Un conducto de guía nerviosa (también conocido como conducto nervioso artificial o injerto nervioso artificial , a diferencia de un autoinjerto ) es un medio artificial para guiar el crecimiento axonal para facilitar la regeneración nerviosa y es uno de varios tratamientos clínicos para las lesiones nerviosas . Cuando no se puede realizar la sutura directa de los dos muñones de un nervio cortado sin tensión, el tratamiento clínico estándar para las lesiones de los nervios periféricos es el injerto de nervio autólogo . Debido a la disponibilidad limitada de tejido donado y la recuperación funcional en injertos nerviosos autólogos, la investigación en ingeniería de tejidos neurales se ha centrado en el desarrollo de conductos de guía nerviosa bioartificiales como tratamiento alternativo, especialmente para defectos grandes. También se están explorando técnicas similares para la reparación de nervios en la médula espinal, pero la regeneración de nervios en el sistema nervioso central plantea un desafío mayor porque sus axones no se regeneran apreciablemente en su entorno nativo. [1]
La creación de conductos artificiales también se conoce como entubación porque las terminaciones nerviosas y el espacio intermedio están encerrados dentro de un tubo compuesto de materiales biológicos o sintéticos. [2] Ya sea que el conducto tenga la forma de un tubo biológico, un tubo sintético o un conducto diseñado mediante ingeniería tisular, debe facilitar la comunicación neurotrópica y neurotrófica entre los extremos proximal y distal de la brecha nerviosa, bloquear los factores inhibidores externos y proporcionar una conexión física. Orientación para el crecimiento axonal. [3] El objetivo más básico de un conducto de guía nerviosa es combinar señales físicas, químicas y biológicas en condiciones que fomenten la formación de tejido. [4]
Los materiales que se han utilizado para fabricar tubos biológicos incluyen vasos sanguíneos y músculos esqueléticos, mientras que se han fabricado tubos sintéticos no absorbibles y bioabsorbibles de silicona y poliglicólido , respectivamente. [5] Los conductos de guía nerviosa diseñados con tejidos son una combinación de muchos elementos: estructura de andamio, material de andamio, terapias celulares, factores neurotróficos y materiales biomiméticos . La elección de qué señales físicas, químicas y biológicas utilizar se basa en las propiedades del entorno nervioso, que es fundamental para crear el entorno más deseable para la regeneración de los axones. Los factores que controlan la selección del material incluyen biocompatibilidad , biodegradabilidad , [6] integridad mecánica, [3] controlabilidad durante el crecimiento nervioso, implantación y esterilización.
En ingeniería de tejidos , se considera que los tres niveles principales de estructura de andamio son:
La superestructura de un conducto o andamio es importante para simular condiciones in vivo para la formación de tejido nervioso. La matriz extracelular, que es la principal responsable de dirigir el crecimiento y la formación de tejidos, tiene una superestructura compleja creada por muchas moléculas fibrosas entretejidas. Las formas de formar una superestructura artificial incluyen el uso de hidrogeles termosensibles, canales orientados longitudinalmente, fibras orientadas longitudinalmente, axones cultivados por estiramiento y andamios nanofibrosos.
En la lesión cerebral traumática (TBI), se inicia una serie de eventos dañinos que conducen a la muerte celular y a una disfunción general, lo que provoca la formación de una cavidad de lesión de forma irregular. [8] La cavidad resultante causa muchos problemas para los armazones de ingeniería tisular porque se requiere una implantación invasiva y, a menudo, el armazón no se ajusta a la forma de la cavidad. Para solucionar estas dificultades, se han diseñado hidrogeles termorresponsables para sufrir transiciones solución-gelación (sol-gel), causadas por diferencias en la temperatura ambiente y fisiológica, para facilitar la implantación mediante gelificación in situ y conformación a la forma de la cavidad. causado, permitiendo su inyección de forma mínimamente invasiva. [8]
La metilcelulosa (MC) es un material con transiciones sol-gel bien definidas en el rango óptimo de temperaturas. La gelificación de MC se produce debido a un aumento de las interacciones hidrofóbicas intra e intermoleculares a medida que aumenta la temperatura. [8] La transición sol-gel se rige por la temperatura crítica más baja de la solución (LCST), que es la temperatura a la que el módulo elástico es igual al módulo viscoso. El LCST no debe exceder la temperatura fisiológica (37 °C) para que el andamio se gelifique tras la implantación, creando una entrega mínimamente invasiva. Después de la implantación en la cavidad de una lesión de TBI o en un conducto de guía de un nervio periférico, el MC provoca una respuesta inflamatoria mínima. [8] También es muy importante para la administración mínimamente invasiva que la solución de MC tenga una viscosidad a temperaturas inferiores a su LCST, lo que permite inyectarla a través de una aguja de pequeño calibre para su implantación en aplicaciones in vivo . [8] MC se ha utilizado con éxito como agente de administración para terapias farmacéuticas intraópticas y orales. [8] Algunas desventajas del MC incluyen su propensión limitada a la adsorción de proteínas y la adhesión celular neuronal, lo que lo convierte en un hidrogel no bioactivo. Debido a estas desventajas, el uso de MC en la regeneración del tejido neural requiere unir un grupo biológicamente activo a la columna vertebral del polímero para mejorar la adhesión celular.
