Una prueba puntual en liquenología es un análisis puntual que se utiliza para ayudar a identificar líquenes . Se realiza colocando una gota de un reactivo químico en diferentes partes del liquen y observando el cambio de color (o la falta del mismo) asociado con la aplicación del químico. Las pruebas se encuentran habitualmente en claves dicotómicas para especies de líquenes y aprovechan la amplia gama de productos de líquenes ( metabolitos secundarios ) producidos por los líquenes y su singularidad entre los taxones . Como tal, las pruebas puntuales revelan la presencia o ausencia de sustancias químicas en varias partes de un liquen. Fueron propuestos por primera vez como método para ayudar a identificar especies por el liquenólogo finlandés William Nylander en 1866. [1]
Tres pruebas puntuales comunes utilizan una solución acuosa de KOH al 10 % (prueba K), una solución acuosa saturada de polvo blanqueador o hipoclorito de calcio (prueba C) o una solución alcohólica de p -fenilendiamina al 5 % (prueba P). Los cambios de color se producen debido a la presencia de metabolitos secundarios particulares en el liquen. En la literatura de referencia clave para la identificación, el resultado de las pruebas químicas puntuales sirve como característica principal para determinar las especies de líquenes. Existen otras pruebas puntuales de uso más limitado que se utilizan con menos frecuencia y que se emplean en situaciones específicas, como para distinguir entre determinadas especies. Las variaciones de la técnica, incluido el uso de papel de filtro para mejorar la visibilidad de las reacciones o el examen bajo un microscopio , se adaptan a diferentes tipos de líquenes y pigmentaciones, y los resultados generalmente se resumen en un código corto que indica la sustancia y la reacción observada. Otros métodos de diagnóstico, como la exposición a la luz ultravioleta (UV), pueden ayudar a identificar los metabolitos de los líquenes y distinguir entre especies, ya que algunas sustancias emiten fluorescencia bajo los rayos UV, lo que ayuda a diferenciar especies estrechamente relacionadas.
Las pruebas de cuatro puntos se utilizan con mayor frecuencia para ayudar con la identificación de líquenes. [3]
El reactivo para la prueba K es una solución acuosa de hidróxido de potasio (KOH) (10-25%) o, en ausencia de KOH, una solución acuosa al 10% de hidróxido de sodio (NaOH, lejía), que proporciona resultados casi idénticos. . [4] Una solución de KOH al 10% conservará su eficacia durante aproximadamente 6 meses a un año. [5] La prueba depende de la formación de sales y requiere la presencia de al menos un grupo funcional ácido en la molécula. Los compuestos de líquenes que contienen una quinona como parte de su estructura producirán un color de rojo oscuro a violeta. Los compuestos de ejemplo incluyen los pigmentos que son antraquinonas , naftoquinonas y terfenilquinonas . Los colores de amarillo a rojo se producen con la prueba K y algunas depsidas (incluidas la atranorina y el ácido tamnólico ) y muchas β- orcinol depsidonas . Por el contrario, las xantonas , los derivados del ácido pulvínico y el ácido úsnico no presentan ninguna reacción. [4]
Algunos líquenes comunes y ampliamente distribuidos que tienen productos de líquenes con una reacción positiva al K incluyen Xanthoria parietina , que es K+ (rojo-púrpura) debido a la parietina (una antraquinona), y Dibaeis baeomyces , que es K+ (amarillo), debido a el ácido baeomicésico, compuesto didépsido . [6]
Esta prueba utiliza una solución saturada de hipoclorito de calcio (polvo blanqueador) o, alternativamente, una solución diluida (normalmente se utiliza al 5,25%) de hipoclorito de sodio o lejía doméstica sin diluir . Por lo general, estas soluciones se reemplazan diariamente, ya que se descomponen en un plazo de 24 a 48 horas; se descomponen aún más rápidamente cuando se exponen a la luz solar (menos de una hora), por lo que se recomienda conservarlos en una botella de color oscuro. Otros factores que aceleran la descomposición de estas soluciones son el calor, la humedad y el dióxido de carbono . [7]
