La bioconjugación es una estrategia química para formar un enlace covalente estable entre dos moléculas, al menos una de las cuales es una biomolécula .
Los avances recientes en la comprensión de las biomoléculas permitieron su aplicación en numerosos campos como la medicina, el diagnóstico, la biocatálisis y los materiales. Las biomoléculas modificadas sintéticamente pueden tener diversas funcionalidades, como rastrear eventos celulares, revelar la función enzimática , determinar la biodistribución de proteínas , obtener imágenes de biomarcadores específicos y administrar medicamentos a células específicas. [1] [2] [3] [4] La bioconjugación es una estrategia crucial que vincula estas biomoléculas modificadas con diferentes sustratos . Además de las aplicaciones en la investigación biomédica, la bioconjugación también ha ganado importancia recientemente en la nanotecnología , como en los puntos cuánticos bioconjugados .
Los tipos más comunes de bioconjugación incluyen el acoplamiento de una molécula pequeña (como la biotina o un tinte fluorescente) a una proteína. Los conjugados anticuerpo-fármaco como Brentuximab vedotin y Gemtuzumab ozogamicina son ejemplos que entran en esta categoría. [5]
Las conjugaciones proteína-proteína, como el acoplamiento de un anticuerpo a una enzima o la unión de complejos proteicos, también se facilitan mediante bioconjugaciones. [6] [7]
Otras moléculas menos comunes utilizadas en la bioconjugación son los oligosacáridos , los ácidos nucleicos , los polímeros sintéticos como el polietilenglicol , [8] y los nanotubos de carbono . [9]
La síntesis de bioconjugados implica una variedad de desafíos, que van desde el uso simple e inespecífico de un marcador de colorante fluorescente hasta el diseño complejo de conjugados de anticuerpos y fármacos . [1] [3] Se han desarrollado varias reacciones de bioconjugación para modificar químicamente las proteínas. Los tipos comunes de reacciones de bioconjugación en proteínas son el acoplamiento de residuos de aminoácidos de lisina , cisteína y tirosina , así como la modificación de residuos de triptófano y de los extremos N y C. [1] [3] [4]
Sin embargo, estas reacciones suelen carecer de quimioselectividad y eficiencia, porque dependen de la presencia de aminoácidos nativos, que están presentes en grandes cantidades que dificultan la selectividad. Existe una necesidad cada vez mayor de estrategias químicas que puedan unir eficazmente moléculas sintéticas específicamente a las proteínas. Una estrategia consiste en instalar primero un grupo funcional único en una proteína y luego se utiliza una reacción bioortogonal para acoplar una biomolécula con este grupo funcional único. [1] Las reacciones bioortogonales dirigidas a grupos funcionales no nativos se utilizan ampliamente en la química de bioconjugación. Algunas reacciones importantes son la modificación de cetonas y aldehídos , la ligadura de Staudinger con azidas orgánicas , la cicloadición de Huisgen de azidas catalizada por cobre y la cicloadición de Huisgen de azidas promovida por cepas. [10] [11] [12] [13]
El residuo de lisina nucleófilo es comúnmente el sitio objetivo en la bioconjugación de proteínas, generalmente a través de ésteres de N -hidroxisuccinimidilo (NHS) reactivos con aminas . [3] Para obtener un número óptimo de residuos de lisina desprotonados , el pH de la solución acuosa debe estar por debajo del pKa del grupo lisina amonio , que es de alrededor de 10,5, por lo que el pH típico de la reacción es de aproximadamente 8 y 9. El reactivo común para la reacción de acoplamiento es el éster NHS (que se muestra en la primera reacción a continuación en la Figura 1 ), que reacciona con la lisina nucleofílica a través de un mecanismo de acilación de lisina . Otros reactivos similares son los isocianatos y los isotiocianatos que se someten a un mecanismo similar (que se muestra en la segunda y tercera reacciones en la Figura 1 a continuación). [1] Los fluoruros de benzoilo (que se muestran en la última reacción a continuación en la Figura 1 ), que permiten la modificación de proteínas con lisina en condiciones suaves (baja temperatura, pH fisiológico ), se propusieron recientemente como una alternativa a los reactivos específicos de lisina utilizados clásicamente. [14]
