En biología molecular , las endonucleasas son enzimas que cortan el enlace fosfodiéster dentro de una cadena de polinucleótidos (es decir, ADN o ARN ). Algunas, como la desoxirribonucleasa I , cortan el ADN de manera relativamente inespecífica (con respecto a la secuencia), mientras que muchas, generalmente llamadas endonucleasas de restricción o enzimas de restricción , cortan solo en secuencias de nucleótidos muy específicas. Las endonucleasas se diferencian de las exonucleasas , que cortan los extremos de las secuencias de reconocimiento en lugar de la porción media ( endo ). Sin embargo, algunas enzimas conocidas como " exo-endonucleasas " no se limitan a ninguna de las funciones de nucleasa, mostrando cualidades que son tanto endo- como exo-similares. [1] La evidencia sugiere que la actividad de la endonucleasa experimenta un retraso en comparación con la actividad de la exonucleasa. [2]
Las enzimas de restricción son endonucleasas de eubacterias y arqueas que reconocen una secuencia de ADN específica. [3] La secuencia de nucleótidos reconocida para la escisión por una enzima de restricción se denomina sitio de restricción . Normalmente, un sitio de restricción será una secuencia palindrómica de unos cuatro a seis nucleótidos de longitud. La mayoría de las endonucleasas de restricción escinden la cadena de ADN de forma desigual, dejando extremos monocatenarios complementarios. Estos extremos pueden volver a conectarse a través de la hibridación y se denominan "extremos pegajosos". Una vez emparejados, los enlaces fosfodiéster de los fragmentos pueden unirse mediante la ADN ligasa . Se conocen cientos de endonucleasas de restricción, cada una de las cuales ataca un sitio de restricción diferente. Los fragmentos de ADN escindidos por la misma endonucleasa pueden unirse independientemente del origen del ADN. Dicho ADN se denomina ADN recombinante ; ADN formado por la unión de genes en nuevas combinaciones. [4] Las endonucleasas de restricción ( enzimas de restricción ) se dividen en tres categorías, Tipo I, Tipo II y Tipo III, según su mecanismo de acción. Estas enzimas se utilizan a menudo en ingeniería genética para crear ADN recombinante para su introducción en células bacterianas, vegetales o animales, así como en biología sintética . [5] Una de las endonucleasas más famosas es Cas9 .
En definitiva, existen tres categorías de endonucleasas de restricción que contribuyen de forma relativa a la escisión de secuencias específicas. Los tipos I y III son grandes complejos multisubunitarios que incluyen tanto las actividades de endonucleasas como de metilasas . El tipo I puede escindir en sitios aleatorios de unos 1000 pares de bases o más de la secuencia de reconocimiento y requiere ATP como fuente de energía. El tipo II se comporta de forma ligeramente diferente y fue aislado por primera vez por Hamilton Smith en 1970. Son versiones más simples de las endonucleasas y no requieren ATP en sus procesos de degradación. Algunos ejemplos de endonucleasas de restricción de tipo II incluyen Bam HI, Eco RI, Eco RV, Hin dIII y Hae III. El tipo III, sin embargo, escinde el ADN a unos 25 pares de bases de la secuencia de reconocimiento y también requiere ATP en el proceso. [4]
La notación comúnmente utilizada para las endonucleasas de restricción [6] es de la forma " Vwx yZ", donde " Vwx " son, en cursiva, la primera letra del género y las dos primeras letras de la especie donde se puede encontrar esta endonucleasa de restricción, por ejemplo, Escherichia coli , Eco , y Haemophilus influenzae , Hin . Esto es seguido por el símbolo opcional, no en cursiva "y", que indica la identificación del tipo o cepa, por ejemplo, Eco R para cepas de E. coli que portan el factor de transferencia de resistencia a fármacos RTF-1, [6] Eco B para la cepa B de E. coli , [7] y Hin d para la cepa d de H. influenzae . [6] Finalmente, cuando un tipo o cepa particular tiene varias endonucleasas de restricción diferentes, estas se identifican con números romanos, así, las endonucleasas de restricción de la cepa d de H. influenzae se denominan Hin dI, Hin dII, Hin dIII, etc. Otro ejemplo: " Hae II" y " Hae III" se refieren a la bacteria Haemophilus aegyptius (cepa no especificada), endonucleasas de restricción número II y número III, respectivamente. [4] : 64–64 Las enzimas de restricción utilizadas en biología molecular generalmente reconocen secuencias diana cortas de aproximadamente 4 – 8 pares de bases. Por ejemplo, la enzima Eco RI reconoce y escinde la secuencia 5' – GAATTC – 3'. [8]
