Los fragmentos de Okazaki son secuencias cortas de nucleótidos de ADN (de aproximadamente 150 a 200 pares de bases de largo en eucariotas ) que se sintetizan de forma discontinua y luego se unen entre sí mediante la enzima ADN ligasa para crear la cadena retrasada durante la replicación del ADN . [1] Fueron descubiertos en la década de 1960 por los biólogos moleculares japoneses Reiji y Tsuneko Okazaki , junto con la ayuda de algunos de sus colegas.
Durante la replicación del ADN, la doble hélice se desenrolla y las hebras complementarias son separadas por la enzima ADN helicasa , creando lo que se conoce como horquilla de replicación del ADN . Tras esta bifurcación, la ADN primasa y la ADN polimerasa comienzan a actuar para crear una nueva cadena complementaria. Debido a que estas enzimas sólo pueden trabajar en la dirección 5' a 3', las dos cadenas molde desenrolladas se replican de diferentes maneras. [2] Una hebra, la hebra principal , se somete a un proceso de replicación continuo ya que su hebra plantilla tiene una direccionalidad de 3' a 5', lo que permite que la polimerasa que ensambla la hebra principal siga la bifurcación de replicación sin interrupción. Sin embargo, la cadena retrasada no se puede crear de forma continua porque su cadena plantilla tiene una direccionalidad de 5' a 3', lo que significa que la polimerasa debe trabajar hacia atrás desde la horquilla de replicación. Esto provoca interrupciones periódicas en el proceso de creación del cordón rezagado. La primasa y la polimerasa se mueven en la dirección opuesta a la bifurcación, por lo que las enzimas deben detenerse y comenzar de nuevo repetidamente mientras la ADN helicasa rompe las hebras. Una vez que se forman los fragmentos, la ADN ligasa los conecta en una sola hebra continua. [3] Todo el proceso de replicación se considera "semidiscontinuo" ya que una de las nuevas hebras se forma continuamente y la otra no. [4]
[2] Durante la década de 1960, Reiji y Tsuneko Okazaki realizaron experimentos relacionados con la replicación del ADN en la bacteria Escherichia coli . Antes de este tiempo, se pensaba comúnmente que la replicación era un proceso continuo para ambas cadenas, pero los descubrimientos relacionados con E. coli llevaron a un nuevo modelo de replicación. Los científicos descubrieron que había un proceso de replicación discontinuo marcando el ADN con pulsos y observando cambios que apuntaban a una replicación no contigua.
El trabajo de Kiwako Sakabe, Reiji Okazaki y Tsuneko Okazaki proporcionó evidencia experimental que respalda la hipótesis de que la replicación del ADN es un proceso discontinuo. Anteriormente, se aceptaba comúnmente que la replicación era continua tanto en la dirección 3' a 5' como en la dirección 5' a 3'. 3' y 5' son carbonos específicamente numerados en el anillo de desoxirribosa de los ácidos nucleicos y se refieren a la orientación o direccionalidad de una hebra. En 1967, Tsuneko Okazaki y Toru Ogawa sugirieron que no se había encontrado ningún mecanismo que mostrara una replicación continua en la dirección 3' a 5', solo de 5' a 3' usando ADN polimerasa , una enzima de replicación. El equipo planteó la hipótesis de que si se utilizaba la replicación discontinua, las hebras cortas de ADN , sintetizadas en el punto de replicación, podrían unirse en la dirección 5' a 3' a la hebra más antigua. [5]
Para distinguir el método de replicación utilizado por el ADN experimentalmente, el equipo marcó con pulsos áreas recién replicadas de cromosomas de Escherichia coli , desnaturalizó y extrajo el ADN. Una gran cantidad de unidades cortas radiactivas significaba que el método de replicación probablemente era discontinuo. La hipótesis se vio respaldada aún más por el descubrimiento de la polinucleótido ligasa , una enzima que une cadenas cortas de ADN. [6]
En 1968, Reiji y Tsuneko Okazaki reunieron evidencia adicional de hebras de ADN nacientes. Plantearon la hipótesis de que si el mecanismo utilizado en la síntesis de ADN es la replicación discontinua, que involucra cadenas cortas de ADN unidas por polinucleótido ligasa, entonces "las cadenas cortas de ADN recién sintetizadas se acumularían en la célula en condiciones en las que la función de la ligasa se deteriora temporalmente". E. coli fueron infectadas con el bacteriófago T4 que produce polinucleótido ligasa sensible a la temperatura. Las células infectadas con los fagos T4 acumularon una gran cantidad de cadenas cortas de ADN recién sintetizadas, como se predijo en la hipótesis, cuando se expusieron a altas temperaturas. Este experimento apoyó aún más la hipótesis de Okazakis de replicación y enlace discontinuos mediante polinucleótido ligasa. Refutó la idea de que también se produjeran cadenas cortas durante el proceso de extracción. [7]
Los experimentos de los Okazaki proporcionaron amplia información sobre el proceso de replicación del ADN y la existencia de cadenas cortas de ADN recién sintetizadas que más tarde se conocieron como fragmentos de Okazaki.
