El perfilado de ribosomas , o Ribo-Seq (también llamado huella de ribosomas ), es una adaptación de una técnica desarrollada por Joan Steitz y Marilyn Kozak hace casi 50 años que Nicholas Ingolia y Jonathan Weissman adaptaron para trabajar con la secuenciación de próxima generación que utiliza secuenciación especializada de ARN mensajero ( ARNm ) para determinar qué ARNm se están traduciendo activamente . [1] [2] Una técnica relacionada que también se puede utilizar para determinar qué ARNm se están traduciendo activamente es la metodología de purificación por afinidad de ribosomas traductores (TRAP), que fue desarrollada por Nathaniel Heintz en la Universidad Rockefeller (en colaboración con Paul Greengard y Myriam Heiman). [3] [2] TRAP no implica huella de ribosomas, pero proporciona información específica del tipo de célula.
Produce una “instantánea global” de todos los ribosomas que traducen activamente en una célula en un momento particular, conocido como translatoma . En consecuencia, esto permite a los investigadores identificar la ubicación de los sitios de inicio de la traducción , el complemento de ORFs traducidos en una célula o tejido, la distribución de ribosomas en un ARN mensajero y la velocidad de traducción de los ribosomas. [4] El perfil de ribosomas se dirige solo a las secuencias de ARNm protegidas por el ribosoma durante el proceso de decodificación por traducción, a diferencia de RNA-Seq , que secuencia todo el ARNm de una secuencia dada presente en una muestra. [1] Esta técnica también es diferente del perfil de polisomas .
El perfilado de ribosomas se basa en el descubrimiento de que el ARNm dentro de un ribosoma se puede aislar mediante el uso de nucleasas que degradan las regiones de ARNm desprotegidas. Esta técnica analiza las regiones de ARNm que se están convirtiendo en proteínas, así como los niveles de traducción de cada región para proporcionar información sobre la expresión génica global. Antes de su desarrollo, los esfuerzos para medir la traducción in vivo incluían el análisis de microarrays en el ARN aislado de polisomas , así como el perfilado de la traducción a través de la purificación por afinidad de ribosomas marcados con epítopos. Estos son métodos útiles y complementarios, pero ninguno permite la sensibilidad y la información posicional proporcionada por el perfilado de ribosomas. [4]
El perfil de ribosomas tiene tres usos principales: identificar regiones de ARNm traducidas, observar cómo se pliegan los péptidos nacientes y medir la cantidad de proteínas específicas que se sintetizan.
Al usar fármacos específicos, el perfil de ribosomas puede identificar regiones de iniciación de ARNm, regiones de elongación y áreas de estancamiento de la traducción. [5] Las regiones de iniciación se pueden detectar añadiendo harringtonina o lactidomicina para evitar cualquier iniciación adicional. [5] Esto permite analizar el codón de inicio de los ARNm en todo el lisado celular, lo que se ha utilizado para determinar secuencias no AUG que inician la traducción . [1] Las otras regiones de elongación se pueden detectar añadiendo antibióticos como cicloheximida que inhibe la translocación, cloranfenicol que inhibe la transferencia de péptidos dentro del ribosoma o medios no farmacológicos como la congelación térmica. [5] Estos métodos de congelación por elongación permiten analizar la cinética de la traducción. Dado que varios ribosomas pueden traducir una sola molécula de ARNm para acelerar el proceso de traducción, RiboSeq demuestra las regiones de codificación de proteínas dentro del ARNm y la rapidez con la que esto se hace dependiendo del ARNm que se está secuenciando. [1] [6] Esto también permite que el perfil de ribosomas muestre sitios de pausa dentro del transcriptoma en codones específicos. [6] [7] Estos sitios de traducción lenta o pausada se demuestran por un aumento en la densidad de ribosomas y estas pausas pueden vincular proteínas específicas con sus funciones dentro de la célula. [1]
La combinación del perfilado de ribosomas con ChIP puede dilucidar cómo y cuándo se pliegan las proteínas recién sintetizadas. [1] Utilizando las huellas proporcionadas por Ribo-Seq, se pueden purificar ribosomas específicos asociados con factores, como las chaperonas . Detener el ribosoma en puntos temporales específicos, lo que le permite traducir un polipéptido a lo largo del tiempo y exponer los diferentes puntos a una chaperona y precipitarlos mediante ChIP purifica estas muestras y puede mostrar en qué punto del tiempo se está plegando el péptido. [1]
Ribo-Seq también se puede utilizar para estimar la eficiencia de la traducción, un indicador de la síntesis de proteínas. Para esta aplicación, se generan perfiles de ribosomas y datos de secuenciación de ARN coincidentes. Los análisis de datos iniciales se pueden lograr mediante marcos computacionales dedicados (p. ej., [8] ). La eficiencia de la traducción se puede calcular entonces como la ocupación de los ribosomas de cada gen mientras se controla su expresión de ARN. [9] [10] Este enfoque se puede combinar con la interrupción dirigida de las proteínas que se unen al ARN y el uso de perfiles de ribosomas para medir la diferencia en la traducción. [7] Estos ARNm interrumpidos se pueden asociar con proteínas, cuyos sitios de unión ya se han mapeado en el ARN, para indicar la regulación. [1] [7]
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