Otro gel termosensible es aquel que se forma combinando quitosano con sal de glicerofosfato (GP). [9] Esta solución experimenta gelificación a temperaturas superiores a 37 °C. La gelificación de quitosano/GP es bastante lenta, tardando media hora en fraguar inicialmente y 9 horas más en estabilizarse por completo. La fuerza del gel varía de 67 a 1572 Pa dependiendo de la concentración de quitosano; el extremo inferior de este rango se acerca a la rigidez del tejido cerebral. Chitosan/GP ha demostrado éxito in vitro , pero es necesaria la adición de polilisina para mejorar la unión de las células nerviosas. La polilisina se unió covalentemente al quitosano para evitar que se difundiera. Se seleccionó la polilisina debido a su naturaleza positiva y alta hidrofilicidad, que promueve el crecimiento de neuritas . La supervivencia de las neuronas se duplicó, aunque el crecimiento de las neuritas no cambió con la polilisina añadida. [9]
Los canales orientados longitudinalmente son estructuras macroscópicas que se pueden agregar a un conducto para brindar a los axones en regeneración una guía bien definida para crecer en línea recta a lo largo del andamio. En un andamio con arquitectura de canales microtubulares , los axones en regeneración pueden extenderse a través de canales longitudinales abiertos como lo harían normalmente a través de los tubos endoneurales de los nervios periféricos. [10] Además, los canales aumentan la superficie disponible para el contacto celular. Los canales generalmente se crean insertando una aguja, un alambre o una segunda solución de polímero dentro de un armazón de polímero; después de estabilizar la forma del polímero principal, se retira la aguja, el alambre o el segundo polímero para formar los canales. Normalmente se crean varios canales; sin embargo, el andamio puede consistir en sólo un canal grande, que es simplemente un tubo hueco.
Wang et al. crearon una técnica de moldeo. para formar un conducto de guía nerviosa con una matriz interna multicanal y una pared tubular externa de quitosano. [10] En su estudio de 2006, Wang et al. Se enhebran agujas de acupuntura a través de un tubo hueco de quitosano, donde se mantienen en su lugar fijando, en cada extremo, parches creados mediante CAD. Luego se inyecta una solución de quitosano en el tubo y se solidifica, después de lo cual se retiran las agujas, creando canales orientados longitudinalmente. Luego se creó un andamio representativo para la caracterización con 21 canales utilizando agujas de acupuntura de 400 μm de diámetro. Tras una investigación bajo un microscopio, se encontró que los canales eran aproximadamente circulares con ligeras irregularidades; todos los canales estaban alineados con el diámetro interior de la pared exterior del tubo. Se confirmó mediante imágenes de micro-CT que los canales recorrían toda la longitud del andamio. Bajo la absorción de agua, los diámetros interior y exterior del andamio se hicieron más grandes, pero los diámetros del canal no variaron significativamente, lo cual es necesario para mantener la forma del andamio que guía la extensión de las neuritas. La estructura interna proporciona un aumento en la resistencia a la compresión en comparación con un tubo hueco solo, lo que puede evitar el colapso del andamio sobre las neuritas en crecimiento. Las células Neuro-2a pudieron crecer en la matriz interna del andamio y se orientaron a lo largo de los canales. Aunque este método sólo se ha probado con quitosano, puede adaptarse a otros materiales. [10]
El proceso de liofilización y calentamiento de alambre es otro método para crear canales orientados longitudinalmente, desarrollado por Huang et al. (2005). [11] Se congeló una solución de quitosano y ácido acético alrededor de alambres de níquel-cobre (Ni-Cu) en una trampa de nitrógeno líquido ; posteriormente los alambres fueron calentados y retirados. Se eligieron cables de Ni-Cu porque tienen un alto nivel de resistencia. Se utilizaron liofilizadores con temperatura controlada para sublimar el ácido acético. No hubo evidencia de que los canales se fusionaran o dividieran. Después de la liofilización, las dimensiones del andamio se redujeron, lo que provocó que los canales fueran un poco más pequeños que el alambre utilizado. Los andamios se neutralizaron a un valor de pH fisiológico utilizando una base, lo que tuvo efectos espectaculares en la estructura porosa. [11] Las bases más débiles mantuvieron uniforme la estructura porosa, pero las bases más fuertes la hicieron incontrolable. La técnica utilizada aquí puede modificarse ligeramente para adaptarse a otros polímeros y disolventes. [11]
Otra forma de crear canales orientados longitudinalmente es crear un conducto a partir de un polímero con fibras orientadas longitudinalmente incrustadas de otro polímero; luego disuelve selectivamente las fibras para formar canales orientados longitudinalmente. Se incrustaron fibras de policaprolactona (PCL) en un andamio de metacrilato de (hidroxietilo) (HEMA). Se eligió PCL en lugar de poli(ácido láctico) (PLA) y poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), porque es insoluble en HEMA pero soluble en acetona . Esto es importante porque se usó HEMA para el material del conducto principal y se usó acetona para disolver selectivamente las fibras de polímero. Se insertaron fibras de PCL extruidas en un tubo de vidrio y se inyectó la solución de HEMA. La cantidad de canales creados fue constante de un lote a otro y las variaciones en el diámetro de la fibra se pudieron reducir creando un sistema de extrusión de fibra PCL más controlado. [12] Se confirmó que los canales formados eran continuos y homogéneos mediante el examen de las variaciones de porosidad. Este proceso es seguro, reproducible y tiene dimensiones controlables. [12] En un estudio similar realizado por Yu y Shoichet (2005), se copolimerizó HEMA con AEMA para crear un gel de P(HEMA-co-AMEA). Se incluyeron fibras de policaprolactona (PCL) en el gel y luego se disolvieron selectivamente con acetona con sonicación para crear canales. Se descubrió que HEMA en mezcla con 1% de AEMA creaba los geles más fuertes. [13] En comparación con estructuras sin canales, la adición de 82 a 132 canales puede proporcionar un aumento de aproximadamente 6 a 9 veces en el área de superficie, lo que puede ser ventajoso para estudios de regeneración que dependen de señales mediadas por contacto. [13]
Itoh et al. (2003) desarrollaron un andamio que consta de un único gran canal orientado longitudinalmente creado utilizando tendones de quitosano de cangrejos. [14] Se recolectaron tendones de cangrejos (Macrocheira kaempferi) y se lavaron repetidamente con una solución de hidróxido de sodio para eliminar las proteínas y desacetilar la quitina del tendón , que posteriormente se conoció como quitosano del tendón. Se insertó una barra de acero inoxidable con sección transversal de forma triangular (cada lado de 2,1 mm de largo) en un tubo de quitosano de tendón hueco de sección transversal circular (diámetro: 2 mm; longitud: 15 mm). Al comparar los tubos de forma circular y triangular, se encontró que los tubos triangulares tenían una mejor resistencia mecánica, mantenían mejor su forma y aumentaban el área de superficie disponible. [14] Si bien este es un método eficaz para crear un solo canal, no proporciona tanta superficie para el crecimiento celular como los andamios multicanal.
