Dicer , también conocida como endoribonucleasa Dicer o helicasa con motivo RNasa , es una enzima que en humanos está codificada por el gen DICER1 . Al ser parte de la familia RNasa III , Dicer escinde el ARN bicatenario (ARNds) y el pre-microARN (pre-miARN) en fragmentos cortos de ARN bicatenario llamados pequeños ARN de interferencia y microARN , respectivamente. Estos fragmentos tienen aproximadamente 20 a 25 pares de bases de largo con un saliente de dos bases en el extremo 3' . Dicer facilita la activación del complejo silenciador inducido por ARN (RISC), que es esencial para la interferencia del ARN . RISC tiene un componente catalítico Argonaute , que es una endonucleasa capaz de degradar el ARN mensajero (ARNm).
Dicer recibió su nombre en 2001 gracias a Emily Bernstein , estudiante de doctorado de Stony Brook , mientras realizaba una investigación en el laboratorio de Gregory Hannon en el Laboratorio Cold Spring Harbor . Bernstein intentó descubrir la enzima responsable de generar pequeños fragmentos de ARN a partir de ARN bicatenario. La capacidad de Dicer para generar alrededor de 22 fragmentos de ARN de nucleótidos se descubrió separándolo del complejo enzimático RISC después de iniciar la vía de ARNi con transfección de ARNbc . Este experimento demostró que RISC no era responsable de generar los pequeños fragmentos de nucleótidos observables. Experimentos posteriores que probaron la capacidad de las enzimas de la familia RNasa III para crear fragmentos de ARN limitaron la búsqueda a Drosophila CG4792, ahora llamada Dicer. [5]
Los ortólogos de Dicer están presentes en muchos otros organismos. [6] En el musgo Physcomitrella patens, DCL1b, una de las cuatro proteínas DICER, no participa en la biogénesis de miARN, pero sí en cortar en cubitos las transcripciones objetivo de miARN. Así, se descubrió un nuevo mecanismo de regulación de la expresión genética : el silenciamiento epigenético de genes mediante miARN. [7]
En términos de estructura cristalina, el primer Dicer que se exploró fue el del protozoo Giardia intestinalis . El trabajo fue realizado por Ian MacRae mientras realizaba una investigación como becario postdoctoral en el laboratorio de Jennifer Doudna en la Universidad de California, Berkeley . Se descubrieron mediante cristalografía de rayos X un dominio PAZ y dos dominios RNasa III . El tamaño de la proteína es de 82 kDa , lo que representa el núcleo funcional conservado que posteriormente se encontró en proteínas Dicer más grandes en otros organismos; por ejemplo, en humanos es de 219 kDa. La diferencia de tamaño entre los humanos y G. intestinalis Dicer se debe a que al menos cinco dominios diferentes están presentes dentro del Dicer humano. Estos dominios son importantes en la regulación de la actividad de Dicer, el procesamiento de dsRNA y el funcionamiento del factor de proteína de interferencia de ARN. [8]
El dicer humano (también conocido como hsDicer o DICER1 ) está clasificado como ribonucleasa III porque escinde el ARN bicatenario. Además de dos dominios RNaseIII, contiene un dominio helicasa , un dominio PAZ ( Piwi / Argonaute /Zwille) , [10] [11] y dos dominios de unión a ARN bicatenario (DUF283 y dsRBD). [8] [12]
La investigación actual sugiere que el dominio PAZ es capaz de unirse al saliente 3' de 2 nucleótidos del ARNds, mientras que los dominios catalíticos de RNasaIII forman un pseudodímero alrededor del ARNds para iniciar la escisión de las cadenas. Esto da como resultado un acortamiento funcional de la cadena de dsRNA. La distancia entre los dominios PAZ y RNaseIII está determinada por el ángulo de la hélice del conector e influye en la longitud del producto de microARN. [9] El dominio dsRBD se une al dsRNA, aunque no se ha definido el sitio de unión específico del dominio. Es posible que este dominio funcione como parte de un complejo con otras proteínas reguladoras (TRBP en humanos, R2D2, Loqs en Drosophila) para posicionar eficazmente los dominios RNaseIII y así controlar la especificidad de los productos de sRNA. [13] El dominio helicasa ha sido implicado en el procesamiento de sustratos largos. [13]
La interferencia de ARN es un proceso en el que la descomposición de moléculas de ARN en miARN inhibe la expresión genética de secuencias específicas de ARNm del huésped. El miARN se produce dentro de la célula a partir del miARN primario (pri-miARN) en el núcleo . Estas largas secuencias se escinden en miARN precursores más pequeños (pre-miARN), que suelen tener 70 nucleótidos con una estructura en horquilla . Los pri-miARN son identificados por DGCR8 y Drosha los escinde para formar el pre-miARN, un proceso que ocurre en el núcleo. Estos pre-miARN luego se exportan al citoplasma, donde Dicer los escinde para formar miARN maduro. [15]