Se han propuesto dos vías para procesar los fragmentos de Okazaki: la vía del colgajo corto y la vía del colgajo largo.
En la vía del flap corto en eucariotas, la cadena rezagada de ADN se ceba en intervalos cortos. Sólo en la vía corta está implicada la nucleasa FEN1 . Pol δ encuentra con frecuencia el fragmento de Okazaki preparado aguas abajo y desplaza el cebador iniciador de ARN/ADN hacia un colgajo 5'. La endonucleasa FEN1 5'-3' reconoce que el colgajo 5' está desplazado y se escinde, creando un sustrato para la ligadura. En este método se elimina el cebador sintetizado con Pol a. Estudios [ ¿cuáles? ] muestran que en la FEN1 se sugiere un 'seguimiento; modelo donde la nucleasa se mueve desde el colgajo 5 'hasta su base para realizar la escisión. El Pol δ no procesa una actividad nucleasa para escindir el colgajo desplazado. El FEN1 escinde el colgajo corto inmediatamente después de que se forma. La escisión se inhibe cuando el extremo 5' del colgajo de ADN se bloquea con un cebador complementario o con un resto de estreptavidina conjugada con biotina. La ADN ligasa sella la muesca producida por el FEN1 y crea una doble hebra continua funcional de ADN. PCNA simula funciones enzimáticas de proteínas tanto para FEN1 como para ADN ligasa. La interacción es crucial para crear una ligadura adecuada de la cadena de ADN rezagada. El desplazamiento secuencial de la cadena y la escisión por Pol δ y FEN1, respectivamente, ayudan a eliminar todo el ARN iniciador antes de la ligadura. Es necesario que se produzcan muchos desplazamientos y reacciones de escisión para eliminar el cebador iniciador. El colgajo que se crea, procesa y madura por la vía corta del colgajo.
En algunos casos, el FEN1 dura sólo un corto período de tiempo y se desconecta del complejo de replicación. Esto provoca un retraso en la escisión que hace que los colgajos desplazados por Pol δ se alarguen. Cuando el RPA alcanza una longitud suficiente, puede unirse de forma estable. Cuando las aletas unidas a RPA se refactorizan para la escisión de FEN1, se requiere otra nucleasa para su procesamiento, lo que se ha identificado como una nucleasa alternativa, DNA2. DNA2 tiene defectos en la sobreexpresión de DEN1. El DNA2 demostró funcionar con FEN1 para procesar aletas largas. DNA2 puede disociar el RPA de un colgajo largo, lo hace utilizando un mecanismo como el FEN1. Une la solapa y enhebra el extremo de 5' de la solapa. La nucleasa escinde el colgajo haciéndolo demasiado corto para unirse al RPA; si el colgajo es demasiado corto significa que está disponible para FEN1 y ligadura. Esto se conoce como método del colgajo largo. DNA2 puede actuar como FEN1 como respaldo para la actividad nucleasa, pero no es un proceso eficiente.