Newman et al. (2006) insertaron fibras conductoras y no conductoras en un andamio de colágeno-TERP (colágeno reticulado con un terpolímero de poli (N-isopropilacrilamida) (PNiPAAm)). Las fibras se incrustaron envolviéndolas firmemente en un pequeño portaobjetos de vidrio y colocando una solución de colágeno-TERP entre éste y otro portaobjetos de vidrio; Los espaciadores entre los portaobjetos de vidrio fijaron el espesor del gel en 800 μm. Las fibras conductoras eran fibra de carbono y Kevlar , y las fibras no conductoras eran nailon-6 y alambre de tungsteno. Las neuritas se extienden en todas direcciones en gruesos haces sobre la fibra de carbono; sin embargo, con las otras tres fibras, las neuritas se extendieron en finas conformaciones en forma de red. Las neuritas no mostraron crecimiento direccional en las fibras de carbono y Kevlar, pero crecieron a lo largo de las fibras de nailon-6 y, hasta cierto punto, a lo largo del alambre de tungsteno. En los andamios de alambre de tungsteno y fibra de nailon-6, las neuritas crecieron en el gel cerca de la interfaz fibra-gel, además de crecer a lo largo de la superficie. Todos los geles de fibra, excepto Kevlar, mostraron un aumento significativo en la extensión de neuritas en comparación con los geles sin fibra. No hubo diferencia en la extensión de las neuritas entre las fibras conductoras y no conductoras. [15]
En su estudio de 2005, Cai et al. Se agregaron microfilamentos de poli (ácido L-láctico) (PLLA) a tubos huecos de poli (ácido láctico) (PLA) y de silicona. Las características de guía de la microfibra estaban inversamente relacionadas con el diámetro de la fibra, con diámetros más pequeños promoviendo una mejor migración celular orientada longitudinalmente y una mejor regeneración axonal. Las microfibras también promovieron la mielinización durante la reparación de los nervios periféricos. [dieciséis]
Se ha demostrado que los tractos axónicos maduros experimentan crecimiento cuando se estiran mecánicamente en la porción central del cilindro axónico. [17] Dicho estiramiento mecánico se aplicó mediante un biorreactor de crecimiento de estiramiento de axones personalizado compuesto por cuatro componentes principales: cámara de expansión de axones diseñada a medida, mesa de movimiento lineal, motor paso a paso y controlador. [17] El cultivo de tejido nervioso se coloca dentro de la cámara de expansión con un puerto para el intercambio de gases y un marco de estiramiento extraíble, que puede separar dos grupos de somas (cuerpos de células neuronales) y así estirar sus axones. [17] Se utilizó gel de colágeno para promover el crecimiento de tractos axónicos más grandes y estirados que eran visibles a simple vista. Hay dos razones para la mejora del crecimiento debido al recubrimiento de colágeno: 1) el cultivo se volvió hidrofóbico después de que el colágeno se secó, lo que permitió que creciera una concentración más densa de neuronas, y 2) el recubrimiento de colágeno creó un recubrimiento sin obstrucciones a través de los dos sustratos de elongación. . [17] El examen mediante microscopio electrónico de barrido y TEM no mostró signos de adelgazamiento del axón debido al estiramiento, y el citoesqueleto parecía normal e intacto. Los tractos de axones cultivados por estiramiento se cultivaron en una membrana biocompatible, que podría formarse directamente en una estructura cilíndrica para el trasplante, eliminando la necesidad de transferir los axones a un andamio una vez completado el crecimiento. Los axones cultivados por estiramiento pudieron crecer a un ritmo sin precedentes de 1 cm/día después de sólo 8 días de aclimatación, que es mucho mayor que la tasa de crecimiento máxima de 1 mm/día medida para la extensión del cono de crecimiento. La velocidad de 1 mm/día es también la velocidad media de transporte de elementos estructurales como los neurofilamentos. [17]
La investigación sobre fibras a nanoescala intenta imitar el entorno extracelular in vivo para promover el crecimiento direccional y la regeneración. [7] Tres métodos distintos para formar andamios nanofibrosos son el autoensamblaje, la separación de fases y el electrohilado. Sin embargo, existen muchos otros métodos para formar andamios nanofibrosos.