Se producen pequeños ARN de interferencia (ARNip) que funcionan de manera similar al miARN al escindir el ARN bicatenario con Dicer en fragmentos más pequeños, de 21 a 23 nucleótidos de longitud. [13] Tanto los miARN como los siARN activan el complejo silenciador inducido por ARN (RISC), que encuentra la secuencia de ARNm diana complementaria y escinde el ARN utilizando la RNasa. [16] Esto a su vez silencia el gen particular mediante interferencia de ARN. [17] Los ARNip y los miARN se diferencian en el hecho de que los ARNip suelen ser específicos de la secuencia del ARNm, mientras que los miARN no son completamente complementarios a la secuencia del ARNm. Los miARN pueden interactuar con objetivos que tienen secuencias similares, lo que inhibe la traducción de diferentes genes. [18] En general, la interferencia de ARN es una parte esencial de los procesos normales dentro de organismos como los humanos, y es un área que se está investigando como herramienta de diagnóstico y terapéutica para objetivos de cáncer. [15]
La degeneración macular relacionada con la edad es una causa importante de ceguera en los países desarrollados. El papel de Dicer en esta enfermedad se hizo evidente después de que se descubrió que los pacientes afectados mostraban niveles reducidos de Dicer en el epitelio pigmentario de la retina (EPR). Los ratones con Dicer desactivado, pero que carecían de Dicer solo en su RPE, exhibieron síntomas similares. Sin embargo, otros ratones que carecían de proteínas importantes de la vía del ARNi, como Drosha y Pasha , no presentaban síntomas de degeneración macular como los ratones knockout para Dicer. Esta observación sugirió un papel específico de Dicer en la salud de la retina que era independiente de la vía del ARNi y, por lo tanto, no era una función de la generación de si/miARN. Se descubrió que una forma de ARN llamada Alu RNA (las transcripciones de ARN de los elementos alu ) estaba elevada en pacientes con niveles insuficientes de Dicer. Estas hebras de ARN no codificantes pueden formar bucles formando estructuras de ARNbc que Dicer degradaría en una retina sana. Sin embargo, con niveles insuficientes de Dicer, la acumulación de ARN alu conduce a la degeneración del EPR como resultado de la inflamación. [19] [20]
Los perfiles de expresión de miARN alterados en cánceres malignos sugieren un papel fundamental de los miARN y, por lo tanto, influyen en el desarrollo y el pronóstico del cáncer. Los miARN pueden funcionar como supresores de tumores y, por tanto, su expresión alterada puede dar lugar a tumorigénesis . [21] En el análisis del cáncer de pulmón y de ovario, el mal pronóstico y la disminución de los tiempos de supervivencia de los pacientes se correlacionan con una disminución de la expresión de dicer y drosha . Los niveles reducidos de ARNm de dicer se correlacionan con el estadio tumoral avanzado. Sin embargo, se ha demostrado que la alta expresión de dicer en otros cánceres, como el de próstata [22] y el de esófago, se correlaciona con un mal pronóstico del paciente. Esta discrepancia entre los tipos de cáncer sugiere que los procesos reguladores de ARNi únicos que involucran a Dicer difieren entre los diferentes tipos de tumores. [15]
Dicer también participa en la reparación del ADN . El daño al ADN aumenta en células de mamíferos con una expresión disminuida de Dicer como resultado de una menor eficiencia de la reparación del daño del ADN y otros mecanismos. Por ejemplo, el ARNip de roturas de doble cadena (producido por Dicer) puede actuar como guías para complejos proteicos implicados en los mecanismos de reparación de roturas de doble cadena y también puede dirigir modificaciones de la cromatina . Además, los patrones de expresión de los miARN cambian como resultado del daño en el ADN causado por la radiación ionizante o ultravioleta . Los mecanismos de ARNi son responsables del silenciamiento de los transposones y, en su ausencia, como cuando se desactiva o desactiva Dicer, pueden provocar transposones activados que causan daños en el ADN. La acumulación de daño en el ADN puede dar lugar a células con mutaciones oncogénicas y, por tanto, al desarrollo de un tumor. [15]
Se ha demostrado que el bocio multinodular con schwannomatosis es una afección autosómica dominante asociada con mutaciones en este gen. [23]
La infección por virus de ARN puede desencadenar la cascada de ARNi. Es probable que Dicer esté involucrado en la inmunidad viral , ya que los virus que infectan células vegetales y animales contienen proteínas diseñadas para inhibir la respuesta de ARNi. En los seres humanos, los virus VIH-1 , influenza y vaccinia codifican dichas proteínas supresoras de ARNi. La inhibición de Dicer es beneficiosa para el virus, ya que Dicer puede escindir el ARNbc viral y cargar el producto en RISC, lo que da como resultado una degradación dirigida del ARNm viral; combatiendo así la infección. Otro mecanismo potencial para la patogénesis viral es el bloqueo de dicer como una forma de inhibir las vías celulares de miARN. [24]