Las endonucleasas de restricción son de varios tipos. Una endonucleasa de restricción normalmente requiere un sitio de reconocimiento y un patrón de escisión (normalmente de bases de nucleótidos: A, C, G, T). Si el sitio de reconocimiento está fuera de la región del patrón de escisión, entonces la endonucleasa de restricción se denomina Tipo I. Si la secuencia de reconocimiento se superpone con la secuencia de escisión, entonces la enzima de restricción de la endonucleasa de restricción es Tipo II. [ cita requerida ]
Las endonucleasas desempeñan un papel en muchos aspectos de la vida biológica. A continuación se presentan algunos ejemplos de procesos en los que las endonucleasas desempeñan un papel crucial.
Las endonucleasas desempeñan un papel en la reparación del ADN. La endonucleasa AP , específicamente, cataliza la incisión del ADN exclusivamente en los sitios AP y, por lo tanto, prepara el ADN para la escisión posterior, la síntesis de reparación y la ligadura del ADN. Por ejemplo, cuando se produce la despurinización, esta lesión deja un azúcar desoxirribosa con una base faltante. [9] La endonucleasa AP reconoce este azúcar y esencialmente corta el ADN en este sitio y luego permite que continúe la reparación del ADN. [10] Las células de E. coli contienen dos endonucleasas AP: la endonucleasa IV (endoIV) y la exonucleasa III (exoIII), mientras que en los eucariotas, solo hay una endonucleasa AP. [11]
La reparación del ADN en el que las dos cadenas complementarias están unidas por un enlace cruzado covalente entre cadenas requiere múltiples incisiones para desenganchar las cadenas y eliminar el daño. Se requieren incisiones en ambos lados del enlace cruzado y en ambas cadenas del ADN dúplex. En las células madre embrionarias de ratón, una etapa intermedia de la reparación del enlace cruzado implica la producción de roturas de doble cadena. [12] MUS81 / EME1 es una endonucleasa de estructura específica involucrada en la conversión de enlaces cruzados entre cadenas en roturas de doble cadena de una manera dependiente de la replicación del ADN. [12] Después de la introducción de una rotura de doble cadena, se requieren pasos adicionales para completar el proceso de reparación. Si un enlace cruzado no se repara adecuadamente, puede bloquear la replicación del ADN . [ cita requerida ]
La exposición del bacteriófago (fago) T4 a la radiación ultravioleta induce dímeros de timina en el ADN del fago. El gen denV del fago T4 codifica la endonucleasa V , que cataliza los pasos iniciales de la reparación de estos dímeros de timina inducidos por la radiación UV. [13] La endonucleasa V primero escinde el enlace glucosílico en el lado 5' de un dímero de pirimidina y luego cataliza la escisión del enlace fosfodiéster del ADN que originalmente unía los dos nucleótidos del dímero. Los pasos posteriores en el proceso de reparación implican la eliminación de los restos del dímero y la síntesis de reparación para rellenar el hueco de cadena sencilla resultante utilizando la cadena no dañada como plantilla. [ cita requerida ]
Durante la apoptosis, la endonucleasa apoptótica DFF40 se activa para iniciar un desmontaje celular controlado. Esta desintegración se caracteriza por la escisión del ADN genómico en fragmentos específicos. La función precisa de las endonucleasas en este contexto es escindir el ADN en sitios específicos, generando fragmentos con longitudes definidas. Estos fragmentos luego se empaquetan en cuerpos apoptóticos, lo que garantiza una eliminación ordenada y eficiente de la célula moribunda sin causar inflamación o daño a las células vecinas. [14]
