La diferenciación dirigida es una metodología de bioingeniería en la interfaz de la biología de células madre , la biología del desarrollo y la ingeniería de tejidos . [1] Básicamente, consiste en aprovechar el potencial de las células madre restringiendo su diferenciación in vitro hacia un tipo de célula o tejido específico de interés. [2] Las células madre son, por definición, pluripotentes , capaces de diferenciarse en varios tipos de células, como neuronas , [3] cardiomiocitos , hepatocitos , etc. Una diferenciación dirigida eficiente requiere una comprensión detallada del linaje y la decisión sobre el destino celular , que a menudo proporciona la biología del desarrollo. [2] [4]
Durante la diferenciación, las células pluripotentes toman una serie de decisiones de desarrollo para generar primero las tres capas germinales ( ectodermo , mesodermo y endodermo ) del embrión y los progenitores intermedios, [5] seguidos de decisiones posteriores o puntos de control, dando lugar a todos los tejidos maduros del cuerpo. [4] El proceso de diferenciación se puede modelar como una secuencia de decisiones binarias basadas en modelos probabilísticos o estocásticos . La biología del desarrollo y la embriología proporcionan el conocimiento básico de la diferenciación de los tipos de células a través del análisis de mutaciones , el rastreo de linaje, la micromanipulación del embrión y los estudios de expresión genética . La diferenciación celular y la organogénesis tisular implican un conjunto limitado de vías de señalización del desarrollo . [4] Por lo tanto, es posible dirigir el destino celular controlando las decisiones celulares a través de la señalización extracelular, imitando las señales del desarrollo.
La diferenciación dirigida se aplica principalmente a células madre pluripotentes (PSC) de origen mamífero, en particular células de ratón y humanas para aplicaciones de investigación biomédica . [5] Desde el descubrimiento de las células madre embrionarias (ES) (1981) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS) (2006), el material de origen es potencialmente ilimitado. [1] [4] [6] Históricamente, también se han utilizado células de carcinoma embrionario (EC). [7] Se han utilizado fibroblastos u otros tipos de células diferenciadas para estrategias de reprogramación directa . [1]
La diferenciación celular implica una transición de un modo proliferativo a un modo de diferenciación. La diferenciación dirigida consiste en imitar las decisiones de desarrollo (desarrollo del embrión) in vitro utilizando las células madre como material de origen. [1] Para este propósito, las células madre pluripotentes (PSC) se cultivan en condiciones controladas que involucran un sustrato específico o matrices extracelulares que promueven la adhesión y diferenciación celular, y definen composiciones de medios de cultivo . [4] Un número limitado de factores de señalización, como factores de crecimiento o moléculas pequeñas , que controlan la diferenciación celular, se aplica de manera secuencial o combinatoria, en dosis y tiempos de exposición variables. [1] La diferenciación adecuada del tipo de célula de interés se verifica analizando marcadores específicos del tipo de célula , perfil de expresión génica y ensayos funcionales. [1]
Las células y matrices de soporte proporcionan señales ambientales similares a las del desarrollo. [8]
Este método consiste en exponer las células a moduladores de vías de señalización específicas y manipular las condiciones de cultivo celular (ambientales o exógenas) para imitar la secuencia natural de decisiones de desarrollo para producir un tipo de célula/tejido determinado. [1] [8] Una desventaja de este enfoque es la necesidad de tener una buena comprensión de cómo se forma el tipo de célula de interés. [1]
Este método, también conocido como transdiferenciación o conversión directa, consiste en sobreexpresar uno o varios factores, generalmente factores de transcripción, introducidos en las células. [1] El material de partida puede ser células madre pluripotentes (PSCs), o cualquier tipo de célula diferenciada como fibroblastos. El principio fue demostrado por primera vez en 1987 con los factores miogénicos MyoD. [9] Un inconveniente de este enfoque es la introducción de ácido nucleico extraño en las células y la expresión forzada de factores de transcripción cuyos efectos no se comprenden completamente.
