiento génico transcripcional (TGS) y silenciamiento génico cotranscripcional (CTGS). [24] Esto es significativo al menos porque la evidencia sugiere que los ARN pequeños juegan un papel en la modulación de la estructura de la cromatina y el TGS. [25] [26]

A pesar de que en un principio la literatura se centró en la interferencia del ARN ( ARNi ) como un mecanismo central que se produce a nivel de la traducción del ARN mensajero, desde entonces se han identificado otros en la familia más amplia de vías de silenciamiento del ARN conservadas que actúan a nivel del ADN y la cromatina. [27] El silenciamiento del ARN se refiere a la actividad de silenciamiento de una variedad de ARN pequeños y generalmente se considera una categoría más amplia que el ARNi. Si bien en ocasiones los términos se han utilizado indistintamente en la literatura, el ARNi generalmente se considera una rama del silenciamiento del ARN. En la medida en que sea útil elaborar una distinción entre estos conceptos relacionados, se puede pensar que el silenciamiento del ARN se refiere al esquema más amplio de controles relacionados con el ARN pequeño que intervienen en la expresión génica y la protección del genoma contra secuencias de ADN repetitivas móviles, retroelementos y transposones en la medida en que estos puedan inducir mutaciones. [28] Los mecanismos moleculares para el silenciamiento del ARN se estudiaron inicialmente en plantas [13] , pero desde entonces se han ampliado para cubrir una variedad de temas, desde hongos hasta mamíferos, lo que proporciona evidencia sólida de que estas vías están altamente conservadas. [29]

Hasta el momento se han identificado al menos tres clases principales de ARN pequeño, a saber: ARN pequeño de interferencia ( siRNA ), microARN ( miRNA ) y ARN que interactúa con piwi ( piRNA ).

ARN interferente pequeño (siRNA)

Los siRNA actúan en el núcleo y el citoplasma y están involucrados en el RNAi así como en el CDGS. [5] Los siRNA provienen de precursores de dsRNA largos derivados de una variedad de precursores de ARN monocatenario (ssRNA), como los ARN sentido y antisentido. Los siRNA también provienen de ARN en horquilla derivados de la transcripción de regiones repetidas invertidas. Los siRNA también pueden surgir enzimáticamente de precursores de ARN no codificantes. [30] El volumen de literatura sobre siRNA dentro del marco del RNAi es extenso. Una de las potentes aplicaciones de los siRNA es la capacidad de distinguir la secuencia objetivo de la secuencia no objetivo con una diferencia de un solo nucleótido. Este enfoque se ha considerado terapéuticamente crucial para el silenciamiento de los trastornos de ganancia de función (GOF) dominantes, donde el alelo mutante que causa la enfermedad se diferencia del alelo wt por un solo nucleótido (nt). Este tipo de siRNA con capacidad para distinguir una diferencia de un solo nt se denominan siRNA específicos de alelo. [31]

microARN (miARN)

La mayoría de los miRNA actúan en el citoplasma y median la degradación del ARNm o el arresto de la traducción. [32] Sin embargo, se ha demostrado que algunos miRNA de plantas actúan directamente para promover la metilación del ADN. [33] Los miRNA provienen de precursores de horquilla generados por las enzimas ARNasa III Drosha y Dicer . [34] Tanto el miRNA como el siRNA forman el complejo de silenciamiento inducido por ARN ( RISC ) o la forma nuclear de RISC conocida como complejo de silenciamiento transcripcional inducido por ARN ( RITS ). [35] El volumen de literatura sobre miRNA en el marco de RNAi es extenso.

Tres regiones principales no traducidas y microARN

Las tres regiones no traducidas principales (3'UTR) de los ARN mensajeros (ARNm) suelen contener secuencias reguladoras que provocan interferencias postranscripcionales en el ARN. Estas 3'-UTR suelen contener tanto sitios de unión para microARN (miARN) como para proteínas reguladoras. Al unirse a sitios específicos dentro de la 3'-UTR, los miARN pueden disminuir la expresión génica de varios ARNm, ya sea inhibiendo la traducción o causando directamente la degradación de la transcripción. La 3'-UTR también puede tener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm.

