Un vector de expresión , también conocido como construcción de expresión , suele ser un plásmido o virus diseñado para la expresión génica en células. El vector se utiliza para introducir un gen específico en una célula diana y puede controlar el mecanismo celular de síntesis de proteínas para producir la proteína codificada por el gen. Los vectores de expresión son las herramientas básicas en biotecnología para la producción de proteínas .
El vector está diseñado para contener secuencias reguladoras que actúan como regiones potenciadoras y promotoras y conducen a una transcripción eficaz del gen transportado en el vector de expresión. [1] El objetivo de un vector de expresión bien diseñado es la producción eficiente de proteínas, y esto puede lograrse mediante la producción de una cantidad significativa de ARN mensajero estable , que luego puede traducirse en proteínas. La expresión de una proteína puede estar estrictamente controlada y la proteína solo se produce en cantidades significativas cuando es necesario mediante el uso de un inductor ; sin embargo, en algunos sistemas la proteína puede expresarse de manera constitutiva. Escherichia coli se utiliza habitualmente como huésped para la producción de proteínas , pero también se pueden utilizar otros tipos de células. Un ejemplo del uso de vector de expresión es la producción de insulina , que se utiliza para tratamientos médicos de la diabetes .
Un vector de expresión tiene características que puede tener cualquier vector , como un origen de replicación , un marcador seleccionable y un sitio adecuado para la inserción de un gen como el sitio de clonación múltiple . El gen clonado puede transferirse desde un vector de clonación especializado a un vector de expresión, aunque es posible clonarlo directamente en un vector de expresión. El proceso de clonación normalmente se realiza en Escherichia coli . Los vectores utilizados para la producción de proteínas en organismos distintos de E. coli pueden tener, además de un origen de replicación adecuado para su propagación en E. coli , elementos que les permitan mantenerse en otro organismo, y estos vectores se denominan vectores lanzadera .
Un vector de expresión debe tener elementos necesarios para la expresión génica. Estos pueden incluir un promotor , la secuencia de inicio de la traducción correcta, como un sitio de unión ribosomal y un codón de inicio , un codón de terminación y una secuencia de terminación de la transcripción . [2] Existen diferencias en la maquinaria para la síntesis de proteínas entre procariotas y eucariotas, por lo tanto los vectores de expresión deben tener los elementos de expresión que sean apropiados para el huésped elegido. Por ejemplo, los vectores de expresión de procariotas tendrían una secuencia de Shine-Dalgarno en su sitio de inicio de traducción para la unión de ribosomas, mientras que los vectores de expresión de eucariotas contendrían la secuencia consenso de Kozak .
El promotor inicia la transcripción y, por tanto, es el punto de control de la expresión del gen clonado. Los promotores utilizados en el vector de expresión normalmente son inducibles , lo que significa que la síntesis de proteínas sólo se inicia cuando es necesario mediante la introducción de un inductor como IPTG . Sin embargo, la expresión génica también puede ser constitutiva (es decir, la proteína se expresa constantemente) en algunos vectores de expresión. Puede producirse un bajo nivel de síntesis de proteínas constitutivas incluso en vectores de expresión con promotores estrechamente controlados.
Después de la expresión del producto génico, puede ser necesario purificar la proteína expresada; sin embargo, separar la proteína de interés de la gran mayoría de las proteínas de la célula huésped puede ser un proceso prolongado. Para facilitar este proceso de purificación, se puede agregar una etiqueta de purificación al gen clonado. Esta etiqueta podría ser una etiqueta de histidina (His) , otros péptidos marcadores o compañeros de fusión como la glutatión S-transferasa o la proteína de unión a maltosa . [3] Algunos de estos socios de fusión también pueden ayudar a aumentar la solubilidad de algunas proteínas expresadas. Otras proteínas de fusión, como la proteína verde fluorescente, pueden actuar como genes indicadores para la identificación de genes clonados con éxito o pueden usarse para estudiar la expresión de proteínas en imágenes celulares . [4] [5]
El vector de expresión se transforma o transfecta en la célula huésped para la síntesis de proteínas. Algunos vectores de expresión pueden tener elementos para la transformación o la inserción de ADN en el cromosoma del huésped, por ejemplo, los genes vir para la transformación de plantas y sitios de integrasa para la integración cromosómica.
Algunos vectores pueden incluir una secuencia de direccionamiento que puede dirigir la proteína expresada a una ubicación específica, como el espacio periplásmico de las bacterias.
