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Pistola genética

Sistema de suministro de partículas PDS-1000/He

En ingeniería genética , una pistola genética o sistema de suministro de partículas biolísticas es un dispositivo utilizado para suministrar ADN exógeno ( transgenes ), ARN o proteínas a las células. Al recubrir partículas de un metal pesado con un gen de interés y disparar estos microproyectiles a las células mediante fuerza mecánica, se puede introducir una integración de la información genética deseada en las células deseadas. La técnica involucrada en dicho suministro de ADN mediante microproyectiles a menudo se conoce como biolística , abreviatura de "balística biológica". [1] [2]

Este dispositivo es capaz de transformar casi cualquier tipo de célula y no se limita a la transformación del núcleo; también puede transformar orgánulos, incluidos plástidos y mitocondrias . [3]

Se utiliza una pistola de genes para introducir ADN exógeno en las células. Este método se conoce como "biolística". Las pistolas de genes se pueden utilizar de forma eficaz en la mayoría de las células, pero se utilizan principalmente en células vegetales.
  1. El aparato de pistola genética está listo para disparar.
  2. El helio llena la cámara y aumenta la presión contra el disco de ruptura.
  3. La presión finalmente alcanza el punto donde el disco de ruptura se rompe, y la explosión de helio resultante impulsa el macrotransportador recubierto de ADN y oro ('Disco de plástico') hacia la pantalla de detención.
  4. Cuando el macrotransportador golpea la pantalla de detención, las partículas de oro recubiertas de ADN son impulsadas a través de la pantalla hasta las células objetivo.

Diseño de pistola genética

La pistola genética era originalmente una pistola de aire comprimido Crosman modificada para disparar partículas densas de tungsteno . Fue inventada por John C Sanford , Ed Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell [4] [5] [6] junto con Ted Klein de DuPont entre 1983 y 1986. El objetivo original eran las cebollas (elegidas por el gran tamaño de sus células), y el dispositivo se utilizó para lanzar partículas recubiertas con un gen marcador que transmitiría una señal si se producía la inserción adecuada de la transcripción de ADN. [7] La ​​transformación genética se demostró tras la expresión observada del gen marcador dentro de las células de cebolla.

Las primeras pistolas genéticas fabricadas a medida (fabricadas por Nelson Allen) utilizaban un cartucho de pistola de clavos de calibre 22 para impulsar un cilindro de polietileno (bala) a través de un cañón Douglas de calibre 22. Se colocaba una gota de polvo de tungsteno recubierto de material genético sobre la bala y se disparaba hacia una placa de Petri situada debajo. La bala se soldaba al disco que se encontraba debajo de la placa de Petri y el material genético se difundía en la muestra con un efecto de rosquilla que implicaba devastación en el medio de la muestra con un anillo de buena transformación alrededor de la periferia. La pistola estaba conectada a una bomba de vacío y se colocaba bajo vacío mientras disparaba. El diseño inicial se puso en producción limitada por un Rumsey-Loomis (un taller de maquinaria local que en ese entonces estaba en Mecklenburg Road en Ithaca, Nueva York, EE. UU.).

Biolistics, Inc. vendió a Dupont los derechos para fabricar y distribuir un dispositivo actualizado con mejoras que incluyen el uso de helio como propulsor no explosivo y un mecanismo de entrega por colisión de múltiples discos para minimizar el daño a los tejidos de la muestra. También se utilizan otros metales pesados ​​como el oro y la plata para entregar material genético, siendo el oro el preferido debido a su menor citotoxicidad en comparación con los portadores de proyectiles de tungsteno. [8]

Diseño de construcción biolística

La transformación biolística implica la integración de un fragmento funcional de ADN, conocido como construcción de ADN, en las células diana. Una construcción genética es un casete de ADN que contiene todos los elementos reguladores necesarios para la expresión adecuada dentro del organismo diana. [9] [ página necesaria ] Si bien las construcciones genéticas pueden variar en su diseño dependiendo del resultado deseado del procedimiento de transformación, todas las construcciones contienen típicamente una combinación de una secuencia promotora , una secuencia terminadora , el gen de interés y un gen reportero .

Promotor
Los promotores controlan la ubicación y la magnitud de la expresión génica y funcionan como “el volante y el acelerador” de un gen. [9] [ página necesaria ] Los promotores preceden al gen de interés en la construcción de ADN y pueden modificarse mediante diseño de laboratorio para ajustar la expresión del transgén. El promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor es un ejemplo de un promotor de uso común que da como resultado una expresión génica constitutiva robusta dentro de las plantas. [10]
Terminador
Las secuencias de terminación son necesarias para la expresión génica adecuada y se colocan después de la región codificante del gen de interés dentro de la construcción de ADN. Un terminador común para la transformación biolística es el terminador NOS derivado de Agrobacterium tumefaciens . Debido a la alta frecuencia de uso de este terminador en plantas modificadas genéticamente, se han desarrollado estrategias para detectar su presencia dentro del suministro de alimentos para monitorear los cultivos transgénicos no autorizados. [11] [ verificación fallida ]
Gen reportero
Un gen que codifica un marcador seleccionable es un elemento común en las construcciones de ADN y se utiliza para seleccionar células transformadas adecuadamente. El marcador seleccionable elegido dependerá de la especie que se transforme, pero normalmente será un gen que otorgue a las células una capacidad de desintoxicación para ciertos herbicidas o antibióticos como la kanamicina , la higromicina B o el glifosato [9] [ página necesaria ] . [12] [13] [14]
Elementos adicionales
Los componentes opcionales de una construcción de ADN incluyen elementos como secuencias cre-lox que permiten la eliminación controlada de la construcción del genoma objetivo. [15] Dichos elementos son elegidos por el desarrollador de la construcción para realizar funciones especializadas junto con el gen principal de interés.