Debido a que la cisteína libre rara vez se encuentra en la superficie de las proteínas, es una excelente opción para la modificación quimioselectiva. [15] En condiciones básicas, los residuos de cisteína se desprotonarán para generar un nucleófilo de tiolato , que reaccionará con electrófilos blandos , como maleimidas y yodoacetamidas (que se muestran en las dos primeras reacciones en la Figura 2 a continuación). Como resultado, se forma un enlace carbono-azufre . Otra modificación de los residuos de cisteína implica la formación de un enlace disulfuro (que se muestra en la tercera reacción en la Figura 2 ). Los residuos de cisteína reducidos reaccionan con disulfuros exógenos , generando un nuevo enlace disulfuro en la proteína. A menudo se utiliza un exceso de disulfuros para impulsar la reacción, como 2-tiopiridona y 3-carboxi-4-nitrotiofenol. [1] [3] Se demostró que los alquinos con deficiencia de electrones reaccionan selectivamente con residuos de cisteína de proteínas en presencia de otros residuos de aminoácidos nucleofílicos. Dependiendo de la sustitución de alquino, estas reacciones pueden producir bioconjugados escindibles (cuando se usan derivados de alquinona) [16] o hidrolíticamente estables (cuando se usan 3-arilpropiolonitrilos ; la última reacción a continuación en la Figura 2 ). [17]
Los residuos de tirosina son relativamente poco reactivos; por lo tanto, no han sido objetivos populares para la bioconjugación. Un desarrollo reciente ha demostrado que la tirosina se puede modificar mediante reacciones de sustituciones aromáticas electrofílicas (EAS) y es selectiva para el carbono aromático adyacente al grupo hidroxilo fenólico . [1] Esto resulta particularmente útil en el caso de que no se puedan atacar los residuos de cisteína. Específicamente, el diazonio se acopla efectivamente con residuos de tirosina ( la sal de diazonio se muestra como reactivo en la primera reacción en la Figura 3 a continuación), y un sustituyente aceptor de electrones en la posición 4 de la sal de diazonio puede aumentar efectivamente la eficiencia de la reacción. Se informó que el derivado de diazodicarboxiamida cíclica como 4-fenil-1,2,4-triazol-3,5-diona (PTAD) tiene bioconjugación selectiva en residuos de tirosina (la segunda reacción en la Figura 3 a continuación). [18] También se describió que una reacción de tipo Mannich de tres componentes con aldehídos y anilinas (la última reacción en la Figura 3 ) era relativamente selectiva para la tirosina en condiciones de reacción suaves y optimizadas. [19]
Dado que los residuos de aminoácidos naturales suelen estar presentes en grandes cantidades, a menudo resulta difícil modificar un solo sitio. Se han desarrollado estrategias dirigidas a los extremos de las proteínas porque mejoraron en gran medida la selectividad del sitio de modificación de proteínas. Una de las modificaciones N-terminales implica la funcionalización del aminoácido terminal. La oxidación de los residuos de serina y treonina N-terminales puede generar aldehído N-terminal, que puede sufrir reacciones bioortogonales adicionales (que se muestran en la primera reacción en la Figura 4 ). Otro tipo de modificación implica la condensación de cisteína N-terminal con aldehído, generando tiazolidina que es estable a pH alto (segunda reacción en la Figura 4 ). Usando fosfato de piridoxal (PLP), varios aminoácidos N-terminales pueden sufrir transaminación para producir aldehído N-terminal , como glicina y ácido aspártico (tercera reacción en la Figura 4 ).
Un ejemplo de modificación del extremo C-terminal es la ligadura química nativa (NCL), que es el acoplamiento entre un tioéster C-terminal y una cisteína N-terminal ( Figura 5 ).
Una cetona o un aldehído se puede unir a una proteína mediante la oxidación de residuos de serina N-terminales o la transaminación con PLP. Además, se pueden introducir incorporando aminoácidos no naturales mediante el método Tirrell o el método Schultz. [10] Luego se condensarán selectivamente con una alcoxiamina y una hidrazina , produciendo derivados de oxima e hidrazona (que se muestran en la primera y segunda reacciones, respectivamente, en la Figura 6 ). Esta reacción es altamente quimioselectiva en términos de bioconjugación de proteínas, pero la velocidad de reacción es lenta. Los estudios mecanicistas muestran que el paso determinante de la velocidad es la deshidratación del intermedio tetraédrico , por lo que a menudo se emplea una solución ácida suave para acelerar el paso de deshidratación. [2]
La introducción de un catalizador nucleofílico puede mejorar significativamente la velocidad de reacción (como se muestra en la Figura 7 ). Por ejemplo, utilizando anilina como catalizador nucleofílico, un carbonilo protonado menos poblado se convierte en una base de Schiff protonada altamente poblada . [20] En otras palabras, genera una alta concentración de electrófilo reactivo. La ligadura de oxima puede ocurrir entonces fácilmente y se ha informado que la velocidad aumenta hasta 400 veces en condiciones de acidez leve. [20] La clave de este catalizador es que puede generar un electrófilo reactivo sin competir con el producto deseado.