El autoensamblaje de andamios nanofibrosos sólo puede ocurrir cuando las fibras mismas están diseñadas para el autoensamblaje. Una forma común de impulsar el autoensamblaje de las fibras de andamio es utilizar péptidos anfifílicos para que en el agua la fracción hidrófoba impulse el autoensamblaje. [7] La ingeniería cuidadosamente calculada de los péptidos anfifílicos permite un control preciso sobre la matriz autoensamblada. El autoensamblaje es capaz de crear topografías tanto ordenadas como desordenadas. Phillips y cols. (2005) desarrollaron y probaron in vitro e in vivo una matriz de células de Schwann de colágeno autoalineada, que permitió la alineación de la extensión de neuritas DRG in vitro . Los geles de colágeno se han utilizado ampliamente como sustratos para cultivos de tejidos tridimensionales . Las células pueden formar uniones mediadas por integrinas con colágeno, lo que inicia el ensamblaje del citoesqueleto y la motilidad celular. A medida que las células se mueven a lo largo de las fibras de colágeno, generan fuerzas que contraen el gel. Cuando las fibras de colágeno están unidas en ambos extremos, las fuerzas generadas por las células crean una tensión uniaxial, lo que hace que las células y las fibras de colágeno se alineen. Las ventajas de esta matriz son su sencillez y rapidez de preparación. [2] La fibronectina plasmática soluble también puede autoensamblarse en fibras insolubles estables cuando se somete a corte mecánico directo dentro de una solución viscosa. Phillips y cols. (2004) investigaron un nuevo método de agregación por corte que provoca una agregación mejorada. [18] El corte mecánico se creó arrastrando un bolo de 0,2 ml a 3 cm con unas pinzas; La fibronectina se agrega en fibras insolubles en la interfaz que se mueve rápidamente en una celda de ultrafiltración. El mecanismo propuesto para esta agregación de fibras es la extensión y elongación de proteínas bajo fuerza de corte mecánico, lo que conduce al empaquetamiento lateral y la agregación de proteínas de las fibras. Phillips y cols. demostraron que el cizallamiento mecánico producido al estirar un gel de fibronectina de alta viscosidad provoca cambios sustanciales en su estructura y que cuando se aplica mediante extensión uniaxial, un gel de fibronectina viscoso forma agregados de fibronectina fibrosos orientados; Además, los agregados fibrosos tienen una solubilidad reducida y pueden soportar los distintos tipos de células in vitro. [18]
La separación de fases permite crear andamios de fibra submicrométricos tridimensionales sin el uso de equipos especializados. Los cinco pasos involucrados en la separación de fases son la disolución del polímero, la separación de fases y gelificación, la extracción con solvente del gel, la congelación y la liofilización en agua. [7] El producto final es una red de fibra continua. La separación de fases se puede modificar para adaptarse a muchas aplicaciones diferentes, y la estructura de los poros se puede variar mediante el uso de diferentes disolventes, lo que puede cambiar todo el proceso de líquido-líquido a sólido-líquido. La porosidad y el diámetro de la fibra también se pueden modificar variando la concentración inicial del polímero; una concentración inicial más alta conduce a menos poros y diámetros de fibra más grandes. Esta técnica se puede utilizar para crear redes de fibras con diámetros que alcanzan los diámetros de las fibras de colágeno tipo I. La red fibrosa creada está orientada al azar y hasta el momento no se ha trabajado para intentar organizar las fibras. La separación de fases es una técnica ampliamente utilizada para crear con facilidad andamios nanofibrosos altamente porosos. [7]
El electrogiro proporciona una plataforma sólida para el desarrollo de conductos de guía de nervios sintéticos. El electrohilado puede servir para crear andamios en dimensiones controladas con diferentes química y topografía. Además, se pueden encapsular diferentes materiales dentro de las fibras, incluidas partículas, factores de crecimiento e incluso células. [19] El electrohilado crea fibras cargando eléctricamente una gota de polímero fundido o solución y suspendiéndola de un capilar. Luego, se aplica un campo eléctrico en un extremo del capilar hasta que la carga supera la tensión superficial, creando un chorro de polímero que se alarga y adelgaza. Este chorro de polímero se descarga como un cono de Taylor, dejando atrás polímeros cargados eléctricamente, que se recogen en una superficie conectada a tierra como disolvente a medida que el disolvente se evapora de los chorros. [20] Se han hilado fibras con diámetros que van desde menos de 3 nm hasta más de 1 μm. El proceso se ve afectado por parámetros del sistema como el tipo de polímero, el peso molecular del polímero y las propiedades de la solución y por parámetros del proceso como el caudal, el voltaje, el diámetro del capilar, la distancia entre el colector y el capilar y el movimiento del colector. [21] La red fibrosa creada está desordenada y contiene una alta relación superficie-volumen como resultado de una alta porosidad; una gran superficie de red es ideal para el crecimiento y transporte de desechos y nutrientes en la ingeniería de tejidos neuronales. [7] Las dos características de los andamios electrohilados que son ventajosas para la ingeniería de tejido neural son la morfología y la arquitectura, que imitan estrechamente a la ECM, y los poros, que tienen el rango correcto de tamaños que permite el intercambio de nutrientes pero previene el crecimiento de la cicatriz glial. tejido (alrededor de 10 μm). [22] Se ha demostrado que los andamios de PLLA electrohilados al azar tienen una mayor adhesión celular, lo que puede deberse a una mayor rugosidad de la superficie. [22] También se ha demostrado que las esteras de fibra electrohiladas modificadas químicamente influyen en la diferenciación de las células madre neurales y aumentan la proliferación celular. [20] En la última década, los científicos también han desarrollado numerosos métodos para la producción de andamios de nanofibras alineadas, que sirven para proporcionar señales topográficas adicionales a las células. [23] Esto es ventajoso porque los andamios alineados tridimensionales a gran escala no se pueden crear fácilmente utilizando técnicas de fabricación tradicionales. [7]En un estudio realizado por Yang et al. (2005), se crearon, caracterizaron y compararon andamios microfibrosos y nanofibrosos de poli (ácido L-láctico) (PLLA) electrohilados y alineados al azar. Los diámetros de las fibras fueron directamente proporcionales a la concentración inicial de polímero utilizada para el electrohilado; el diámetro promedio de las fibras alineadas fue menor que el de las fibras aleatorias en condiciones de procesamiento idénticas. Se demostró que las células madre neurales se alargaban paralelas a las fibras electrohiladas alineadas. [21] Las nanofibras alineadas tenían una longitud de neurita promedio más larga en comparación con las microfibras alineadas, las microfibras aleatorias y las nanofibras aleatorias. Además, se diferenciaron más células en nanofibras alineadas que en microfibras alineadas. [21] Por lo tanto, los resultados de este estudio demostraron que las nanofibras alineadas pueden ser más beneficiosas que las fibras o microfibras no alineadas para promover la regeneración nerviosa.