El 3'-UTR a menudo contiene elementos de respuesta a microARN (MRE) . Los MRE son secuencias a las que se unen los microARN. Estos son motivos predominantes dentro de los 3'-UTR. Entre todos los motivos reguladores dentro de los 3'-UTR (por ejemplo, incluidas las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad de los motivos.

En 2014, el sitio web miRBase [36] , un archivo de secuencias y anotaciones de miRNA , enumeraba 28.645 entradas en 233 especies biológicas. De estas, 1.881 miRNA se encontraban en loci de miRNA humanos anotados. Se predijo que los miRNA tendrían un promedio de alrededor de cuatrocientos ARNm diana (que afectan la expresión de varios cientos de genes). [37] Freidman et al. [37] estiman que >45.000 sitios diana de miRNA dentro de los 3'UTR de ARNm humanos se conservan por encima de los niveles de fondo, y >60% de los genes codificadores de proteínas humanas han estado bajo presión selectiva para mantener el emparejamiento con miRNA.

Experimentos directos muestran que un único miRNA puede reducir la estabilidad de cientos de ARNm únicos. [38] Otros experimentos muestran que un único miRNA puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión a menudo es relativamente leve (menos del doble). [39] [40]

Los efectos de la desregulación de la expresión genética por parte de los microARN parecen ser importantes en el cáncer. [41] Por ejemplo, en los cánceres gastrointestinales, se han identificado nueve microARN alterados epigenéticamente y eficaces para regular negativamente las enzimas de reparación del ADN. [42]

Los efectos de la desregulación de la expresión genética por parte de los miRNA también parecen ser importantes en trastornos neuropsiquiátricos, como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la depresión mayor, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del espectro autista. [43] [44] [45]

ARN que interactúa con piwi (piRNA)

Los piRNA representan la clase más grande de pequeñas moléculas de ARN no codificante expresadas en células animales, derivadas de una gran variedad de fuentes, incluyendo ADN repetitivo y transposones. [46] Sin embargo, la biogénesis de los piRNA también es la menos comprendida. [47] Los piRNA parecen actuar tanto a nivel postranscripcional como de cromatina. Se diferencian de los miRNA debido al menos a un aumento en términos de tamaño y complejidad. Los pequeños ARN interferentes asociados a repeticiones ( rasiRNA ) se consideran una subespecie de piRNA. [4]

Mecanismo

Procesamiento de miRNA

El flujo mecanístico más básico para el silenciamiento de ARN es el siguiente: (Para una explicación más detallada del mecanismo, consulte el artículo RNAi: mecanismo celular ).

1: ARN con construcciones de horquilla/asa de repetición invertida --> 2: ARNbc --> 3: miARN / siARN --> 4: RISC --> 5: Destrucción del ARNm objetivo