Solicitud

Las pistolas genéticas se utilizan principalmente en células vegetales, pero también tienen un gran potencial de uso en seres humanos y otros animales.

Plantas

El objetivo de una pistola genética suele ser un callo de células vegetales indiferenciadas o un grupo de embriones inmaduros que crecen en un medio de gel en una placa de Petri. Una vez que las partículas de oro recubiertas de ADN se han administrado a las células, el ADN se utiliza como plantilla para la transcripción (expresión transitoria) y, a veces, se integra en un cromosoma vegetal (transformación "estable").

Si el constructo de ADN administrado contiene un marcador seleccionable, entonces las células transformadas de manera estable pueden seleccionarse y cultivarse utilizando métodos de cultivo de tejidos. Por ejemplo, si el constructo de ADN administrado contiene un gen que confiere resistencia a un antibiótico o herbicida, entonces las células transformadas de manera estable pueden seleccionarse incluyendo ese antibiótico o herbicida en el medio de cultivo de tejidos.

Las células transformadas pueden ser tratadas con una serie de hormonas vegetales, como las auxinas y las giberelinas , y cada una de ellas puede dividirse y diferenciarse en células de tejido especializadas y organizadas de una planta entera. Esta capacidad de regeneración total se denomina totipotencia . La nueva planta que se originó a partir de una célula transformada con éxito puede tener nuevos rasgos que son hereditarios. El uso de la pistola genética puede contrastarse con el uso de Agrobacterium tumefaciens y su plásmido Ti para insertar ADN en células vegetales. Consulte la transformación para conocer los diferentes métodos de transformación en diferentes especies.

Los humanos y otros animales

También se han utilizado pistolas genéticas para administrar vacunas de ADN .

La administración de plásmidos a neuronas de rata mediante el uso de una pistola de genes, específicamente neuronas DRG, también se utiliza como precursor farmacológico en el estudio de los efectos de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer .

La pistola de genes se ha convertido en una herramienta común para etiquetar subconjuntos de células en tejidos cultivados. Además de poder transfectar células con plásmidos de ADN que codifican proteínas fluorescentes, la pistola de genes se puede adaptar para administrar una amplia variedad de colorantes vitales a las células. [16]

El bombardeo con armas genéticas también se ha utilizado para transformar Caenorhabditis elegans , como alternativa a la microinyección . [17]

Ventajas

La biolística ha demostrado ser un método versátil de modificación genética y generalmente se prefiere para diseñar cultivos resistentes a la transformación, como los cereales . Cabe destacar que el maíz Bt es un producto de la biolística. [9] [ página necesaria ] La transformación de plástidos también ha tenido un gran éxito con el bombardeo de partículas en comparación con otras técnicas actuales, como la transformación mediada por Agrobacterium , que tienen dificultades para dirigir el vector y expresarse de manera estable en el cloroplasto. [9] [ página necesaria ] [18] Además, no hay informes de un cloroplasto que silencie un transgén insertado con una pistola genética. [19] Además, con solo un disparo de una pistola genética, un técnico experto puede generar dos organismos transformados en ciertas especies. [18] Esta tecnología incluso ha permitido la modificación de tejidos específicos in situ , aunque es probable que esto dañe un gran número de células y transforme solo algunas , en lugar de todas, las células del tejido. [20]

Limitaciones

La biolística introduce ADN de forma aleatoria en las células diana. De este modo, el ADN puede transformarse en cualquier genoma presente en la célula, ya sea nuclear, mitocondrial, plasmídico o cualquier otro, en cualquier combinación, aunque un diseño de construcción adecuado puede mitigar este problema. La administración e integración de múltiples plantillas de la construcción de ADN es una posibilidad clara, lo que da como resultado niveles de expresión y números de copias del gen insertado potencialmente variables. [9] [ página necesaria ] Esto se debe a la capacidad de las construcciones de dar y recibir material genético de otras construcciones, lo que hace que algunas no lleven ningún transgén y otras lleven múltiples copias; el número de copias insertadas depende tanto de cuántas copias del transgén tenga una construcción insertada como de cuántas se hayan insertado. [9] [ página necesaria ] Además, debido a que las construcciones eucariotas dependen de la recombinación ilegítima —un proceso por el cual el transgén se integra en el genoma sin secuencias genéticas similares— y no de la recombinación homóloga , no se pueden dirigir a ubicaciones específicas dentro del genoma, [9] [ página necesaria ] a menos que el transgén se administre conjuntamente con reactivos de edición del genoma .