La microestructura y la nanoestructura, junto con la superestructura, son tres niveles principales de estructura de andamio que merecen consideración al crear una topografía de andamio. [7] Mientras que la superestructura se refiere a la forma general del andamio, la microestructura se refiere a la estructura a nivel celular de la superficie y la nanoestructura se refiere a la estructura a nivel subcelular de la superficie. Los tres niveles de estructura son capaces de provocar respuestas celulares; sin embargo, existe un gran interés en la respuesta de las células a la topografía a nanoescala motivada por la presencia de numerosas estructuras a nanoescala dentro de la matriz extracelular. [7] Existe un número creciente de métodos para la fabricación de micro y nanoestructuras (muchas de ellas procedentes de la industria de los semiconductores) que permiten la creación de diversas topografías con tamaño, forma y química controlados. [24]
Las señales físicas se forman mediante la creación de una estructura superficial ordenada al nivel de la microestructura y/o nanoestructura. Se ha demostrado que las señales físicas a nanoescala modulan la adhesión celular, la migración, la orientación, la inhibición del contacto, la expresión genética y la formación del citoesqueleto. Esto permite la dirección de procesos celulares como la proliferación, diferenciación y propagación. [24] Existen numerosos métodos para la fabricación de topografías a micro y nanoescala, que se pueden dividir en aquellos que crean topografías ordenadas y aquellos que crean topografías desordenadas.
Las topografías ordenadas se definen como patrones organizados y geométricamente precisos. [7] Aunque existen muchos métodos para crear topografías ordenadas, generalmente requieren mucho tiempo, habilidad y experiencia y el uso de equipos costosos. [7]
La fotolitografía implica exponer una fuente de luz a una oblea de silicio recubierta con fotorresistente; Se coloca una máscara con el patrón deseado entre la fuente de luz y la oblea, permitiendo así selectivamente que la luz se filtre y cree el patrón en el fotoprotector . Un mayor desarrollo de la oblea resalta el patrón en el fotoprotector. La fotolitografía realizada en el ultravioleta cercano a menudo se considera el estándar para fabricar topografías a microescala. [7] Sin embargo, debido a que el límite inferior para el tamaño es una función de la longitud de onda, este método no se puede utilizar para crear características a nanoescala. [7] En su estudio de 2005, Mahoney et al.crearon matrices organizadas de canales de poliimida (11 μm de altura y 20–60 μm de ancho) sobre un sustrato de vidrio mediante fotolitografía. [25] Se utilizó poliimida porque se adhiere bien al vidrio, es químicamente estable en solución acuosa y es biocompatible. Se plantea la hipótesis de que los microcanales limitaban la gama de ángulos en los que los elementos citoesqueléticos dentro de los conos de crecimiento de las neuritas podían acumular, ensamblar y orientar. [25] Hubo una disminución significativa en el número de neuritas que emergen del soma; sin embargo, hubo menos disminución a medida que aumentó el rango de ángulos en los que emergieron las neuritas. Además, las neuritas eran en promedio dos veces más largas cuando las neuronas se cultivaron en los microcanales en comparación con los controles en una superficie plana; esto podría deberse a una alineación más eficiente de los filamentos. [25]
En la litografía por haz de electrones (EBL), una resistencia sensible a los electrones se expone a un haz de electrones de alta energía. Existe la posibilidad de elegir entre una resistencia de tipo positivo o negativo; sin embargo, se puede obtener una resolución de características más baja con resistencias negativas. [26] Los patrones se crean programando el haz de electrones para el camino exacto a seguir a lo largo de la superficie del material. La resolución se ve afectada por otros factores, como la dispersión de electrones en la resistencia y la retrodispersión del sustrato. EBL puede crear características de superficie única del orden de 3 a 5 nm. Si se requieren múltiples características en una gran superficie, como es el caso en la ingeniería de tejidos, la resolución cae y las características solo se pueden crear tan pequeñas como 30 a 40 nm, y el desarrollo de la resistencia comienza a pesar más en la formación del patrón. [26] Para evitar la disolución de la resistencia, se puede utilizar la agitación ultrasónica para superar las fuerzas intermoleculares. Además, el alcohol isopropílico (IPA) ayuda a desarrollar matrices de alta densidad. EBL puede convertirse en un proceso más rápido y menos costoso al replicar patrones nanométricos en materiales poliméricos; El proceso de replicación se ha demostrado con policaprolactona (PCL) mediante estampado en caliente y fundición con disolvente . [7] En un estudio realizado por Gómez et al. (2007), se demostró que los microcanales de 1 y 2 μm de ancho y 400 y 800 nm de profundidad creados por EBL en PDMS mejoran la formación de axones de las células del hipocampo en cultivo más que las señales químicas inmovilizadas. [26]
La litografía de rayos X es otro método para formar patrones ordenados que pueden usarse para investigar el papel que desempeña la topografía en la promoción de la neuritogénesis. Los parámetros de la máscara determinan la periodicidad del patrón, pero el ancho y la profundidad de las crestas están determinados por las condiciones de grabado. En un estudio, se crearon crestas con períodos que oscilaban entre 400 y 4000 nm, anchos que oscilaban entre 70 y 1900 nm y una profundidad de surco de 600 nm; Las neuritas en desarrollo demostraron una guía de contacto con características tan pequeñas como 70 nm y más del 90% de las neuritas estaban dentro de los 10 grados de alineación paralela con las crestas y surcos. [27] No hubo una diferencia significativa en la orientación con respecto a los tamaños de características utilizados. El número de neuritas por célula estaba limitado por las crestas y surcos, produciendo fenotipos bipolares en lugar de ramificados. [27]
Las topografías desordenadas generalmente se crean por procesos que ocurren espontáneamente durante otros procesamientos; los patrones son aleatorios en orientación y organización con control impreciso o nulo sobre la geometría de las características. [7] La ventaja de crear topografías desordenadas sobre las ordenadas es que los procesos suelen consumir menos tiempo, son menos costosos y no requieren grandes habilidades ni experiencia. Se pueden crear topografías desordenadas mediante la separación de polímeros, la litografía coloidal y el grabado químico.
