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Unidad formadora de colonias

En microbiología , una unidad formadora de colonias ( UFC, ufc o UFC ) es una unidad que estima el número de células microbianas ( bacterias , hongos , virus , etc.) en una muestra que son viables , capaces de multiplicarse mediante fisión binaria en condiciones controladas. El recuento con unidades formadoras de colonias requiere cultivar los microbios y cuenta solo las células viables, en contraste con el examen microscópico que cuenta todas las células, vivas o muertas. La apariencia visual de una colonia en un cultivo celular requiere un crecimiento significativo y, al contar colonias , es incierto si la colonia surgió de una sola célula o de un grupo de células. Expresar los resultados como unidades formadoras de colonias refleja esta incertidumbre.

Teoría

Se coloca una dilución hecha con bacterias y agua peptonada en una placa de agar ( agar de recuento en placa para muestras de alimentos o agar de soja Trypticase para muestras clínicas) y se extiende sobre la placa inclinándola en el patrón que se muestra.

El propósito del recuento en placa es estimar el número de células presentes en función de su capacidad para dar lugar a colonias en condiciones específicas de temperatura, tiempo y medio nutritivo. Teóricamente, una célula viable puede dar lugar a una colonia a través de la replicación. Sin embargo, las células solitarias son la excepción en la naturaleza y, en la mayoría de los casos, el progenitor de una colonia es una masa de células depositadas juntas. [1] [2] Además, muchas bacterias crecen en cadenas (p. ej. , Streptococcus ) o grupos (p. ej., Staphylococcus ). La estimación de los números microbianos por UFC, en la mayoría de los casos, subestimará el número de células vivas presentes en una muestra por estas razones. Esto se debe a que el recuento de UFC supone que cada colonia está separada y fundada por una sola célula microbiana viable. [3]

El recuento de placa es lineal para E. coli en el rango de 30 a 300 UFC en una placa de Petri de tamaño estándar . [4] Por lo tanto, para garantizar que una muestra producirá UFC en este rango, se requiere diluir la muestra y sembrar varias diluciones. Normalmente, se utilizan diluciones diez veces mayores y la serie de diluciones se siembra en réplicas de 2 o 3 en el rango de diluciones elegido. A menudo se siembran 100 μL, pero también se utilizan cantidades mayores de hasta 1 mL. Los volúmenes de siembra más altos aumentan los tiempos de secado, pero a menudo no dan como resultado una mayor precisión, ya que pueden ser necesarios pasos de dilución adicionales. [5] La UFC/placa se lee de una placa en el rango lineal y luego se deduce matemáticamente la UFC/g (o UFC/mL) del original, teniendo en cuenta la cantidad sembrada y su factor de dilución.

A menudo se diluye en serie una solución de bacterias a una concentración desconocida para obtener al menos una placa con un número contable de bacterias. En esta figura, la placa "x10" es adecuada para el recuento.

Una ventaja de este método es que diferentes especies microbianas pueden dar lugar a colonias claramente diferentes entre sí, tanto microscópicamente como macroscópicamente . La morfología de la colonia puede ser de gran utilidad en la identificación del microorganismo presente. [6]

Un conocimiento previo de la anatomía microscópica del organismo puede permitir entender mejor cómo se relacionan las UFC/ml observadas con la cantidad de células viables por mililitro. Alternativamente, es posible disminuir la cantidad promedio de células por UFC en algunos casos agitando la muestra en un vórtice antes de realizar la dilución. Sin embargo, muchos microorganismos son delicados y sufrirían una disminución en la proporción de células viables al colocarlos en un vórtice. [7]

Notación logarítmica

Las concentraciones de unidades formadoras de colonias se pueden expresar utilizando notación logarítmica, donde el valor mostrado es el logaritmo de base 10 de la concentración. [8] [9] [10] Esto permite calcular la reducción logarítmica de un proceso de descontaminación como una simple resta.

Usos

Las unidades formadoras de colonias se utilizan para cuantificar los resultados en muchos métodos de recuento y siembra microbiológicos, incluidos:

Sin embargo, con las técnicas que requieren el uso de una placa de agar, no se puede utilizar ninguna solución fluida porque no se puede desconocer la pureza de la muestra y no es posible contar las células una por una en el líquido. [13]

Herramientas para contar colonias

La forma tradicional de contar las UFC es con un "contador de clics" y un bolígrafo. Cuando las colonias son demasiado numerosas, es una práctica habitual contar las UFC solo en una fracción de la placa.

El recuento de colonias se realiza tradicionalmente de forma manual utilizando un bolígrafo y un contador de clics. Esta es generalmente una tarea sencilla, pero puede volverse muy laboriosa y consumir mucho tiempo cuando se deben enumerar muchas placas. Alternativamente, se pueden utilizar soluciones semiautomáticas (software) y automáticas (hardware + software). [14] [15] [16]

Software para contar UFC

Las colonias se pueden enumerar a partir de fotografías de las placas utilizando herramientas de software. Los experimentadores generalmente tomarían una fotografía de cada placa que necesitan contar y luego analizarían todas las fotografías (esto se puede hacer con una simple cámara digital o incluso una cámara web). Dado que toma menos de 10 segundos tomar una sola fotografía, a diferencia de varios minutos para contar las UFC manualmente, este enfoque generalmente ahorra mucho tiempo. Además, es más objetivo y permite la extracción de otras variables como el tamaño y el color de las colonias. [16]

Además del software basado en computadoras de escritorio tradicionales, existen aplicaciones para dispositivos Android e iOS para el recuento de colonias semiautomático y automatizado. La cámara integrada se utiliza para tomar fotografías de la placa de agar y se utiliza un algoritmo interno o externo para procesar los datos de las fotografías y estimar el número de colonias. [21] [22] [23]

Sistemas automatizados

Muchos de los sistemas automatizados se utilizan para contrarrestar el error humano , ya que muchas de las técnicas de investigación realizadas por humanos que cuentan células individuales tienen una alta probabilidad de error. Debido al hecho de que los investigadores cuentan regularmente las células manualmente con la ayuda de una luz transmitida, esta técnica propensa a errores puede tener un efecto significativo en la concentración calculada en el medio líquido principal cuando las células son pocas. [24]

Un contador de colonias automatizado que utiliza procesamiento de imágenes.

Algunos fabricantes de biotecnología también ofrecen sistemas completamente automatizados. [25] [26] Por lo general, son caros y no tan flexibles como el software independiente, ya que el hardware y el software están diseñados para funcionar juntos para una configuración específica. [18] Alternativamente, algunos sistemas automáticos utilizan el paradigma de siembra en espiral . [27]

Algunos de los sistemas automatizados, como los de MATLAB, permiten contar las células sin necesidad de teñirlas, lo que permite reutilizar las colonias para otros experimentos sin el riesgo de matar a los microorganismos con las tinciones. Sin embargo, una desventaja de estos sistemas automatizados es que resulta extremadamente difícil diferenciar entre los microorganismos con polvo o rayas en las placas de agar sangre, ya que tanto el polvo como las rayas pueden crear una combinación muy diversa de formas y apariencias. [28]

Unidades alternativas

En lugar de unidades formadoras de colonias, se pueden utilizar los parámetros Número más probable (NMP) y Unidades de Fishman modificadas (MFU) [29] . El método del Número más probable cuenta las células viables y es útil cuando se enumeran bajas concentraciones de células o se enumeran microbios en productos donde las partículas hacen que el recuento en placa sea poco práctico. [30] Las Unidades de Fishman modificadas tienen en cuenta las bacterias que son viables, pero no cultivables.

Véase también

Referencias

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Lectura adicional