Los desarrollos recientes que explotan los grupos funcionales proximales han permitido que las condensaciones de hidrazona [21] funcionen a 20 M −1 s −1 a pH neutro, mientras que se han descubierto condensaciones de oxima que proceden a 500-10000 M −1 s −1 a pH neutro sin adición. catalizadores. [22] [23]
La ligadura de Staudinger de azidas y fosfina se ha utilizado ampliamente en el campo de la biología química. Debido a que es capaz de formar un enlace amida estable en células vivas y animales, se ha aplicado a la modificación de la membrana celular , imágenes in vivo y otros estudios de bioconjugación. [24] [25] [26] [27]
En contraste con la reacción de Staudinger clásica, la ligadura de Staudinger es una reacción de segundo orden en la que el paso limitante de la velocidad es la formación de fosfazida (mecanismo de reacción específico que se muestra en la Figura 9 ). La trifenilfosfina primero reacciona con la azida para producir una azailida a través de un estado de transición de anillo de cuatro miembros , y luego una reacción intramolecular conduce al intermedio iminofosforano , que luego dará el enlace amida bajo hidrólisis. [28]
La azida se ha convertido en un objetivo popular para la modificación quimioselectiva de proteínas, porque son de tamaño pequeño y tienen un potencial de reacción termodinámico favorable . Una de esas reacciones de azida es la reacción de cicloadición [3+2] con alquino , pero la reacción requiere alta temperatura y a menudo produce mezclas de regioisómeros .
Una reacción mejorada desarrollada por el químico Karl Barry Sharpless involucra el catalizador de cobre (I), que acopla azida con alquino terminal que solo da 1,4 1,2,3 triazoles sustituidos con altos rendimientos (como se muestra a continuación en la Figura 11 ). El estudio mecanicista sugiere una reacción gradual. [13] El Cu (I) primero se acopla con acetilenos y luego reacciona con azida para generar un intermedio de seis miembros. El proceso es muy robusto y ocurre a un pH que oscila entre 4 y 12, y el sulfato de cobre (II) se usa a menudo como catalizador en presencia de un agente reductor . [13]
Aunque la ligadura de Staudinger es una bioconjugación adecuada en células vivas sin mayor toxicidad, la sensibilidad de la fosfina a la oxidación del aire y su escasa solubilidad en agua dificultan significativamente su eficacia. El acoplamiento azida-alquino catalizado por cobre (I) tiene una velocidad de reacción y una eficiencia razonables en condiciones fisiológicas, pero el cobre presenta una toxicidad significativa y, a veces, interfiere con las funciones de las proteínas en las células vivas. En 2004, el laboratorio de la química Carolyn R. Bertozzi desarrolló una cicloadición [3+2] libre de metales utilizando ciclooctina y azida coladas . El ciclooctino, que es el cicloalquino estable más pequeño, puede acoplarse con azida mediante cicloadición [3+2], lo que da lugar a dos triazoles regioisoméricos ( Figura 12 ). [11] La reacción se produce fácilmente a temperatura ambiente y, por lo tanto, se puede utilizar para modificar eficazmente las células vivas sin efectos negativos. También se ha informado que la instalación de sustituyentes de flúor en un alquino cíclico puede acelerar en gran medida la velocidad de reacción. [2] [29]
La bioconjugación basada en metales de transición ha sido un desafío debido a la naturaleza de las condiciones biológicas (solución acuosa, temperatura ambiente, pH suave y bajas concentraciones de sustrato) que generalmente son un desafío para las reacciones organometálicas . Sin embargo, recientemente, además de la reacción de cicloadición de azida alquino [3 + 2] catalizada por cobre , se han aplicado transformaciones químicas mediadas por metales de transición cada vez más diversas para reacciones de bioconjugación, introduciendo metátesis de olefinas , alquilación, arilación C-H, C-C, Reacciones de acoplamiento cruzado C – S y C – N. [30] [31]
Utilizando carbenoide Rh II generado in situ mediante activación de compuestos diazo sustituidos con vinilo con Rh 2 (OAc) 4 , se demostró que los triptófanos y las cisteínas se alquilan selectivamente en medios acuosos.
Sin embargo, este método se limita a triptófanos y cisteínas de superficie, posiblemente debido a limitaciones estéricas. [34]
Las iminas formadas a partir de la condensación de aldehídos con lisinas o el extremo N pueden reducirse eficientemente mediante un complejo hidroestable [Cp*Ir(bipy)(H 2 O)]SO 4 en presencia de iones formiato (que sirven como hidruro). fuente). La reacción se produce fácilmente en condiciones fisiológicamente relevantes y da como resultado una alta conversión de diversos aldehídos aromáticos.
Mediante el uso de un reactivo electrófilo de π-alilpaladio (II) preformado derivado de precursores de acetato alílico o carbamato, se puede lograr la alquilación alílica selectiva de tirosinas en solución acuosa a temperatura ambiente y en presencia de cisteínas.