Hasta hace poco, sólo se conocían dos vías para procesar los fragmentos de Okazaki. Sin embargo, las investigaciones actuales han concluido que existe una nueva vía para la fragmentación de Okazaki y la replicación del ADN. Esta vía alternativa involucra las enzimas Pol δ con Pif1 que realizan el mismo proceso de eliminación de solapas que Pol δ y FEN1. [8]
Primase agrega cebadores de ARN a la cadena retrasada, lo que permite la síntesis de fragmentos de Okazaki de 5' a 3'. Sin embargo, la primasa crea cebadores de ARN a un ritmo mucho menor que el de la ADN polimerasa sintetiza ADN en la cadena principal. La ADN polimerasa de la cadena retrasada también debe reciclarse continuamente para construir fragmentos de Okazaki siguiendo los cebadores de ARN. Esto hace que la velocidad de síntesis de la cadena retrasada sea mucho menor que la de la cadena principal. Para solucionar esto, la primasa actúa como una señal de parada temporal, deteniendo brevemente la progresión de la bifurcación de replicación durante la replicación del ADN. Este proceso molecular evita que la cadena principal supere a la cadena retrasada. [9]
Durante esta fase se produce ADN nuevo mediante enzimas que sintetizan el ADN en la dirección 5' a 3'. La ADN polimerasa es esencial tanto para la cadena principal, que se forma como una cadena continua, como para la cadena retrasada, que se forma en pequeños trozos en la síntesis de ADN. Este proceso ocurre por la extensión del fragmento recién sintetizado y la expulsión del segmento de ARN y ADN. La síntesis se produce en 3 fases con dos polimerasas diferentes, la ADN polimerasa α-primasa y la ADN polimerasa δ. Este proceso comienza con el desplazamiento de la polimerasa α-primasa del cebador de ARN y ADN mediante el efecto de replicación del cargador de abrazadera, este efecto conduce la abrazadera deslizante hacia el ADN. Después de esto, la ADN polimerasa δ comienza a adoptar su forma de holoenzima, que luego comienza la síntesis. El proceso de síntesis continuará hasta que llegue el final 5' del fragmento anterior de Okazaki. Una vez llegados, el procesamiento del fragmento de Okazaki procede a unir el fragmento recién sintetizado a la hebra retrasada. La última función de la ADN polimerasa δ es servir como complemento de la actividad de la endonucleasa 5' Flap FEN1/RAD27. El alelo rad27-p es letal en la mayoría de las combinaciones, pero era viable con la polimerasa rad27-p y exo1. Tanto la polimerasa rad27-p como la exo1 muestran fuertes aumentos sinérgicos en las mutaciones de duplicación de CAN 1. La única razón por la que esta mutación es viable se debe a los genes de reparación de roturas de doble hebra RAD50, RAD51 y RAD52. El RAD27/FEN1 crea mellas entre fragmentos de Okazaki adyacentes minimizando la cantidad de expulsión de hebras en la hebra rezagada.
Durante la síntesis de la cadena retardada, la ADN ligasa I conecta los fragmentos de Okazaki, luego de la sustitución de los cebadores de ARN con nucleótidos de ADN por la ADN polimerasa δ. Los fragmentos de Okazaki que no están ligados podrían provocar roturas de doble cadena, lo que escinde el ADN. [10] Dado que solo se tolera una pequeña cantidad de roturas de doble cadena y solo una pequeña cantidad puede repararse, suficientes fallas de ligadura podrían ser letales para la célula.