Este método consiste en seleccionar el tipo celular de interés, generalmente con resistencia a antibióticos . Para este propósito, las células del material de origen se modifican para que contengan un casete de resistencia a antibióticos bajo un promotor específico del tipo celular objetivo . [10] [11] Solo las células comprometidas con el linaje de interés sobreviven a la selección .
La diferenciación dirigida proporciona una fuente potencialmente ilimitada y manipulable de células y tejidos. Algunas aplicaciones se ven perjudicadas por el fenotipo inmaduro del tipo celular derivado de las células madre pluripotentes (PSC), lo que limita los estudios fisiológicos y funcionales posibles. [6] Surgieron varios dominios de aplicación:
Para la ciencia básica , en particular la biología del desarrollo y la biología celular , las células derivadas de PSC permiten estudiar a nivel molecular y celular cuestiones fundamentales in vitro, [5] que de otro modo habrían sido extremadamente difíciles o imposibles de estudiar por razones técnicas y éticas in vivo, como el desarrollo embrionario humano. En particular, las células en diferenciación son susceptibles de estudios cuantitativos y cualitativos. [8] También se pueden estudiar procesos más complejos in vitro y se ha descrito la formación de organoides, incluidos los cerebroides, la copa óptica y el riñón .
Los tipos de células diferenciadas de las células madre pluripotentes (PSC) se están evaluando como modelos preclínicos in vitro de enfermedades humanas. [5] Los tipos de células humanas en un plato proporcionan una alternativa a los ensayos preclínicos tradicionales que utilizan células animales, humanas inmortalizadas o cultivos primarios de biopsias , que tienen sus limitaciones. Los tipos de células clínicamente relevantes, es decir, los tipos de células afectados en las enfermedades, son un foco principal de investigación, esto incluye hepatocitos , células beta de los islotes de Langerhans , [12] cardiomiocitos y neuronas . La detección de fármacos se realiza en cultivos celulares miniaturizados en placas de múltiples pocillos o en un chip. [6]
Las células derivadas de PSC de pacientes se utilizan in vitro para recrear patologías específicas. [6] El tipo específico de célula afectada en la patología es la base del modelo. Por ejemplo, las neuronas motoras se utilizan para estudiar la atrofia muscular espinal (AME) y los cardiomiocitos [2] se utilizan para estudiar la arritmia . Esto puede permitir una mejor comprensión de la patogénesis y el desarrollo de nuevos tratamientos a través del descubrimiento de fármacos. [6] Los tipos de células inmaduras derivadas de PSC se pueden madurar in vitro mediante varias estrategias, como el envejecimiento in vitro, para modelar enfermedades relacionadas con la edad in vitro. Las principales enfermedades que se modelan con células derivadas de PSC son la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), el Alzheimer (EA), el Parkinson (PD), el síndrome del cromosoma X frágil (SXF), la enfermedad de Huntington (HD), el síndrome de Down , la atrofia muscular espinal (AME), las distrofias musculares , [13] [14] la fibrosis quística , el síndrome de QT largo y la diabetes tipo I. [6]
La fuente potencialmente ilimitada de células y tejidos puede tener una aplicación directa para la ingeniería de tejidos , el reemplazo celular y el trasplante después de lesiones agudas y cirugía reconstructiva . [2] [5] Estas aplicaciones se limitan a los tipos de células que se pueden diferenciar de manera eficiente y segura a partir de PSC humanas con la organogénesis adecuada . [1] Los órganos descelularizados también se están utilizando como andamiaje tisular para la organogénesis. El material de origen puede ser células sanas normales de otro donante (trasplante heterólogo) o corregidas genéticamente del mismo paciente (autólogo). Se han planteado preocupaciones sobre la seguridad del paciente debido a la posibilidad de contaminar células no diferenciadas. El primer ensayo clínico que utilizó células derivadas de hESC fue en 2011. [15] El primer ensayo clínico que utilizó células derivadas de hiPSC comenzó en 2014 en Japón. [16]