Se ha demostrado que los péptidos que contienen cisteína sufren una adición 1,2 a alenos en presencia de sales de oro (I) y/o plata (I), produciendo tioéteres vinílicos sustituidos con hidroxilo. La reacción con péptidos se desarrolla con altos rendimientos y es selectiva para cisteínas frente a otros residuos nucleofílicos.
Sin embargo, la reactividad hacia las proteínas es mucho menor, posiblemente debido a la coordinación del oro con la columna vertebral de la proteína.
Se han informado múltiples métodos para lograr la arilación C-H de triptófano, donde se han utilizado diversos electrófilos como haluros de arilo [38] [39] y ácidos arilborónicos [40] (un ejemplo se muestra a continuación) para transferir los grupos arilo.
Sin embargo, las condiciones actuales de reacción de arilación de triptófano C-H siguen siendo relativamente duras y requieren disolventes orgánicos, pH bajo y/o altas temperaturas.
Los tioles libres se han considerado desfavorables para las reacciones mediadas por Pd debido a la descomposición del catalizador de Pd. [41] Sin embargo, los complejos de adición oxidativa (OAC) de Pd II soportados por ligandos de dialquilbiarilfosfina han demostrado funcionar eficientemente hacia la S-arilación de cisteína.
El primer ejemplo es el uso de Pd II OAC con RuPhos : [42] El complejo Pd II resultante de la adición oxidativa de haluros de arilo o trifluorometanosulfonatos y usando RuPhos como ligando podría modificar quimioselectivamente las cisteínas en varios tampones con un 5% de cosolvente orgánico. bajo pH neutro. Se ha demostrado que este método modifica péptidos y proteínas, logra la macrociclación de péptidos (mediante el uso de reactivo de bispaladio y péptidos con dos cisteínas desprotegidas) [43] y sintetiza conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) . Cambiar el ligando a sSPhos permite que el complejo Pd II sea suficientemente soluble en agua para lograr la S-arilación de cisteína en condiciones acuosas sin cosolventes. [44]
Hay otras aplicaciones de este método en las que los complejos de Pd II se generaron como OAC de Pd II -péptido mediante la introducción de 4-halofenilalanina en péptidos durante SPPS para lograr la ligación péptido-péptido o péptido-proteína. [45]
Como alternativa a la adición oxidativa directa al péptido, los Pd OAC también podrían transferirse a la proteína mediante una reacción de acilación selectiva de aminas mediante éster NHS. Este último se ha aplicado para marcar selectivamente residuos de lisina superficiales de una proteína (que forman OAC de proteína Pd II ) y oligonucleótidos (que forman OAC de oligonucleótido Pd II ), que luego podrían unirse a péptidos o proteínas que contienen cisteína. [46]
Otro ejemplo de acoplamiento cruzado proteína-proteína se logra mediante la conversión de residuos de cisteína en un OAC electrofílico S-aril-Pd-X mediante la utilización de una estrategia de adición oxidativa intramolecular. [47]
De manera similar a la cisteína, la N-arilación de lisina podría lograrse a través de Pd OAC con diferentes ligandos de dialquilbiarilfosfina . Debido a una nucleofilicidad más débil y una tasa de eliminación reductora más lenta en comparación con la cisteína, se ha demostrado que la selección de ligandos de soporte es crítica. Los voluminosos ligandos BrettPhos y t -BuBrettPhos junto con fenóxido de sodio ligeramente básico se han utilizado como estrategia para funcionalizar lisinas en sustratos peptídicos. La reacción ocurre en condiciones suaves y es selectiva sobre la mayoría de los demás residuos de aminoácidos nucleofílicos.
Las reacciones de acoplamiento cruzado de Sonogashira , Heck y Suzuki-Miyaura mediadas por Pd se han aplicado ampliamente para modificar péptidos y proteínas, donde se han desarrollado diversos reactivos de Pd para su aplicación en soluciones acuosas. [49] Esas reacciones requieren que el sustrato proteico o peptídico tenga grupos funcionales no naturales como alquino, [50] [51] [52] haluros de arilo, [53] [54] [55] [56] y ácidos arilborónicos, [57 ] que se puede lograr mediante la expansión del código genético o modificaciones postraduccionales.
Se ha informado de la bioconjugación de TGF-β con nanopartículas de óxido de hierro y su activación mediante hipertermia magnética in vitro. [58] Esto se hizo usando 1-(3-dimetilaminopropil)etilcarbodiimida combinada con N-hidroxisuccinimida para formar enlaces amida primarios con las aminas primarias libres en el factor de crecimiento. Los nanotubos de carbono se han utilizado con éxito junto con la bioconjugación para unir TGF-β seguido de una activación con luz infrarroja cercana. [59] Normalmente, estas reacciones han implicado el uso de un reticulante, pero algunas de ellas añaden espacio molecular entre el compuesto de interés y el material base y, a su vez, provocan mayores grados de unión no específica y reactividad no deseada. [60]