Investigaciones adicionales implican el papel complementario del antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) a la función de la ADN ligasa I de unir fragmentos de Okazaki. Cuando el sitio de unión de PCNA en la ADN ligasa I está inactivo, la capacidad de la ADN ligasa I para conectar fragmentos de Okazaki se ve gravemente afectada. Por lo tanto, sigue un mecanismo propuesto: después de que un complejo PCNA-ADN polimerasa δ sintetiza fragmentos de Okazaki, se libera la ADN polimerasa δ. Luego, la ADN ligasa I se une al PCNA, que está sujeto a las muescas de la hebra retrasada, y cataliza la formación de enlaces fosfodiéster. [11] [12] [13]
La endonucleasa 1 flap ( FEN1 ) es responsable del procesamiento de los fragmentos de Okazaki. Funciona con la ADN polimerasa para eliminar el cebador de ARN de un fragmento de Okazaki y puede eliminar el ribonucleótido 5' y las solapas 5' cuando la ADN polimerasa desplaza las hebras durante la síntesis de la hebra retrasada. La eliminación de estos colgajos implica un proceso llamado traducción de mella y crea una mella para la ligadura. Por lo tanto, la función de FEN1 es necesaria para la maduración del fragmento de Okazaki y formar una cadena de ADN larga y continua. Del mismo modo, durante la reparación de la base del ADN, el nucleótido dañado se desplaza hacia un colgajo y posteriormente FEN1 lo elimina. [14] [15]
La endonucleasa dna2 no tiene una estructura específica y sus propiedades no están bien caracterizadas, pero podría denominarse ADN monocatenario con extremos libres (ssDNA). La endonucleasa ADN2 es esencial para escindir largos colgajos de ADN que abandonan FEN1 durante el proceso de Okazaki. La endonucleasa ADN2 es responsable de la eliminación del segmento de ARN iniciador en los fragmentos de Okazaki. Además, la endonucleasa Dna2 tiene un papel fundamental en los intermediarios creados durante diversos metabolismos del ADN y es funcional en el mantenimiento de los telómeros. [16] [17] [18] [19] [20]
La endonucleasa ADN2 se activa cuando un segmento de ARN terminal se une al extremo 5', porque se transloca en la dirección 5' a 3'. En presencia de una proteína RPA de unión a ADN monocatenaria, las aletas 5' del ADN se vuelven demasiado largas y las muescas ya no sirven como sustrato para FEN1. Esto evita que el FEN1 retire las solapas de 5′. Por lo tanto, el papel de Dna2 es reducir el extremo 3 'de estos fragmentos, lo que permite que FEN1 corte los colgajos y que la maduración del fragmento de Okazaki sea más eficiente. Durante el Proceso Okazaki, la ADN2 helicasa y la endonucleasa son inseparables. La endonucleasa Dna2 no depende de la estructura de horquilla de cola 5' para su actividad. Se sabe que la unión improductiva crea bloques para la escisión y el seguimiento de FEN1. Se sabe que el ATP reduce la actividad, pero promueve la liberación de la etiqueta del extremo 3'. Los estudios han sugerido que un nuevo modelo de Dna2 Endonucleasa y FEN1 son parcialmente responsables de la maduración del fragmento de Okazaki. [19] [17] [16] [21]
El ADN recién sintetizado, también conocido como fragmentos de Okazaki, está unido por la ADN ligasa, que forma una nueva cadena de ADN. Hay dos cadenas que se crean cuando se sintetiza el ADN. La cadena principal se sintetiza continuamente y se alarga durante este proceso para exponer la plantilla que se utiliza para la cadena retrasada (fragmentos de Okazaki). Durante el proceso de replicación del ADN, los cebadores de ADN y ARN se eliminan de la cadena rezagada de ADN para permitir que se unan los fragmentos de Okazaki. Dado que este proceso es tan común, la maduración de Okazaki tendrá lugar alrededor de un millón de veces durante una finalización de la replicación del ADN. Para que se produzca la maduración de Okazaki, los cebadores de ARN deben crear segmentos en los fragmentos que se van a ligar. Esto se utiliza como componente básico para la síntesis de ADN en la cadena retrasada. En la cadena plantilla, la polimerasa se sintetizará en la dirección opuesta a la horquilla de replicación. Una vez que la plantilla se vuelva discontinua, creará un fragmento de Okazaki. Los defectos en la maduración de los fragmentos de Okazaki pueden provocar potencialmente la rotura de hebras del ADN y provocar diferentes formas de anomalías cromosómicas. Estas mutaciones en los cromosomas pueden afectar la apariencia, la cantidad de conjuntos o la cantidad de cromosomas individuales. Dado que los cromosomas están fijos para cada especie específica, también puede cambiar el ADN y causar defectos en el acervo genético de esa especie.