Referencias

  1. ^ O'Brien, John A.; Lummis, Sarah CR (2011). "Nano-biolística: un método de transfección biolística de células y tejidos utilizando una pistola genética con nuevos proyectiles de tamaño nanométrico". BMC Biotechnology . 11 : 66. doi : 10.1186/1472-6750-11-66 . PMC  3144454 . PMID  21663596.
  2. ^ Carter, Matt; Shieh, Jennifer (6 de marzo de 2015). "Capítulo 11: Estrategias de administración de genes". Academic Press (segunda edición). ISBN 978-0-12-800511-8.
  3. ^ Sanford, John C. (1990). "Transformación biolística de plantas". Physiologia Plantarum . 79 (1): 206–209. doi :10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x. ISSN  1399-3054.
  4. ^ Segelken, Roger (14 de mayo de 1987). «Biólogo inventó una pistola para disparar a células con ADN» (PDF) . Cornell Chronicle . p. 3. Archivado desde el original (PDF) el 29 de octubre de 2013. Consultado el 5 de junio de 2014 .
  5. ^ Sanford, JC; Klein, TM; Wolf, ED; Allen, N. (1987). "Entrega de sustancias a células y tejidos mediante un proceso de bombardeo de partículas". Ciencia y tecnología de partículas . 5 (1): 27–37. doi :10.1080/02726358708904533.
  6. ^ Klein, TM; Wolf, ED; Wu, R.; Sanford, JC (mayo de 1987). "Microproyectiles de alta velocidad para introducir ácidos nucleicos en células vivas". Nature . 327 (6117): 70–73. Bibcode :1987Natur.327...70K. doi :10.1038/327070a0. S2CID  4265777.
  7. ^ Segelken, Roger. "La escopeta genética". Facultad de Agricultura y Ciencias de la Vida de la Universidad de Cornell. Archivado desde el original el 26 de abril de 2010. Consultado el 5 de junio de 2014 .
  8. ^ Russell, Julie A.; Roy, Mihir K.; Sanford, John C. (1 de marzo de 1992). "El trauma físico y la toxicidad del tungsteno reducen la eficiencia de la transformación biolística". Fisiología vegetal . 98 (3): 1050–1056. doi :10.1104/pp.98.3.1050. ISSN  0032-0889. PMC 1080307 . PMID  16668726. 
  9. ^ abcdefgh Slater, Adrian; Scott, Nigel; Fowler, Mark (2008). Biotecnología vegetal: la manipulación genética de las plantas (2.ª ed.). Oxford, Nueva York, EE. UU.: Oxford University Press Inc. ISBN 978-0-19-928261-6.
  10. ^ Benfey, PN; Chua, N.-H. (16 de noviembre de 1990). "El promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor: regulación combinatoria de la transcripción en plantas". Science . 250 (4983): 959–966. Bibcode :1990Sci...250..959B. doi :10.1126/science.250.4983.959. ISSN  0036-8075. PMID  17746920. S2CID  35471862.
  11. ^ "terminador de la nopalina sintasa: temas de Science.gov" www.science.gov . Consultado el 20 de noviembre de 2019 .
  12. ^ Norris, MH; Kang, Y.; Lu, D.; Wilcox, BA; Hoang, TT (31 de julio de 2009). "Resistencia al glifosato como un nuevo marcador no selectivo por antibióticos y compatible con agentes de selección en la mutagénesis cromosómica de los genes esenciales asd y dapB de Burkholderia pseudomallei". Microbiología aplicada y ambiental . 75 (19): 6062–6075. Bibcode :2009ApEnM..75.6062N. doi :10.1128/aem.00820-09. ISSN  0099-2240. PMC 2753064 . PMID  19648360. 
  13. ^ Blochlinger, K; Diggelmann, H (diciembre de 1984). "La higromicina B fosfotransferasa como marcador seleccionable para experimentos de transferencia de ADN con células eucariotas superiores". Biología molecular y celular . 4 (12): 2929–2931. doi :10.1128/mcb.4.12.2929. ISSN  0270-7306. PMC 369308 . PMID  6098829. 
  14. ^ Carrer, Helaine; Hockenberry, Tish Noel; Svab, Zora; Maliga, Pal (octubre de 1993). "Resistencia a la kanamicina como marcador seleccionable para la transformación de plástidos en tabaco". MGG Molecular & General Genetics . 241–241 (1–2): 49–56. doi :10.1007/bf00280200. ISSN  0026-8925. PMID  8232211. S2CID  2291268.
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  18. ^ ab Sanford, John (28 de abril de 2006). "Transformación biolística de plantas". Physiologia Plantarum . 79 (1): 206–209. doi :10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x.
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  20. ^ Hayward, MD; Bosemark, NO; Romagosa, T. (2012). Fitomejoramiento: principios y perspectivas . Springer Science & Business Media. pág. 131. ISBN 9789401115247.

Lectura adicional

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