Los neurofilamentos ( NF ) se clasifican como filamentos intermedios de tipo IV que se encuentran en el citoplasma de las neuronas . Son polímeros proteicos que miden 10 nm de diámetro y muchos micrómetros de longitud. [1] Junto con los microtúbulos (~25 nm) y los microfilamentos (7 nm), forman el citoesqueleto neuronal . Se cree que funcionan principalmente para proporcionar soporte estructural a los axones y regular el diámetro del axón, lo que influye en la velocidad de conducción nerviosa . Las proteínas que forman los neurofilamentos son miembros de la familia de proteínas de filamentos intermedios, que se divide en seis tipos según su organización genética y estructura proteica. Los tipos I y II son las queratinas que se expresan en los epitelios. El tipo III contiene las proteínas vimentina , desmina , periferina y proteína ácida fibrilar glial (GFAP). El tipo IV consta de las proteínas de neurofilamento NF-L, NF-M, NF-H y α-internexina . El tipo V está formado por las láminas nucleares y el tipo VI por la proteína nestina . Los genes de filamentos intermedios de tipo IV comparten dos intrones únicos que no se encuentran en otras secuencias de genes de filamentos intermedios, lo que sugiere un origen evolutivo común a partir de un gen primitivo de tipo IV.
Cualquier filamento proteico que se extiende en el citoplasma de una célula nerviosa también se denomina neurofibrilla . [2] Este nombre se utiliza en los ovillos neurofibrilares de algunas enfermedades neurodegenerativas .
La composición proteica de los neurofilamentos varía ampliamente entre los diferentes filos animales. La mayor parte de lo que se sabe sobre los neurofilamentos de los mamíferos. Históricamente, se pensaba originalmente que los neurofilamentos de los mamíferos estaban compuestos por solo tres proteínas llamadas proteína de neurofilamento NF-L (bajo peso molecular; NF-L ), NF-M (peso molecular medio; NF-M ) y NF-H (alto peso molecular; NF-H ). Estas proteínas se descubrieron a partir de estudios de transporte axonal y a menudo se las denomina "triplete de neurofilamento". [3] Sin embargo, ahora está claro que los neurofilamentos también contienen la proteína α-internexina [4] y que los neurofilamentos en el sistema nervioso periférico también pueden contener la proteína periferina [ 5] (esta es diferente de la periferina 2 que se expresa en la retina ). Por lo tanto, los neurofilamentos de los mamíferos son heteropolímeros de hasta cinco proteínas diferentes: NF-L, NF-M, NF-H, α-internexina y periferina. Las cinco proteínas neurofilamentosas pueden coensamblarse en diferentes combinaciones en diferentes tipos de células nerviosas y en diferentes etapas de desarrollo. La composición precisa de los neurofilamentos en cualquier célula nerviosa dada depende de los niveles de expresión relativa de las proteínas neurofilamentosas en la célula en ese momento. Por ejemplo, la expresión de NF-H es baja en neuronas en desarrollo y aumenta postnatalmente en neuronas con axones mielinizados. [6] En el sistema nervioso adulto, los neurofilamentos en axones pequeños no mielinizados contienen más periferina y menos NF-H, mientras que los neurofilamentos en axones grandes mielinizados contienen más NF-H y menos periferina. La subunidad de filamento intermedio tipo III, vimentina , se expresa en neuronas en desarrollo y unas pocas neuronas muy inusuales en el adulto en asociación con proteínas tipo IV, como las neuronas horizontales de la retina .
Las proteínas triplete se nombran en función de su tamaño relativo (bajo, medio, alto). La masa molecular aparente de cada proteína determinada por SDS-PAGE es mayor que la masa predicha a partir de la secuencia de aminoácidos. Esto se debe a la migración electroforética anómala de estas proteínas y es particularmente extrema para las proteínas de neurofilamento NF-M y NF-H debido a su alto contenido de aminoácidos cargados y fosforilación extensa. Las tres proteínas triplete de neurofilamento contienen largos tramos de secuencia polipeptídica rica en ácido glutámico y residuos de lisina , y NF-M y especialmente NF-H también contienen múltiples sitios de fosforilación de serina repetidos en tándem . Estos sitios contienen casi todos el péptido lisina-serina-prolina (KSP), y la fosforilación se encuentra normalmente en neurofilamentos axónicos y no dendríticos. NF-M humano tiene 13 de estos sitios KSP, mientras que NF-H humano se expresa a partir de dos alelos, uno de los cuales produce 44 y el otro 45 repeticiones de KSP.