Los colores que normalmente se observan con la prueba C son el rojo y el rosa anaranjado. Las sustancias químicas que causan una reacción roja incluyen el ácido anziaico , la eritrina y el ácido lecanórico , mientras que las que dan como resultado un color rojo anaranjado incluyen el ácido girofórico. [8] En raras ocasiones, se produce un color verde esmeralda, causado por la reacción con dihidroxidibenzofuranos , [ 9] como el químico estrepsilina . [8] Otro color raro producido por esta prueba es el amarillo, que se observa en Cladonia portentosa como resultado del ácido úsnico dibenzofurano. [10]
Algunos líquenes comunes y ampliamente distribuidos que tienen productos de líquenes con una reacción positiva al C incluyen Lecanora expallens , que es C+ (naranja) debido al ácido xantona tiofánico, y Diploschistes muscorum , que es C+ (rojo) debido al ácido didépsido diplosquistésico. [10]
Esto también se conoce como prueba P. Utiliza una solución etanólica al 1-5% de parafenilendiamina ( PD), que se obtiene colocando una gota de etanol (70-95%) sobre unos pocos cristales del producto químico; esto produce una solución inestable y sensible a la luz que dura aproximadamente un día. [11] Una forma alternativa de esta solución, llamada solución de Steiner, es mucho más duradera aunque produce reacciones de color menos intensas. Por lo general, se prepara disolviendo 1 gramo de PD, 10 gramos de sulfito de sodio y 0,5 mililitros de detergente en 100 mililitros de agua; Inicialmente de color rosa, la solución se vuelve violeta con el tiempo. La solución de Steiner durará meses. [5] La fenilendiamina reacciona con aldehídos para producir bases de Schiff según la siguiente reacción: [9]
Los productos de esta reacción son de color amarillo a rojo. La mayoría de las β-orcinol depsidas y algunas β-orcinol depsidas reaccionarán positivamente. [11] La prueba PD, conocida por su alta especificidad hacia sustancias que producen reacciones K+ amarillas o rojas, ha reemplazado en gran medida a la prueba K, más simple pero menos concluyente. [12] La PD es venenosa tanto en polvo como en solución, y las superficies que entran en contacto con ella (incluida la piel) se decoloran. [13]
Algunos líquenes comunes y ampliamente distribuidos que tienen productos de líquenes con una reacción positiva al P incluyen Parmelia subrudecta , que es PD+ (amarillo) debido al didépsido atranorina, y Hypogymnia physodes , que es PD+ (naranja) debido al ácido fisodálico depsidona. [14]
Esta prueba puntual se puede realizar humedeciendo el talo con K seguido inmediatamente de C. La aplicación inicial de K rompe (mediante hidrólisis ) los enlaces éster en depsidas y depsidonas. Si se libera un grupo hidroxilo fenólico que está en meta con respecto a otro hidroxilo, se produce un color rojo a naranja a medida que se aplica C. [15] El ácido alectorónico y el ácido fisódico producen este color, mientras que se produce un color violeta cuando el ácido picroliquénico está presente. La prueba CK es una variación utilizada con menos frecuencia que invierte el orden de aplicación de los productos químicos. Se utiliza en casos especiales cuando se prueba el color naranja producido por el ácido bárbaco o el ácido difractaico , como el que está presente en Cladonia floerkeana . [8] El yodo de Lugol es otro reactivo que puede ser útil para identificar ciertas especies. [dieciséis]
Hypogymnia tubulosa es un liquen que es KC+ (rosa anaranjado) debido al ácido fisódico depsidona; Cetrelia olivetorum es KC+ (rosa-rojo) debido al ácido alectorónico depsidona. [10]
Hay varias pruebas puntuales que se utilizan con poca frecuencia debido a su aplicabilidad limitada, pero que pueden ser útiles en situaciones en las que es necesario detectar metabolitos particulares de líquenes o para distinguir entre ciertas especies cuando otras pruebas son negativas.