  1. Se ha descubierto que el mejor precursor para un buen silenciamiento de ARN es tener ARN antisentido monocatenario con repeticiones invertidas que, a su vez, forman pequeñas construcciones de ARN en horquilla y en forma de asa. [7] Las construcciones en horquilla o en forma de asa existen para que el ARN pueda permanecer independiente y no unirse con otras cadenas de ARN.
  2. Estos pequeños ARN en horquilla y/o en forma de asa se transportan luego desde el núcleo hasta el citosol a través del receptor de exportación nuclear llamado exportina-5, y luego se transforman en un ARN de doble cadena, que, al igual que el ADN, es una serie de nucleótidos de doble cadena . Si el mecanismo no utilizara ARN de doble cadena, sino solo cadenas simples, habría una mayor probabilidad de que se hibridara con otros ARNm "buenos". Como es de doble cadena, se puede mantener disponible para cuando sea necesario.
  3. Luego, el dsRNA es cortado por un Dicer en pequeñas cadenas (de 21 a 28 nt = nucleótidos de longitud) de miRNA ( microRNA ) o siRNA (ARN de interferencia cortos). Un Dicer es una ARNasa endoribonucleasa , que es un complejo de una proteína mezclada con cadenas de ARN.
  4. Por último, los miRNA / siRNA de doble cadena se separan en cadenas simples; la cadena de ARN antisentido de los dos se combinará con otro complejo enzimático endorribonucleasa llamado RISC ( complejo de silenciamiento inducido por ARN ), que incluye el componente catalítico Argonaute , y guiará al RISC para romper el ARNm objetivo "perfectamente complementario" o el ARN genómico viral para que pueda ser destruido. [2] [7]
  5. Esto significa que, en función de una zona específica de secuencia corta, se cortará un ARNm correspondiente. Para asegurarse, también se cortará en muchos otros lugares. (Si el mecanismo solo funcionara con un tramo largo, habría mayores probabilidades de que no tuviera tiempo de coincidir con su ARNm largo complementario). También se ha demostrado que los ARN de interferencia cortos asociados a la repetición ( ARNrsi ) desempeñan un papel en la orientación de la modificación de la cromatina. [2]

Funciones biológicas

Inmunidad contra virus o transposones

El silenciamiento del ARN es el mecanismo que utilizan nuestras células (y las células de todos los reinos ) para luchar contra los virus ARN y los transposones (que se originan en nuestras propias células así como en otros vehículos). [2] En el caso de los virus ARN, estos se destruyen inmediatamente por el mecanismo citado anteriormente. En el caso de los transposones, es un poco más indirecto. Como los transposones se encuentran en diferentes partes del genoma, las diferentes transcripciones de los diferentes promotores producen ARNm complementarios que pueden hibridarse entre sí. Cuando esto sucede, la maquinaria de ARNi entra en acción, debilitando los ARNm de las proteínas que serían necesarias para mover los propios transposones. [48]

Regulación negativa de los genes

Para una explicación detallada de la regulación negativa de los genes, consulte RNAi: regulación negativa de genes

Regulación positiva de los genes

Para una explicación detallada de la regulación positiva de los genes, consulte RNAi: regulación positiva de los genes

El silenciamiento del ARN también se regula

De la misma manera que el silenciamiento del ARN regula los ARNm diana posteriores , el silenciamiento del ARN en sí mismo está regulado. Por ejemplo, las señales de silenciamiento se propagan entre células mediante un grupo de enzimas llamadas RdRP ( ARN polimerasas dependientes de ARN ) o RDR. [2]

Aplicaciones prácticas

La creciente comprensión de los mecanismos de silenciamiento de genes de ARN pequeños que implican la degradación de ARNm específica de secuencia mediada por dsRNA ha tenido un impacto directo en los campos de la genómica funcional, la biomedicina y la biología experimental. La siguiente sección describe varias aplicaciones que involucran los efectos del silenciamiento de ARN. Estas incluyen usos en biotecnología, terapéutica e investigación de laboratorio. Las técnicas de bioinformática también se están aplicando para identificar y caracterizar grandes cantidades de ARN pequeños y sus dianas.

Biotecnología

La introducción artificial de dsRNAs largos o siRNAs se ha adoptado como una herramienta para inactivar la expresión génica, tanto en células cultivadas como en organismos vivos. [2] La resolución estructural y funcional de pequeños RNAs como efectores del silenciamiento de RNA ha tenido un impacto directo en la biología experimental. Por ejemplo, el dsRNA puede sintetizarse para tener una secuencia específica complementaria a un gen de interés. Una vez introducido en una célula o sistema biológico, se reconoce como material genético exógeno y activa la vía de silenciamiento de RNA correspondiente. Este mecanismo puede utilizarse para efectuar disminuciones en la expresión génica con respecto al objetivo, útil para investigar la pérdida de función de los genes en relación con un fenotipo. Es decir, estudiar los efectos fenotípicos y/o fisiológicos de las disminuciones de la expresión puede revelar el papel de un producto génico. Los efectos observables pueden ser matizados, de modo que algunos métodos pueden distinguir entre “knockdown” (disminuir la expresión) y “knockout” (eliminar la expresión) de un gen. [49] Las tecnologías de interferencia de ARN se han señalado recientemente como una de las técnicas más utilizadas en la genómica funcional. [50] Las pruebas desarrolladas utilizando ARN pequeños se han utilizado para identificar genes involucrados en procesos fundamentales como la división celular, la apoptosis y la regulación de la grasa.