Los fragmentos de Okazaki están presentes tanto en procariotas como en eucariotas . [22] Las moléculas de ADN en los eucariotas se diferencian de las moléculas circulares de los procariotas en que son más grandes y generalmente tienen múltiples orígenes de replicación. Esto significa que cada cromosoma eucariota está compuesto por muchas unidades de ADN replicantes con múltiples orígenes de replicación. En comparación, el ADN procariótico tiene un solo origen de replicación. En los eucariotas, estas horquillas de replicación, que son numerosas a lo largo de todo el ADN, forman "burbujas" en el ADN durante la replicación. La bifurcación de replicación se forma en un punto específico llamado secuencias de replicación autónoma (ARS). Los eucariotas tienen un complejo cargador de pinzas y una pinza de seis unidades llamada antígeno nuclear de células en proliferación. [23] El movimiento eficiente de la horquilla de replicación también depende de manera crítica de la rápida colocación de abrazaderas deslizantes en sitios recién preparados en la cadena de ADN rezagada mediante complejos cargadores de abrazaderas dependientes de ATP. Esto significa que la generación por partes de fragmentos de Okazaki puede seguir el ritmo de la síntesis continua de ADN en la cadena principal. Estos complejos de cargador de abrazadera son característicos de todos los eucariotas y separan algunas de las diferencias menores en la síntesis de fragmentos de Okazaki en procariotas y eucariotas. [24] Las longitudes de los fragmentos de Okazaki en procariotas y eucariotas también son diferentes. Los procariotas tienen fragmentos de Okazaki que son bastante más largos que los de los eucariotas. Los eucariotas suelen tener fragmentos de Okazaki que tienen de 100 a 200 nucleótidos de largo, mientras que los fragmentos en E. coli procariótica pueden tener 2000 nucleótidos de largo. Se desconoce el motivo de esta discrepancia.
Cada cromosoma eucariota está compuesto por muchas unidades de ADN replicantes con múltiples orígenes de replicación. En comparación, el cromosoma procariótico de E. coli tiene un solo origen de replicación. La replicación en procariotas ocurre dentro del citoplasma, y todo esto inicia la replicación que está formada por aproximadamente 100 a 200 o más nucleótidos. Las moléculas de ADN eucariotas tienen un número significativamente mayor de replicones , alrededor de 50.000 o más; sin embargo, la replicación no ocurre al mismo tiempo en todos los replicones. En los eucariotas, la replicación del ADN tiene lugar en el núcleo. Se forma una gran cantidad de replicación en una sola molécula de ADN que se replica; el inicio de la replicación del ADN es retrasado por la proteína de múltiples subunidades. Esta replicación es lenta y en ocasiones se añaden unos 100 nucleótidos por segundo.
De esto deducimos que las células procarióticas tienen una estructura más simple, no tienen núcleo, orgánulos y muy poco ADN, en forma de un solo cromosoma. Las células eucariotas tienen un núcleo con múltiples orgánulos y más ADN dispuesto en cromosomas lineales. También vemos que el tamaño es otra diferencia entre estas células procarióticas y eucariotas. La célula eucariota promedio tiene aproximadamente 25 veces más ADN que una célula procariota. La replicación ocurre mucho más rápido en las células procarióticas que en las eucariotas; las bacterias a veces sólo tardan 40 minutos, mientras que las células animales pueden tardar hasta 400 horas. Los eucariotas también tienen una operación distinta para replicar los telómeros al final de sus últimos cromosomas. Los procariotas tienen cromosomas circulares, lo que hace que no se sinteticen extremos. Los procariotas tienen un proceso de replicación corto que ocurre de forma continua; Las células eucariotas, por otro lado, sólo emprenden la replicación del ADN durante la fase S del ciclo celular .
