La microcristalización (o prueba de microcristales ) es un método para identificar metabolitos de líquenes que se usaba predominantemente antes de la llegada de técnicas más avanzadas como la cromatografía en capa fina y la cromatografía líquida de alta resolución . Desarrollado principalmente por Yasuhiko Asahina , este enfoque se basa en la formación de cristales distintivos a partir de extractos de líquenes . Aunque ahora ha sido reemplazada por los métodos analíticos modernos , la microcristalización todavía tiene importancia para la purificación y el análisis de compuestos mediante cristalografía de rayos X.
Entre 1936 y 1940, [1] [2] el químico y liquenólogo japonés Yasuhiko Asahina publicó una serie de artículos en el Journal of Japanese Botany detallando la técnica de microcristalización. [3] [4] Este método simple y rápido permitió la identificación de los principales metabolitos en cientos de especies de líquenes, contribuyendo significativamente a la investigación taxonómica . [4] La técnica fue presentada a los liquenólogos occidentales en una publicación de 1943 de Alexander Evans , [5] y se utilizó regularmente hasta que se introdujeron e integraron en los laboratorios técnicas más avanzadas, como la cromatografía en capa fina y la cromatografía líquida de alto rendimiento . Décadas de investigación sobre los metabolitos secundarios de los líquenes culminaron con la publicación de Identification of Lichen Substances , un trabajo de 1996 de Siegfried Huneck e Isao Yoshimura, que resumió datos analíticos de cientos de moléculas de líquenes, incluidas imágenes de microcristales. [6] En última instancia, el método de microcristalización tenía limitaciones, ya que no podía detectar componentes menores ni analizar mezclas complejas de sustancias de líquenes. [7] [8] A pesar de estos inconvenientes, la microcristalización jugó un papel crucial en el estudio de las correlaciones entre la química, la morfología y la distribución geográfica de los líquenes. [8]
Para realizar la microcristalización, se extrae un pequeño trozo de liquen usando acetona u otros disolventes , se filtra y se evapora para producir un residuo . [7] [3] [9] El residuo se transfiere a un portaobjetos de microscopio y se añade una gota de reactivo de microcristalización antes de taparlo con un cubreobjetos . [7] Los reactivos comúnmente utilizados incluyen GAW (H 2 O/ glicerol / etanol 1:1:1, v/v/v) y GE ( ácido acético /glicerol 1:3). [7] Los portaobjetos que utilizan GE o GAW se calientan suavemente y luego se dejan enfriar, lo que promueve el proceso de cristalización. [7] [3] Una vez formados, los cristales se observan mejor bajo luz polarizada con un aumento de 200 a 1000 veces. [7]
Este método requiere equipo básico de laboratorio, incluido un microscopio equipado para luz polarizada, tubos de ensayo , pipetas , una micro lámpara de alcohol o un micro mechero Bunsen , una espátula o bisturí , portaobjetos y cubreobjetos. [3] Las sustancias de liquen se pueden identificar basándose en la forma y el color distintivos de sus cristales. [7] [3]
El proceso de identificación de cristales implica compararlos con imágenes de cristales en diferentes disolventes que se encuentran en fuentes publicadas. Aunque la forma de los cristales depende del disolvente y, en cierta medida, de la concentración de la sustancia, normalmente es posible reconocer las formas cristalinas fundamentales. Se debe tener cuidado en diferenciar entre sustancias no disueltas, que pueden ser cristalinas pero carecen de una forma característica, y sustancias recristalizadas. Las muestras de microcristales no se pueden conservar por mucho tiempo, ya que comienzan a degradarse en horas o días. [10]
Distinguir entre ácido girofórico y ácido lecanórico mediante cromatografía en capa fina puede resultar complicado. Sin embargo, si se sabe que una de estas sustancias está presente, una prueba de microcristales puede ayudar a diferenciarlas. En el sistema disolvente GAW, el ácido lecanórico forma grupos de cristales largos y curvos, aunque los resultados pueden ser inconsistentes, especialmente en presencia de otras sustancias. El ácido girofórico, cuando está presente en el sistema disolvente de GE, puede manifestarse como pequeños grupos de cristales finos o agregaciones redondeadas de cristales diminutos. El ácido lecanórico en el sistema solvente de GE produce grupos de cristales en forma de agujas, pero no están tan bien formados como en GAW. Estas pruebas pueden ayudar a distinguir Punctelia borreri (que contiene ácido girofórico) de Punctelia subrudecta (que contiene ácido lecanórico). [10]
Cuando dos sustancias generan cristales de apariencia similar, sus propiedades ópticas pueden usarse para diferenciarlas. Ciertos cristales alteran el plano de polarización de la luz transmitida y, cuando se giran entre polarizadores cruzados, alternan entre brillo y oscuridad cada 90°. El ángulo de extinción es el ángulo entre un eje de cristal específico y el plano de polarización del filtro cuando el cristal parece oscuro (en extinción). Por ejemplo, este método se puede emplear para distinguir entre el ácido perlatólico y el ácido imbricarico, que forman cristales largos y rectos en el sistema solvente GE pero exhiben ángulos de extinción de 0° y 45°, respectivamente, en relación con su eje largo. [10]