Biomedicina

Desde al menos mediados de la década de 2000, ha habido un interés cada vez mayor en el desarrollo de ARN interferentes cortos para aplicaciones biomédicas y terapéuticas. [51] Reforzando este interés está un número creciente de experimentos que han demostrado con éxito el potencial clínico y la seguridad de los ARN pequeños para combatir enfermedades que van desde infecciones virales hasta cáncer, así como trastornos neurodegenerativos. [52] En 2004, las primeras solicitudes de investigación de nuevos fármacos para ARNi se presentaron en los Estados Unidos ante la Administración de Alimentos y Medicamentos ; estaba destinado a ser una terapia para la degeneración macular relacionada con la edad . [50] El silenciamiento de ARN in vitro e in vivo se ha logrado mediante la creación de desencadenantes (ácidos nucleicos que inducen ARNi) ya sea a través de la expresión en virus o la síntesis de oligonucleótidos. [53] De manera optimista, muchos estudios indican que las terapias basadas en ARN pequeños pueden ofrecer armas nuevas y potentes contra patógenos y enfermedades donde los tratamientos farmacológicos/de moléculas pequeñas y vacunas/biológicos han fallado o demostrado ser menos efectivos en el pasado. [51] Sin embargo, también se advierte que el diseño y la administración de pequeñas moléculas efectoras de ARN deben considerarse cuidadosamente para garantizar la seguridad y la eficacia.

El papel del silenciamiento de ARN en la terapéutica, la medicina clínica y el diagnóstico es un área en rápido desarrollo y se espera que en los próximos años algunos de los compuestos que utilizan esta tecnología alcancen la aprobación del mercado. A continuación se ha resumido un informe para destacar los numerosos dominios clínicos en los que el silenciamiento de ARN desempeña un papel cada vez más importante, entre los que se destacan los trastornos oculares y de la retina, el cáncer, los trastornos renales, la reducción de LDL y los antivirales. [53] La siguiente tabla muestra una lista de terapias basadas en RNAi que actualmente se encuentran en varias fases de ensayos clínicos. El estado de estos ensayos se puede monitorear en el sitio web ClinicalTrials.gov , un servicio de los Institutos Nacionales de Salud ( NIH ). [54] Cabe destacar los tratamientos en desarrollo para los trastornos oculares y de la retina, que estuvieron entre los primeros compuestos en alcanzar el desarrollo clínico. AGN211745 (sirna027) (Allergan) y bevasiranib (Cand5) (Opko) se sometieron a un desarrollo clínico para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad, pero los ensayos se interrumpieron antes de que los compuestos llegaran al mercado. Otros compuestos en desarrollo para afecciones oculares incluyen SYL040012 (Sylentis) y QPI-007 (Quark). SYL040012 (bamosinan) es un candidato a fármaco en desarrollo clínico para el glaucoma, una neurodegeneración óptica progresiva frecuentemente asociada a un aumento de la presión intraocular; QPI-007 es un candidato para el tratamiento del glaucoma de ángulo cerrado y la neuropatía óptica isquémica anterior no arterítica; ambos compuestos se encuentran actualmente en ensayos clínicos de fase II. Varios compuestos también están en desarrollo para afecciones como el cáncer y enfermedades raras.