Se pueden usar diferentes organismos para expresar la proteína diana de un gen y, por lo tanto, el vector de expresión usado tendrá elementos específicos para su uso en el organismo particular. El organismo más comúnmente utilizado para la producción de proteínas es la bacteria Escherichia coli . Sin embargo, no todas las proteínas se pueden expresar con éxito en E. coli , o expresarse con la forma correcta de modificaciones postraduccionales como las glicosilaciones, por lo que se pueden utilizar otros sistemas.
El huésped de expresión elegido para la expresión de muchas proteínas es Escherichia coli, ya que la producción de proteínas heterólogas en E. coli es relativamente simple y conveniente, además de rápida y barata. También está disponible una gran cantidad de plásmidos de expresión de E. coli para una amplia variedad de necesidades. Otras bacterias utilizadas para la producción de proteínas incluyen Bacillus subtilis .
La mayoría de las proteínas heterólogas se expresan en el citoplasma de E. coli . Sin embargo, no todas las proteínas formadas pueden ser solubles en el citoplasma, y las proteínas mal plegadas formadas en el citoplasma pueden formar agregados insolubles llamados cuerpos de inclusión . Estas proteínas insolubles requerirán replegamiento, lo que puede ser un proceso complicado y no necesariamente producir un alto rendimiento. [6] Las proteínas que tienen enlaces disulfuro a menudo no pueden plegarse correctamente debido al entorno reductor en el citoplasma que impide la formación de dichos enlaces, y una posible solución es dirigir la proteína al espacio periplásmico mediante el uso de un extremo N-terminal. secuencia de señales . Otra posibilidad es manipular el ambiente redox del citoplasma. [7] También se están desarrollando otros sistemas más sofisticados; Dichos sistemas pueden permitir la expresión de proteínas que antes se consideraban imposibles en E. coli , como las proteínas glicosiladas . [8] [9] [10]
Los promotores utilizados para estos vectores generalmente se basan en el promotor del operón lac o el promotor T7 , [11] y normalmente están regulados por el operador lac . Estos promotores también pueden ser híbridos de diferentes promotores, por ejemplo, el Tac-Promoter es un híbrido de promotores trp y lac . [12] Tenga en cuenta que los promotores lac o derivados de lac más comúnmente utilizados se basan en el mutante lac UV5 que es insensible a la represión de catabolitos . Este mutante permite la expresión de proteínas bajo el control del promotor lac cuando el medio de crecimiento contiene glucosa, ya que la glucosa inhibiría la expresión génica si se utiliza el promotor lac de tipo salvaje. [13] Sin embargo, la presencia de glucosa todavía se puede utilizar para reducir la expresión de fondo mediante la inhibición residual en algunos sistemas. [14]
Ejemplos de vectores de expresión de E. coli son la serie de vectores pGEX donde se utiliza glutatión S-transferasa como compañero de fusión y la expresión génica está bajo el control del promotor tac, [15] [16] [17] y la serie pET de vectores que utilizan un promotor T7 . [18]
Es posible expresar simultáneamente dos o más proteínas diferentes en E. coli utilizando diferentes plásmidos. Sin embargo, cuando se usan 2 o más plásmidos, cada plásmido necesita usar una selección de antibiótico diferente así como un origen de replicación diferente; de lo contrario, es posible que uno de los plásmidos no se mantenga de manera estable. Muchos plásmidos utilizados habitualmente se basan en el replicón ColE1 y, por tanto, son incompatibles entre sí; para que un plásmido basado en ColE1 coexista con otro en la misma célula, el otro necesitaría ser de un replicón diferente, por ejemplo, un plásmido basado en el replicón p15A tal como la serie de plásmidos pACYC. [19] Otro enfoque sería utilizar un único vector de dos cistrones o diseñar las secuencias codificantes en conjunto como una construcción bi o policistrónica. [20] [21]
Una levadura comúnmente utilizada para la producción de proteínas es Pichia pastoris . [22] Ejemplos de vectores de expresión de levadura en Pichia son la serie de vectores pPIC, y estos vectores utilizan el promotor AOX1 que es inducible con metanol . [23] Los plásmidos pueden contener elementos para la inserción de ADN extraño en el genoma de la levadura y una secuencia señal para la secreción de la proteína expresada. Las proteínas con enlaces disulfuro y glicosilación se pueden producir eficientemente en levadura. Otra levadura utilizada para la producción de proteínas es Kluyveromyces lactis y el gen se expresa impulsado por una variante del fuerte promotor de la lactasa LAC4. [24]
Saccharomyces cerevisiae se utiliza especialmente para estudios de expresión génica en levaduras, por ejemplo en sistemas de dos híbridos de levadura para el estudio de la interacción proteína-proteína. [25] Los vectores utilizados en el sistema de dos híbridos de levadura contienen parejas de fusión para dos genes clonados que permiten la transcripción de un gen informador cuando hay interacción entre las dos proteínas expresadas a partir de los genes clonados.