En la desmezcla de polímeros , las mezclas de polímeros experimentan una separación de fases espontánea; A menudo ocurre durante condiciones como la fundición por rotación sobre obleas de silicio. Las características que se pueden crear con este método incluyen hoyos, islas y cintas a nanoescala, que se pueden controlar hasta cierto punto ajustando la proporción y la concentración del polímero para cambiar la forma y el tamaño de la característica, respectivamente. [7] No hay mucho control en la dirección horizontal, aunque la dirección vertical de las características se puede controlar con precisión. Debido a que el patrón está muy desordenado horizontalmente, este método solo se puede utilizar para estudiar las interacciones celulares con nanotopografías de altura específicas . [7]
La litografía coloidal es económica y se puede utilizar para crear superficies con alturas y diámetros controlados. Los nanocolíodos se utilizan como una máscara de grabado extendiéndolos a lo largo de la superficie del material, y luego se usa un bombardeo con haz de iones o una película de evaporación para grabar alrededor de los nanocolíodos, creando nanocolumnas y nanopozos, respectivamente. La estructura superficial final se puede controlar variando el área cubierta por los coloides y el tamaño del coloide. El área cubierta por los coloides se puede cambiar modificando la fuerza iónica de la solución de coloide. Esta técnica es capaz de crear grandes superficies estampadas, lo cual es necesario para aplicaciones de ingeniería de tejidos. [7]
El grabado químico implica remojar la superficie del material en un agente decapante como ácido fluorhídrico (HF) o hidróxido de sodio (NaOH) hasta que la superficie quede grabada hasta obtener la rugosidad deseada creada por hoyos y protuberancias en la escala nanométrica. [7] Los tiempos de grabado más prolongados producen superficies más rugosas (es decir, picaduras y protuberancias más pequeñas). No se pueden crear estructuras con geometría u organización específicas mediante este método rudimentario porque, en el mejor de los casos, puede considerarse un tratamiento superficial para cambiar la rugosidad de la superficie. Las ventajas significativas de este método son la facilidad de uso y el bajo costo para crear una superficie con nanotopografías . Se grabaron obleas de silicio utilizando HF y se demostró que la adhesión celular mejoraba sólo en un rango específico de rugosidad (20 a 50 nm). [7]
Además de crear topografía con señales físicas, se puede crear con señales químicas depositando selectivamente una solución polimérica en patrones sobre la superficie de un sustrato. Existen diferentes métodos para depositar las señales químicas. Dos métodos para dispensar soluciones químicas incluyen el patrón de rayas y la microdispensación piezoeléctrica.
Se pueden formar películas poliméricas con dibujos de rayas sobre sustratos sólidos vertiendo una solución polimérica diluida. Este método es relativamente fácil, económico y no tiene restricciones en cuanto a los materiales de andamio que se pueden utilizar. El procedimiento consiste en superponer placas de vidrio horizontalmente mientras las mantiene separadas verticalmente por un espacio estrecho lleno de una solución de polímero. La placa superior se mueve a una velocidad constante entre 60 y 100 μm/s. [28] Se forma continuamente una fina película líquida de solución en el borde del vidrio deslizante después de la evaporación del disolvente. Los patrones de rayas preparados a velocidades de 60, 70 y 100 μm/s crearon anchos y espacios entre ranuras de 2,2 y 6,1 μm, 3,6 y 8,4 μm, y 4,3 y 12,7 μm, respectivamente; el rango de alturas de las crestas era de 50 a 100 nm. [28] Tsuruma, Tanaka et al. demostró que las células neurales embrionarias cultivadas en una película recubierta con poli-L-lisina adheridas y alargadas paralelas a las franjas de poli(ε-caprolactona)/solución de cloroformo (1 g/L) con un patrón de ancho y espaciado estrechos (ancho: 2,2 μm, espaciado: 6,1 µm). [28] Sin embargo, las neuronas crecieron a lo largo del eje de los patrones con ancho y espaciado amplios (ancho: 4,3 μm, espaciado: 12,7 μm). En promedio, las neuronas de las películas con patrón de rayas tenían menos neuritas por célula y neuritas más largas en comparación con las neuronas de las películas sin patrón. Por tanto, los parámetros del patrón de rayas pueden determinar la dirección del crecimiento, la longitud de las neuritas y el número de neuritas por célula. [28]
La microdispensación se utilizó para crear micropatrones en placas de cultivo de poliestireno mediante la dispensación de gotas de laminina adhesiva y soluciones de albúmina sérica bovina (BSA) no adhesivas . [29] El microdispensador es un elemento piezoeléctrico unido a una barra de empuje encima de un canal grabado en silicio, que tiene una entrada en cada extremo y una boquilla en el medio. El elemento piezoeléctrico se expande cuando se aplica voltaje, lo que hace que se distribuya líquido a través de la boquilla. El microdispensador se mueve mediante una mesa xy controlada por computadora. La resolución del micropatrón depende de muchos factores: viscosidad del líquido dispensado, paso de gota (la distancia entre el centro de dos gotas adyacentes en una línea o matriz) y el sustrato. [29] Al aumentar la viscosidad, las líneas se vuelven más delgadas, pero si la viscosidad del líquido es demasiado alta, el líquido no se puede expulsar. Calentar la solución crea líneas de proteínas más uniformes. Aunque es necesaria cierta superposición de gotas para crear líneas continuas, la evaporación desigual puede causar una concentración desigual de proteínas a lo largo de las líneas; Esto se puede evitar mediante una evaporación más suave modificando las propiedades de la solución dispensada.