Desafío principal

Al igual que con los medicamentos convencionales, el principal desafío para desarrollar derivados exitosos de los medicamentos basados ​​en RNAi es la administración precisa de los desencadenantes de RNAi donde se necesitan en el cuerpo. La razón por la que el antídoto contra la degeneración macular ocular tuvo éxito antes que el antídoto contra otras enfermedades es que el globo ocular es casi un sistema cerrado y el suero se puede inyectar con una aguja exactamente donde se necesita. Los futuros medicamentos exitosos serán los que puedan llegar donde se necesita, probablemente con la ayuda de nanobots. A continuación se muestra una representación de una tabla [53] que muestra los medios existentes de administración de los desencadenantes de RNAi.

Laboratorio

La comunidad científica ha aprovechado rápidamente el silenciamiento del ARN como herramienta de investigación. La selección estratégica del ARNm puede proporcionar una gran cantidad de información sobre la función de los genes y su capacidad de activarse y desactivarse. El silenciamiento inducido del ARN puede servir como un método controlado para suprimir la expresión génica. Dado que la maquinaria se conserva en la mayoría de los eucariotas, estos experimentos se pueden escalar bien a una variedad de organismos modelo. [55] En la práctica, la expresión de ARN sintéticos de horquilla corta se puede utilizar para alcanzar una inactivación estable. [56] Si se puede hacer que los promotores expresen estos ARN de horquilla corta de diseño, el resultado suele ser una inactivación génica potente, estable y controlada tanto en contextos in vitro como in vivo. [57] Los sistemas de vectores de ARN de horquilla corta pueden considerarse aproximadamente análogos en alcance al uso de sistemas de sobreexpresión de ADNc. [58] En general, los ARN pequeños sintéticos y naturales han demostrado ser una herramienta importante para estudiar la función génica en células y animales. [59]

Los métodos bioinformáticos para identificar ARN pequeños y sus dianas han devuelto varios cientos, si no miles, de ARN pequeños candidatos que se prevé que afecten a la expresión génica en plantas, C. elegans, D. melanogaster, pez cebra, ratón, rata y humano. [60] Estos métodos están dirigidos principalmente a identificar ARN pequeños candidatos para experimentos de eliminación, pero pueden tener aplicaciones más amplias. Un método bioinformático evaluó los criterios de conservación de secuencias mediante el filtrado de sitios de unión a dianas complementarios de semillas. El estudio citado predijo que aproximadamente un tercio de los genes de mamíferos iban a ser regulados, en este caso, por microARN. [61]

Ética y análisis de riesgo-beneficio

Un aspecto del silenciamiento del ARN que se debe tener en cuenta son sus posibles efectos no deseados, su toxicidad y los métodos de administración. Si el silenciamiento del ARN se va a convertir en un fármaco convencional, primero debe superar las cuestiones éticas típicas de la biomedicina. [62] Mediante el análisis de riesgo-beneficio, los investigadores pueden determinar si el silenciamiento del ARN se ajusta a ideologías éticas como la no maleficencia, la beneficencia y la autonomía. [63]

Existe el riesgo de crear virus capaces de infectar a personas que no consientan hacerlo. [64] También existe el riesgo de afectar a las generaciones futuras con estos tratamientos. Estos dos escenarios, en lo que respecta a la autonomía, pueden ser poco éticos. En este momento, los métodos de administración inseguros y los aspectos no deseados de los virus vectores se suman al argumento en contra del silenciamiento del ARN. [63]

En cuanto a los efectos fuera del objetivo, el ARNi puede inducir respuestas innatas de interferón, inhibir los miRNA endógenos a través de la saturación y puede tener secuencias complementarias a otros ARNm no objetivo. Estos no objetivo también podrían tener regulaciones al alza de los objetivos, como los oncogenes y los genes antiapoptóticos. La toxicidad del silenciamiento del ARN todavía está bajo revisión, ya que hay informes contradictorios. [63] [64] [65]

Número de publicaciones sobre RNAi desde 1998

El silenciamiento del ARN está en pleno desarrollo, por lo que es necesario seguir debatiendo las cuestiones éticas. Con el conocimiento de los principios éticos generales, debemos realizar continuamente análisis de riesgo-beneficio. [63]

Véase también

Referencias

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