Al igual que otras proteínas de filamento intermedio, las proteínas de neurofilamento comparten una región helicoidal alfa central común , conocida como dominio de varilla debido a su estructura terciaria similar a una varilla, flanqueada por dominios amino terminal y carboxi terminal que están en gran parte desestructurados. Los dominios de varilla de dos proteínas de neurofilamento se dimerizan para formar una bobina enrollada alfa-helicoidal . Dos dímeros se asocian de manera antiparalela escalonada para formar un tetrámero. Se cree que este tetrámero es la subunidad básica (es decir, el bloque de construcción) del neurofilamento. Las subunidades del tetrámero se asocian de lado a lado para formar filamentos de longitud unitaria, que luego se recocen de extremo a extremo para formar el polímero de neurofilamento maduro, pero la organización precisa de estas subunidades dentro del polímero no se conoce, en gran parte debido a la composición proteica heterogénea y la incapacidad de cristalizar neurofilamentos o proteínas de neurofilamento. Los modelos estructurales generalmente suponen ocho tetrámeros (32 polipéptidos de neurofilamentos) en una sección transversal de filamento, pero las mediciones de densidad de masa lineal sugieren que esto puede variar.
Los dominios amino terminales de las proteínas de los neurofilamentos contienen numerosos sitios de fosforilación y parecen ser importantes para las interacciones de las subunidades durante el ensamblaje de los filamentos. Los dominios carboxilo terminales parecen ser dominios intrínsecamente desordenados que carecen de hélice alfa o lámina beta. Los diferentes tamaños de las proteínas de los neurofilamentos se deben en gran medida a las diferencias en la longitud de los dominios carboxilo terminales. Estos dominios son ricos en residuos de aminoácidos ácidos y básicos. Los dominios carboxilo terminales de NF-M y NF-H son los más largos y se modifican ampliamente mediante modificaciones postraduccionales como la fosforilación y la glicosilación in vivo. Se proyectan radialmente desde la estructura principal del filamento para formar un borde en cepillo denso de dominios altamente cargados y no estructurados análogos a las cerdas de un cepillo para botellas. Se ha propuesto que estos dominios que se agitan entrópicamente definen una zona de exclusión alrededor de cada filamento, espaciando eficazmente los filamentos de sus vecinos. De esta manera, las proyecciones carboxilo terminales maximizan las propiedades de llenado de espacio de los polímeros de neurofilamentos. Mediante microscopía electrónica, estos dominios aparecen como proyecciones llamadas brazos laterales que parecen entrar en contacto con filamentos vecinos.
Los neurofilamentos se encuentran en las neuronas de los vertebrados en concentraciones especialmente altas en los axones, donde están todos alineados en paralelo a lo largo del eje largo del axón formando una disposición superpuesta continua. Se ha propuesto que funcionan como estructuras que llenan el espacio y aumentan el diámetro axonal. Su contribución al diámetro axonal está determinada por el número de neurofilamentos en el axón y su densidad de empaquetamiento. Se cree que el número de neurofilamentos en el axón está determinado por la expresión génica de los neurofilamentos [7] y el transporte axonal. La densidad de empaquetamiento de los filamentos está determinada por sus brazos laterales que definen el espaciado entre filamentos vecinos. Se cree que la fosforilación de los brazos laterales aumenta su extensibilidad, aumentando el espaciado entre filamentos vecinos [8] mediante la unión de cationes divalentes entre los brazos laterales de filamentos adyacentes [9] [10]
En las primeras fases del desarrollo, los axones son prolongaciones estrechas que contienen relativamente pocos neurofilamentos. Los axones que se mielinizan acumulan más neurofilamentos, lo que impulsa la expansión de su calibre. Una vez que un axón ha crecido y se ha conectado con su célula diana , su diámetro puede aumentar hasta cinco veces. [11] Esto se debe a un aumento de la cantidad de neurofilamentos exportados desde el cuerpo de la célula nerviosa, así como a una disminución de su velocidad de transporte. En los axones mielinizados maduros, los neurofilamentos pueden ser la estructura citoplasmática más abundante y pueden ocupar la mayor parte del área transversal del axón. Por ejemplo, un axón mielinizado grande puede contener miles de neurofilamentos en una sección transversal.