Como vector de expresión en este sistema se utiliza el baculovirus , un virus con forma de bastón que infecta células de insectos. [26] Como huésped se utilizan líneas celulares de insectos derivadas de lepidópteros (polillas y mariposas), como Spodoptera frugiperda . Una línea celular derivada del garfio de la col es de particular interés, ya que se ha desarrollado para crecer rápidamente y sin el costoso suero que normalmente se necesita para estimular el crecimiento celular. [27] [28] El vector lanzadera se llama bácmido y la expresión genética está bajo el control de un fuerte promotor pPolh. [29] El baculovirus también se ha utilizado con líneas celulares de mamíferos en el sistema BacMam . [30]
El baculovirus se utiliza normalmente para la producción de glicoproteínas , aunque las glicosilaciones pueden ser diferentes de las que se encuentran en los vertebrados. En general, su uso es más seguro que el virus de los mamíferos, ya que tiene un rango de huéspedes limitado y no infecta a los vertebrados sin modificaciones.
Muchos vectores de expresión de plantas se basan en el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens . [31] En estos vectores de expresión, el ADN que se insertará en la planta se clona en el ADN-T , un tramo de ADN flanqueado por una secuencia repetida directa de 25 pb en cada extremo, y que puede integrarse en el genoma de la planta. El ADN-T también contiene el marcador seleccionable. Agrobacterium proporciona un mecanismo de transformación e integración en el genoma de la planta, y los promotores de sus genes vir también pueden usarse para los genes clonados. Sin embargo, las preocupaciones sobre la transferencia de material genético bacteriano o viral a la planta han llevado al desarrollo de vectores llamados vectores intragénicos mediante los cuales se utilizan equivalentes funcionales del genoma de la planta para que no haya transferencia de material genético de una especie exótica a la planta. [32]
Los virus vegetales se pueden utilizar como vectores ya que el método Agrobacterium no funciona para todas las plantas. Ejemplos de virus vegetales utilizados son el virus del mosaico del tabaco (TMV), el virus X de la papa y el virus del mosaico del caupí . [33] La proteína puede expresarse como una fusión con la proteína de cubierta del virus y se muestra en la superficie de partículas virales ensambladas, o como una proteína no fusionada que se acumula dentro de la planta. La expresión en plantas utilizando vectores vegetales es a menudo constitutiva, [34] y un promotor constitutivo comúnmente utilizado en vectores de expresión vegetales es el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). [35] [36]
Los vectores de expresión de mamíferos ofrecen ventajas considerables para la expresión de proteínas de mamíferos sobre los sistemas de expresión bacterianos: plegamiento adecuado, modificaciones postraduccionales y actividad enzimática relevante. También puede ser más deseable que otros sistemas eucariotas no mamíferos, por lo que las proteínas expresadas pueden no contener las glicosilaciones correctas. Es de particular utilidad en la producción de proteínas asociadas a membranas que requieren chaperonas para un plegamiento y estabilidad adecuados, además de contener numerosas modificaciones postraduccionales. La desventaja, sin embargo, es el bajo rendimiento del producto en comparación con los vectores procarióticos, así como el coste de las técnicas implicadas. Su complicada tecnología y su posible contaminación con virus animales de expresión en células de mamíferos también han limitado su uso en la producción industrial a gran escala. [37]
Para producir proteínas se pueden usar líneas celulares de mamíferos cultivadas tales como el ovario de hámster chino (CHO) , COS , incluidas líneas celulares humanas tales como HEK y HeLa . Los vectores se transfectan en las células y el ADN puede integrarse en el genoma mediante recombinación homóloga en el caso de una transfección estable, o las células pueden transfectarse de forma transitoria. Ejemplos de vectores de expresión en mamíferos incluyen los vectores adenovirales , [38] las series de vectores plásmidos pSV y pCMV, vaccinia y vectores retrovirales , [39] así como baculovirus. [30] Los promotores del citomegalovirus (CMV) y SV40 se utilizan comúnmente en vectores de expresión de mamíferos para impulsar la expresión génica. También se conocen promotores no virales, tales como el promotor del factor de elongación (EF)-1. [40]
En este método in vitro de producción de proteínas se utiliza lisado de células de E. coli que contiene los componentes celulares necesarios para la transcripción y traducción. La ventaja de este sistema es que las proteínas se pueden producir mucho más rápido que las producidas in vivo, ya que no requiere tiempo para cultivar las células, pero también es más caro. En este sistema se pueden utilizar vectores utilizados para la expresión de E. coli , aunque también están disponibles vectores diseñados específicamente para este sistema. Los extractos de células eucariotas también se pueden usar en otros sistemas libres de células, por ejemplo, los sistemas de expresión libres de células de germen de trigo . [41] También se han producido sistemas libres de células de mamíferos. [42]
El vector de expresión en un huésped de expresión es ahora el método habitual utilizado en los laboratorios para producir proteínas para la investigación. La mayoría de las proteínas se producen en E. coli , pero para las proteínas glicosiladas y aquellas con enlaces disulfuro, se pueden utilizar sistemas de levaduras, baculovirus y mamíferos.