La endonucleasa Flap 1 (FEN1) y la endonucleasa Dna2 son fundamentales para la replicación del ADN en la cadena rezagada y participan en procesos cruciales como la eliminación del cebador y el procesamiento del fragmento de Okazaki . Las endonucleasas participan activamente en el procesamiento de estos fragmentos al escindir los enlaces fosfodiéster entre ellos. Este proceso es fundamental para la síntesis y unión sin fisuras de los fragmentos de Okazaki, lo que contribuye a la continuidad general de la cadena de ADN recién replicada. [15] [16]
Las endonucleasas, más específicamente la endoribonucleasa , desempeñan un papel crucial en el procesamiento del ARN, un paso fundamental en la expresión génica. Este proceso implica la escisión precisa de las moléculas de ARN precursoras, guiada por endonucleasas, para generar ARN funcionales esenciales para varias funciones celulares. Las endonucleasas escinden selectivamente los ARN precursores en sitios específicos, definiendo los límites de los segmentos de ARN funcionales durante el procesamiento del ARN. El resultado del procesamiento del ARN es la producción de moléculas de ARN funcionales, como los ARN de transferencia (ARNt) y los ARN ribosómicos (ARNr) . Las endonucleasas contribuyen a la precisión de este proceso, asegurando la formación de especies de ARN maduras y funcionales.
Las endonucleasas como la ARNasa P y la ARNt Z (ELAC2) transforman los ARNt precursores en ARNt maduros y funcionales, cruciales para una traducción precisa durante la síntesis de proteínas. [17] En la biogénesis de los ribosomas, las endonucleasas de la familia de la ARNasa III , como DROSHA , desempeñan un papel en el procesamiento de los ARNr precursores, lo que contribuye al ensamblaje de ribosomas funcionales. [18]
DICER y DROSHA, también de la familia de la ARNasa III, desempeñan un papel en el procesamiento del pre-miARN a miARN funcional. [19]
La endonucleasa DNasa1L2 también contribuye de forma destacada a la eliminación del ADN durante la formación del cabello y las uñas. Este proceso es esencial para la maduración de las estructuras del cabello y las uñas y es crucial para la transformación de las células en estructuras duraderas y queratinizadas , asegurando la fuerza e integridad del cabello y las uñas. [20]
Se pueden encontrar endonucleasas de restricción que escinden dsADN estándar (ADN bicatenario), ssADN (ADN monocatenario) o incluso ARN. [ cita requerida ] Esta discusión está restringida al dsADN; sin embargo, la discusión se puede extender a lo siguiente:
Además, actualmente se están realizando investigaciones para construir endonucleasas de restricción sintéticas o artificiales, especialmente con sitios de reconocimiento que sean únicos dentro de un genoma. [ cita requerida ]
Las endonucleasas de restricción o enzimas de restricción suelen escindir de dos maneras: patrones con extremos romos o con extremos pegajosos. Un ejemplo de una endonucleasa de restricción de tipo I. [4] : 64
Además, existen endonucleasas no específicas de ADN/ARN , como las que se encuentran en Serratia marcescens , que actúan sobre dsADN, ssADN y ARN. [ cita requerida ]
A continuación se muestran tablas de endonucleasas procariotas y eucariotas comunes. [21]
El xeroderma pigmentosa es una enfermedad autosómica recesiva poco frecuente causada por una endonucleasa específica para la radiación ultravioleta defectuosa. Los pacientes con mutaciones no pueden reparar el daño del ADN causado por la luz solar. [26]
La anemia de células falciformes es una enfermedad causada por una mutación puntual. La secuencia alterada por la mutación elimina el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción MstII que reconoce la secuencia de nucleótidos. [27]
Las mutaciones de la endonucleasa de empalme del ARNt causan hipoplasia pontocerebelosa. Las hipoplasias pontocerebelosas (PCH) representan un grupo de trastornos neurodegenerativos autosómicos recesivos causados por mutaciones en tres de las cuatro subunidades diferentes del complejo de endonucleasa de empalme del ARNt. [28]