Además de su papel estructural en los axones, los neurofilamentos también son cargas de transporte axonal . [3] La mayoría de las proteínas de los neurofilamentos en los axones se sintetizan en el cuerpo de la célula nerviosa, donde se ensamblan rápidamente en polímeros de neurofilamentos en unos 30 minutos. [12] Estos polímeros de neurofilamentos ensamblados se transportan a lo largo del axón en pistas de microtúbulos impulsadas por proteínas motoras de microtúbulos . [13] Los filamentos se mueven bidireccionalmente, es decir, tanto hacia la punta del axón (anterógrado) como hacia el cuerpo celular (retrógrado), pero la dirección neta es anterógrada. Los filamentos se mueven a velocidades de hasta 8 μm/s en escalas de tiempo cortas (segundos o minutos), con velocidades medias de aproximadamente 1 μm/s. [14] Sin embargo, la velocidad media en escalas de tiempo más largas (horas o días) es lenta porque los movimientos son muy infrecuentes, y consisten en breves sprints interrumpidos por largas pausas. [15] [16] Por lo tanto, en escalas de tiempo largas, los neurofilamentos se mueven en el componente lento del transporte axonal.
Se han desarrollado numerosos anticuerpos específicos para las proteínas de neurofilamentos y están disponibles comercialmente. Estos anticuerpos se pueden utilizar para detectar proteínas de neurofilamentos en células y tejidos mediante microscopía de inmunofluorescencia o inmunohistoquímica . Dichos anticuerpos se utilizan ampliamente para identificar neuronas y sus procesos en secciones histológicas y en cultivos de tejidos . La proteína de filamento intermedio tipo VI Nestina se expresa en neuronas y glía en desarrollo. La nestina se considera un marcador de células madre neuronales, y la presencia de esta proteína se utiliza ampliamente para definir la neurogénesis . Esta proteína se pierde a medida que avanza el desarrollo.
Los anticuerpos contra neurofilamentos también se utilizan con frecuencia en el diagnóstico de neuropatología . La tinción con estos anticuerpos puede distinguir las neuronas (positivas para las proteínas de neurofilamentos) de la glía (negativas para las proteínas de neurofilamentos).
También existe un considerable interés clínico en el uso de proteínas de neurofilamentos como biomarcadores de daño axonal en enfermedades que afectan al sistema nervioso central. [17] [18] Cuando las neuronas o los axones se degeneran, las proteínas de neurofilamentos se liberan en la sangre o el líquido cefalorraquídeo. Los inmunoensayos de proteínas de neurofilamentos en el líquido cefalorraquídeo y el plasma pueden servir como indicadores de daño axonal en trastornos neurológicos. [19] Por lo tanto, los niveles de NF-L en sangre y LCR son marcadores útiles para el seguimiento de enfermedades en la esclerosis lateral amiotrófica , [20] esclerosis múltiple , [21] y más recientemente la enfermedad de Huntington . [22] También se ha evaluado como un marcador pronóstico para el resultado funcional después de un accidente cerebrovascular isquémico agudo. [23] Los ratones mutantes con anomalías de neurofilamentos tienen fenotipos que se asemejan a la esclerosis lateral amiotrófica . [24] Un trabajo reciente realizado como colaboración entre EnCor Biotechnology Inc. y la Universidad de Florida mostró que los anticuerpos NF-L empleados en los ensayos NF-L más utilizados son específicos para las formas escindidas de NF-L generadas por proteólisis inducida por muerte celular. [25]