La mayoría de los productos farmacéuticos proteicos se producen actualmente mediante tecnología de ADN recombinante utilizando vectores de expresión. Estos productos farmacéuticos de péptidos y proteínas pueden ser hormonas, vacunas, antibióticos, anticuerpos y enzimas. [43] La primera proteína recombinante humana utilizada para el tratamiento de enfermedades, la insulina, se introdujo en 1982. [43] La biotecnología permite que estos productos farmacéuticos de péptidos y proteínas, algunos de los cuales antes eran raros o difíciles de obtener, se produzcan en grandes cantidades. También reduce los riesgos de contaminantes como virus del huésped, toxinas y priones . Los ejemplos del pasado incluyen la contaminación por priones en la hormona del crecimiento extraída de glándulas pituitarias extraídas de cadáveres humanos, que causó la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en pacientes que recibían tratamiento para el enanismo , [44] y contaminantes virales en el factor VIII de coagulación aislado de sangre humana que resultó en la transmisión de enfermedades virales como la hepatitis y el SIDA . [45] [46] Dicho riesgo se reduce o elimina por completo cuando las proteínas se producen en células huésped no humanas.
En los últimos años se han utilizado vectores de expresión para introducir genes específicos en plantas y animales para producir organismos transgénicos , por ejemplo en agricultura se utiliza para producir plantas transgénicas . Se han utilizado vectores de expresión para introducir un precursor de la vitamina A , el betacaroteno , en las plantas de arroz. Este producto se llama arroz dorado . Este proceso también se ha utilizado para introducir un gen en las plantas que produce un insecticida , llamado toxina Bacillus thuringiensis o toxina Bt, que reduce la necesidad de que los agricultores apliquen insecticidas ya que es producido por el organismo modificado. Además, los vectores de expresión se utilizan para prolongar la madurez de los tomates alterando la planta para que produzca menos sustancia química que hace que los tomates se pudran. [47] Ha habido controversias sobre el uso de vectores de expresión para modificar cultivos debido al hecho de que podría haber riesgos desconocidos para la salud, posibilidades de que las empresas patenten ciertos cultivos alimentarios genéticamente modificados y preocupaciones éticas. Sin embargo, esta técnica todavía se utiliza y se investiga intensamente.
También se han producido animales transgénicos para estudiar procesos bioquímicos animales y enfermedades humanas, o se han utilizado para producir productos farmacéuticos y otras proteínas. También pueden diseñarse para que tengan rasgos ventajosos o útiles. La proteína verde fluorescente a veces se utiliza como etiquetas, lo que da como resultado animales que pueden emitir fluorescencia, y esto se ha explotado comercialmente para producir el GloFish fluorescente .
La terapia génica es un tratamiento prometedor para una serie de enfermedades en las que un gen "normal" transportado por el vector se inserta en el genoma para reemplazar un gen "anormal" o complementar la expresión de un gen en particular. Generalmente se utilizan vectores virales, pero se están desarrollando otros métodos de administración no virales. El tratamiento sigue siendo una opción arriesgada debido al vector viral utilizado, que puede causar efectos nocivos, por ejemplo dando lugar a una mutación de inserción que puede provocar cáncer. [48] [49] Sin embargo, ha habido resultados prometedores. [50] [51]
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