Las similitudes son los pasos para la replicación del ADN. Tanto en procariotas como en eucariotas, la replicación se logra desenrollando el ADN mediante una enzima llamada ADN helicasa. Las nuevas cadenas son creadas por enzimas llamadas ADN polimerasas. Ambos siguen un patrón similar, llamado replicación semiconservativa, en el que se producen hebras individuales de ADN en diferentes direcciones, lo que forma una hebra principal y una rezagada. Estas hebras rezagadas se sintetizan mediante la producción de fragmentos de Okazaki que pronto se unen. Ambos organismos inician nuevas hebras de ADN que también incluyen pequeñas hebras de ARN.
Aunque las células se someten a múltiples pasos para garantizar que no haya mutaciones en la secuencia genética, a veces eliminaciones específicas y otros cambios genéticos durante la maduración del fragmento de Okazaki pasan desapercibidos. Debido a que los fragmentos de Okazaki son el conjunto de nucleótidos de la cadena retrasada, cualquier alteración, incluidas eliminaciones, inserciones o duplicaciones de la cadena original, puede provocar una mutación si no se detecta y repara. Otras causas de mutaciones incluyen problemas con las proteínas que ayudan en la replicación del ADN. Por ejemplo, una mutación relacionada con la primasa afecta la eliminación del cebador de ARN y puede hacer que la cadena de ADN sea más frágil y susceptible a roturas. Otra mutación se refiere a la polimerasa α, que perjudica la edición de la secuencia del fragmento de Okazaki y la incorporación de la proteína al material genético. Ambas alteraciones pueden provocar aberraciones cromosómicas, reordenamientos genéticos involuntarios y una variedad de cánceres en el futuro. [25]
Para probar los efectos de las mutaciones de proteínas en organismos vivos, los investigadores alteraron genéticamente ratones de laboratorio para que fueran homocigotos para otra mutación en una proteína relacionada con la replicación del ADN, la endonucleasa 1 flap o FEN1. Los resultados variaron según las alteraciones genéticas específicas. Los ratones mutantes homocigotos knockout experimentaron un "fallo en la proliferación celular" y una "letalidad embrionaria temprana" (27). Los ratones con la mutación F343A y F344A (también conocida como FFAA) murieron inmediatamente después del nacimiento debido a complicaciones en el parto, incluidas pancitopenia e hipoplasia pulmonar . Esto se debe a que la mutación FFAA impide que FEN1 interactúe con PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes), por lo que no le permite completar su propósito durante la maduración del fragmento de Okazaki. La interacción con esta proteína se considera la función molecular clave en la función biológica de FEN1. La mutación FFAA provoca defectos en la eliminación de los cebadores de ARN y en la reparación de pares de bases largas, lo que provoca muchas roturas en el ADN. Bajo una observación cuidadosa, las células homocigotas para las mutaciones FFAA FEN1 parecen mostrar solo defectos parciales en la maduración, lo que significa que los ratones heterocigotos para la mutación podrían sobrevivir hasta la edad adulta, a pesar de sufrir múltiples mellas pequeñas en sus genomas. Sin embargo, inevitablemente, estas mellas impiden la replicación futura del ADN porque la rotura provoca el colapso de la horquilla de replicación y provoca roturas de doble hebra en la secuencia real del ADN. Con el tiempo, estas mellas también provocan roturas cromosómicas completas, lo que podría provocar mutaciones graves y cánceres. Se han implementado otras mutaciones con versiones alteradas de la polimerasa α, lo que ha llevado a resultados similares. [25]