Para los patrones que contenían 0,5 mg/ml de laminina, creció una mayor proporción de neuritas en las líneas microdispensadas que entre las líneas. [29] En patrones de proteína BSA de 10 mg/mL y 1 mg/mL y patrones de proteína BSA libre de ácidos grasos, un número significativo de neuritas evitaron las líneas de proteínas y crecieron entre las líneas. Por lo tanto, las líneas de BSA que contienen ácidos grasos eran tan poco permisivas para el crecimiento de neuritas como las líneas que contienen BSA con ácidos grasos. Debido a que la microdispensación no requiere contacto directo con las superficies del sustrato, esta técnica puede utilizar superficies con micro o nanotopología delicada que podrían destruirse por contacto. Es posible variar la cantidad de proteína depositada dispensando más o menos gotas. Una ventaja de la microdosificación es que se pueden crear patrones rápidamente en 5 a 10 minutos. Debido a que el microdispensador piezoeléctrico no requiere calentamiento, se pueden dispensar proteínas y fluidos sensibles al calor, así como células vivas. [29]
La selección del material del andamio es quizás la decisión más importante a tomar. Debe ser biocompatible y biodegradable; además, debe poder incorporar cualquier señal física, química o biológica deseada, lo que en el caso de algunas señales químicas significa que debe tener un sitio disponible para unir químicamente péptidos y otras moléculas. Los materiales de andamio elegidos para los conductos de guía nerviosa son casi siempre hidrogeles. El hidrogel puede estar compuesto de polímeros biológicos o sintéticos. Tanto los polímeros biológicos como los sintéticos tienen sus fortalezas y debilidades. Es importante señalar que el material del conducto puede causar una recuperación inadecuada cuando (1) las tasas de degradación y resorción no coinciden con la tasa de formación de tejido, (2) las propiedades de tensión-deformación no se comparan bien con las del tejido neural, (3) cuando se produce una hinchazón degradante que causa una deformación significativa, (4) se provoca una gran respuesta inflamatoria o (5) el material tiene baja permeabilidad. [30]
Los hidrogeles son una clase de biomateriales que son polímeros solubles en agua reticulados química o físicamente. Pueden ser degradables o no degradables según lo determine su química, pero lo degradable es más deseable siempre que sea posible. Ha habido un gran interés en los hidrogeles para fines de ingeniería de tejidos, porque generalmente poseen una alta biocompatibilidad, propiedades mecánicas similares a las del tejido blando y la capacidad de inyectarse como un líquido que gelifica. [4] Cuando los hidrogeles están físicamente reticulados, deben depender de la separación de fases para la gelificación; la separación de fases depende de la temperatura y es reversible. [4] Algunas otras ventajas de los hidrogeles son que utilizan únicamente disolventes acuosos no tóxicos, permiten la infusión de nutrientes y la salida de productos de desecho, y permiten que las células se ensamblen espontáneamente. [31] Los hidrogeles tienen una tensión interfacial baja, lo que significa que las células pueden migrar fácilmente a través del límite entre el tejido y el implante. [9] Sin embargo, con los hidrogeles es difícil formar una amplia gama de propiedades mecánicas o estructuras con un tamaño de poro controlado. [4]
Un polímero sintético puede ser degradable o no degradable. A los efectos de la ingeniería de tejidos neurales, siempre que sea posible se prefieren los materiales degradables, porque los efectos a largo plazo, como la inflamación y las cicatrices, podrían dañar gravemente la función nerviosa. La tasa de degradación depende del peso molecular del polímero, su cristalinidad y la proporción de subunidades de ácido glicólico a ácido láctico. [4] Debido a un grupo metilo , el ácido láctico es más hidrofóbico que el ácido glicólico, lo que hace que su hidrólisis sea más lenta. [4] Los polímeros sintéticos tienen propiedades mecánicas más manejables y tasas de degradación que pueden controlarse en un amplio rango, y eliminan la preocupación por la inmunogenicidad. [4] Actualmente se utilizan muchos polímeros sintéticos diferentes en la ingeniería de tejidos neurales. Sin embargo, los inconvenientes de muchos de estos polímeros incluyen la falta de biocompatibilidad y bioactividad, lo que impide que estos polímeros promuevan la unión, proliferación y diferenciación celular. [32] Los conductos sintéticos sólo han tenido éxito clínico para la reparación de espacios de lesiones nerviosas muy cortas de menos de 1 a 2 cm. [33] Además, la regeneración nerviosa con estos conductos aún tiene que alcanzar el nivel de recuperación funcional observado con los autoinjertos nerviosos. [30]
El colágeno es un componente importante de la matriz extracelular y se encuentra en los tejidos de soporte de los nervios periféricos. Se sintetizó un terpolímero (TERP) mediante la copolimerización de radicales libres de sus tres monómeros y se reticuló con colágeno, creando una estructura híbrida de hidrogel biológico-sintético. [15] El terpolímero se basa en poli (NIPAAM), que se sabe que es un polímero respetuoso con las células. TERP se utiliza como reticulante para aumentar la robustez del hidrogel y como sitio para injertar péptidos bioactivos o factores de crecimiento, al hacer reaccionar algunos de sus grupos acriloxisuccinimida con los grupos –NH2 de los péptidos o factores de crecimiento. [15] Debido a que el hidrogel de colágeno-terpolímero (colágeno-TERP) carece de un componente bioactivo, un estudio le adjuntó un péptido de adhesión celular común que se encuentra en la laminina (YIGSR) para mejorar sus propiedades de adhesión celular. [15]
Los polímeros de la familia PLGA incluyen poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA) y su copolímero poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Los tres polímeros han sido aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos para su empleo en diversos dispositivos. Estos polímeros son frágiles y no tienen regiones para modificaciones químicas permitidas; Además, se degradan en masa y no en superficie, lo que no es un proceso de degradación ideal ni fluido. [4] En un intento por superar la falta de funcionalidades, se han incorporado aminas libres en sus estructuras a partir de las cuales se pueden unir péptidos para controlar la unión y el comportamiento celular. [4]