Las pruebas puntuales se realizan colocando una pequeña cantidad del reactivo deseado en la porción del liquen que se va a analizar. A menudo, se examinan tanto la corteza como la médula del liquen y, en ocasiones, resulta útil examinar otras estructuras como la soralia . Un método consiste en aspirar una pequeña cantidad de la sustancia química en un capilar de vidrio y tocar el talo del liquen; Para este fin también se utiliza un pequeño pincel. Las reacciones se visualizan mejor con una lupa o un microscopio estereoscópico . [8] Se puede utilizar una hoja de afeitar para extraer la corteza y acceder a la médula. Alternativamente, la solución se puede aplicar a las características del liquen que carecen de corteza o que dejan la médula expuesta, como soralia, pseudocyphellae o la parte inferior de las escamas. [19]
En una variación de esta técnica, sugerida por el químico sueco Johan Santesson, [20] se utiliza un trozo de papel de filtro para intentar que la reacción del color sea más fácilmente observable. Se presiona el fragmento de liquen sobre el papel y se extraen las sustancias del liquen con 10 a 20 gotas de acetona. Después de evaporar la acetona, las sustancias del liquen se dejan sobre el papel formando un anillo alrededor del fragmento de liquen. A continuación se puede realizar una prueba puntual del papel de filtro de la forma habitual. [21] En los casos en que los resultados de una prueba puntual en el talo sean inciertos, es posible aplastar una sección delgada del tejido en un portaobjetos de microscopio en una cantidad mínima de agua y reactivo debajo de un cubreobjetos. Un cambio de color es visible bajo un objetivo de microscopio de baja potencia o cuando el portaobjetos se coloca sobre un fondo blanco. [8] Esta técnica es útil cuando se prueban líquenes con pigmentos oscuros, como Bryoria . [5]
Las pruebas puntuales se pueden utilizar individualmente o en combinación. Los resultados de una prueba puntual generalmente se representan con un código corto que incluye, en orden, (1) una letra que indica el reactivo utilizado, (2) un signo "+" o "-" que indica un cambio de color o la falta de cambio de color. , respectivamente, y (3) una letra o palabra que indique el color observado. Además, se debe tener cuidado de indicar qué parte del liquen se analizó. Por ejemplo, "Cortex K+ naranja, C−, P−" significa que la corteza de la muestra de prueba se volvió naranja con la aplicación de KOH y no cambió con lejía o parafenilendiamina . De manera similar, "Médula K-, KC+R" indicaría que la médula del liquen era insensible a la aplicación de KOH, pero la aplicación de KOH seguida inmediatamente de lejía provocó que la médula se volviera roja. [12]
En ocasiones, la reacción del color tarda algún tiempo en desarrollarse. Por ejemplo, en determinadas especies de Cladonia , la reacción de PD con ácido fumarprotocetrarico puede tardar hasta medio minuto. [13] Por el contrario, las reacciones con C y KC suelen ser fugaces y ocurren dentro de un segundo de aplicar el reactivo, por lo que es fácil pasar por alto un cambio de color. Hay varias razones posibles por las que no se produce un resultado de prueba anticipado. Las causas incluyen reactivos viejos y químicamente inactivos y bajas concentraciones de sustancias líquenes en la muestra. Si el color del talo es oscuro, un cambio de color podría oscurecerse y otras técnicas son más apropiadas, como la técnica del papel de filtro. [8]
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En ocasiones puede resultar útil realizar otras medidas de diagnóstico además de las pruebas puntuales. Por ejemplo, algunos metabolitos de líquenes fluorescen bajo radiación ultravioleta, de modo que exponer ciertas partes del liquen a una fuente de luz ultravioleta puede revelar la presencia o ausencia de esos metabolitos de manera similar a las pruebas puntuales. Ejemplos de sustancias de líquenes que dan una fluorescencia brillante en los rayos UV son los ácidos alectorónico, lobárico y divaricático y la liquexantona . En algunos casos, la prueba de luz ultravioleta se puede utilizar para ayudar a distinguir entre especies estrechamente relacionadas, como Cladonia deformis (UV-) y Cladonia sulphurina (UV+, debido a la presencia de ácido escamoso). [19] Sólo la luz ultravioleta de longitud de onda larga es útil para observar líquenes directamente. [5]
Técnicas analíticas más avanzadas, como la cromatografía en capa fina , la cromatografía líquida de alta resolución y la espectrometría de masas, también pueden ser útiles para caracterizar inicialmente la composición química de los líquenes o cuando las pruebas puntuales no son reveladoras. [23]
Generalmente se considera que el liquenólogo finlandés William Nylander fue el primero en demostrar el uso de productos químicos para ayudar en la identificación de líquenes. [24] En artículos publicados en 1866, sugirió pruebas puntuales usando KOH y polvo blanqueador para obtener reacciones de color características, generalmente amarillo, rojo o verde. [1] [25] [26] En estos estudios demostró, por ejemplo, que los líquenes ahora conocidos como Cetrelia cetrarioides y C. olivetorum podían distinguirse como especies distintas debido a sus diferentes reacciones de color: C+ rojo en este último, contrastado sin reacción en el primero. Nylander mostró cómo se podría utilizar KOH para distinguir entre especies parecidas a Xanthoria candelaria y Candelaria concolor porque la presencia de parietina en las primeras especies produce una fuerte reacción de color. También sabía que en algunos casos las sustancias químicas de los líquenes no se distribuían uniformemente por toda la corteza y la médula debido a las diferentes reacciones de color en estas áreas. [24] A mediados de la década de 1930, Yasuhiko Asahina creó la prueba con para -fenilendiamina, que produce reacciones de amarillo a rojo con metabolitos secundarios que tienen un grupo aldehído libre. [27] [28] Posteriormente se demostró que esta prueba puntual era particularmente útil en la taxonomía de la familia Cladoniaceae . [29] [24]