En Drosophila, Dicer-1 genera microARN (miARN) mediante el procesamiento de pre-miARN, Dicer-2 es responsable de producir pequeños ARN de interferencia (ARNip) a partir de ARN bicatenario largo (ARNds). [25] Los insectos pueden utilizar Dicer como un potente antiviral . Este hallazgo es especialmente significativo dado que los mosquitos son responsables de la transmisión de muchas enfermedades virales, incluidos los arbovirus potencialmente mortales : el virus del Nilo Occidental , el dengue y la fiebre amarilla . [26] Si bien los mosquitos, más específicamente la especie Aedes aegypti , sirven como vectores para estos virus, no son el huésped previsto del virus. La transmisión se produce como resultado de la necesidad que tiene la hembra del mosquito de sangre de vertebrados para desarrollar sus huevos. La vía del ARNi en los insectos es muy similar a la de otros animales; Dicer-2 escinde el ARN viral y lo carga en el complejo RISC, donde una hebra sirve como plantilla para la producción de productos de ARNi y la otra se degrada. Los insectos con mutaciones que conducen a componentes no funcionales de su vía de ARNi muestran cargas virales aumentadas para los virus que portan o una mayor susceptibilidad a los virus de los que son huéspedes. Al igual que los humanos, los virus de los insectos han desarrollado mecanismos para evitar la vía del ARNi. Como ejemplo, el virus Drosophila C codifica la proteína 1A que se une al ARNbc protegiéndolo así de la escisión del dicer y de la carga de RISC. Heliothis virescens ascovirus 3a codifica una enzima RNasa III similar a los dominios RNasa III de dicer que puede competir por el sustrato de ARNbc y degradar los dúplex de ARNip para evitar la carga de RISC. [27]
Dicer se puede utilizar para identificar si hay tumores presentes en el cuerpo según el nivel de expresión de la enzima. Un estudio demostró que muchos pacientes que tenían cáncer tenían niveles de expresión reducidos de Dicer. El mismo estudio demostró que una menor expresión de Dicer se correlacionaba con una menor duración de la supervivencia del paciente. [15] Además de ser una herramienta de diagnóstico , Dicer se puede utilizar para tratar pacientes mediante la inyección de ARNip extraño por vía intravenosa para provocar el silenciamiento de genes. [28]
Se demostró que el ARNip se administra de dos maneras en especies de mamíferos como los ratones. Una forma sería inyectar directamente en el sistema, lo que no requeriría la función Dicer. Otra forma sería introducirlo mediante plásmidos que codifican ARN en horquilla corta, que Dicer escinde en ARNip. [29]
Una de las ventajas de utilizar Dicer para producir ARNip de forma terapéutica sería la especificidad y diversidad de objetivos a los que puede afectar en comparación con lo que se utiliza actualmente, como anticuerpos o inhibidores de pequeño peso molecular . En general, los inhibidores de pequeño peso molecular son difíciles en términos de especificidad y tienen efectos secundarios insoportables. Los anticuerpos son tan específicos como el ARNip, pero tienen la limitación de poder usarse únicamente contra ligandos o receptores de superficie . Por otro lado, la baja eficacia de la captación intracelular es el principal obstáculo para la inyección de ARNip. [15] El ARNip inyectado tiene poca estabilidad en la sangre y provoca estimulaciones de inmunidad no específica . [30] Además, la producción terapéutica de miARN carece de especificidad porque solo se requiere un emparejamiento de bases de 6 a 8 nucleótidos para que el miARN se una al ARNm. [31]
Los genomas de las plantas codifican proteínas similares a los dicer con funciones y dominios proteicos similares a los de los dicer de animales e insectos. Por ejemplo, en el organismo modelo Arabidopsis thaliana , se producen cuatro proteínas parecidas a dadores y se denominan DCL1 a DCL4. DCL1 participa en la generación de miARN y la producción de ARNs a partir de repeticiones invertidas. DCL2 crea ARNip a partir de transcripciones antisentido que actúan en cis y que ayudan en la inmunidad y defensa viral. DCL3 genera ARNip que ayuda en la modificación de la cromatina y DCL4 participa en el metabolismo del ARNip de acción trans y el silenciamiento de la transcripción a nivel postranscripcional. Además, DCL 1 y 3 son importantes para la floración de Arabidopsis. En Arabidopsis, la eliminación del DCL no causa problemas graves de desarrollo.
El arroz y las uvas también producen DCL, ya que el mecanismo de corte en cubitos es una estrategia de defensa común de muchos organismos. El arroz ha desarrollado otras funciones para las 5 DCL que produce y juegan un papel más importante en la función y el desarrollo que en Arabidopsis. Además, los patrones de expresión difieren entre los diferentes tipos de células vegetales de arroz, mientras que la expresión en Arabidopsis es más homogénea . La expresión de DCL del arroz puede verse afectada por condiciones de estrés biológico, como sequía, salinidad y frío. Por tanto, estos factores estresantes pueden disminuir la resistencia viral de una planta. A diferencia de Arabidopsis, la pérdida de función de las proteínas DCL provoca defectos de desarrollo en el arroz. [32]