El dextrano es un polisacárido derivado de bacterias; Generalmente es producido por enzimas de ciertas cepas de leuconostoc o Streptococcus . Consiste en residuos de D-glucopiranosa unidos a α-1,6. Las perlas de hidrogel de dextrano reticuladas se han utilizado ampliamente como matrices de baja unión a proteínas para aplicaciones de cromatografía en columna y para tecnología de cultivo de células microportadoras. [34] Sin embargo, no ha sido hasta hace poco que los hidrogeles de dextrano se han investigado en aplicaciones de biomateriales y específicamente como vehículos de administración de fármacos. Una ventaja del uso de dextrano en aplicaciones de biomateriales incluye su resistencia a la adsorción de proteínas y la adhesión celular, lo que permite determinar la adhesión celular específica mediante péptidos unidos deliberadamente de los componentes de la ECM. [34] AEMA se copolimerizó con Dex-MA para introducir grupos amino primarios para proporcionar un sitio para la unión de péptidos derivados de ECM para promover la adhesión celular. Los péptidos se pueden inmovilizar utilizando química de acoplamiento de sulfo-SMMC y péptidos terminados en cisteína. La copolimerización de Dex-MA con AEMA permitió preservar la geometría macroporosa de los andamios además de promover las interacciones celulares. [34]
Se ha desarrollado un nuevo elastómero resistente y biodegradable a partir de sebacato de poliglicerol (PGS) para su uso en la creación de un conducto de guía nerviosa. [30] PGS se desarrolló originalmente con fines de ingeniería de tejidos blandos para imitar específicamente las propiedades mecánicas de la ECM. Se considera un elastómero porque es capaz de recuperarse de la deformación en entornos mecánicamente dinámicos y de distribuir eficazmente la tensión de manera uniforme a través de los tejidos en regeneración en forma de microtensiones. El PGS se sintetiza mediante una reacción de policondensación de glicerol y ácido sebácico, que puede procesarse en estado fundido o en disolvente hasta obtener la forma deseada. PGS tiene un módulo de Young de 0,28 MPa y una resistencia máxima a la tracción superior a 0,5 MPa. [30] El nervio periférico tiene un módulo de Young de aproximadamente 0,45 MPa, que es muy cercano al del PGS. Además, el PGS experimenta degradación de la superficie, acompañada de pérdidas de masa lineal y resistencia durante la resorción. [30] Después de la implantación, se determinó que la vida media de degradación era de 21 días; la degradación completa se produjo el día 60. [30] PGS experimenta una absorción de agua mínima durante la degradación y no tiene hinchazón detectable; la hinchazón puede causar distorsión, lo que estrecha la luz tubular y puede impedir la regeneración. Es ventajoso que el tiempo de degradación de PGS pueda variarse cambiando el grado de reticulación y la proporción de ácido sebácico a glicerol. [30] En un estudio de Sundback et al. (2005), los conductos implantados de PGS y PLGA tuvieron respuestas tisulares tempranas similares; sin embargo, las respuestas inflamatorias de PLGA aumentaron más tarde, mientras que las respuestas inflamatorias de PGS continuaron disminuyendo. [30]
Los hidrogeles de polietilenglicol (PEG) son biocompatibles y se ha demostrado que son tolerados en muchos tipos de tejidos, incluido el SNC. Mahoney y Anseth formaron hidrogeles de PEG fotopolimerizando grupos de metacrilato unidos covalentemente a macrómeros de PEG degradables. La degradación del hidrogel se controló a lo largo del tiempo midiendo la resistencia mecánica (módulo de compresión) y el tamaño de malla promedio a partir de los datos de la relación de hinchamiento. [35] Inicialmente, las cadenas de polímero estaban altamente entrecruzadas, pero a medida que avanzaba la degradación, los enlaces éster se hidrolizaron, permitiendo que el gel se hinchara; el módulo de compresión disminuyó a medida que aumentó el tamaño de la malla hasta que el hidrogel se disolvió por completo. Se demostró que las células precursoras neurales podían fotoencapsularse y cultivarse en geles de PEG con una muerte celular mínima. Debido a que el tamaño de la malla es inicialmente pequeño, el hidrogel bloquea las señales inflamatorias y otras señales inhibidoras del tejido circundante. A medida que aumenta el tamaño de la malla, el hidrogel puede servir como andamio para la regeneración de los axones. [35]
Existen ventajas al utilizar polímeros biológicos sobre polímeros sintéticos. Es muy probable que tengan buena biocompatibilidad y se degraden fácilmente, porque ya están presentes en la naturaleza de alguna forma. Sin embargo, también existen varias desventajas. Tienen propiedades mecánicas difíciles de manejar y tasas de degradación que no se pueden controlar en un amplio rango. Además, siempre existe la posibilidad de que los materiales de origen natural provoquen una respuesta inmunitaria o contengan microbios. [4] En la producción de materiales de origen natural también habrá variaciones entre lotes en los procedimientos de aislamiento a gran escala que no se pueden controlar. [16] Algunos otros problemas que afectan a los polímeros naturales son su incapacidad para soportar el crecimiento a través de largos espacios de lesión debido a la posibilidad de colapso, formación de cicatrices y reabsorción temprana. [16] A pesar de todas estas desventajas, algunas de las cuales pueden superarse, los polímeros biológicos siguen demostrando ser la opción óptima en muchas situaciones.
El ácido polisiálico (PSA) es un material biocompatible y bioabsorbible relativamente nuevo para conductos nerviosos artificiales. Es un homopolímero de residuos de ácido siálico unidos a α2,8 y una modificación postraduccional regulada dinámicamente de la molécula de adhesión de células neurales (NCAM). Estudios recientes han demostrado que la NCAM polisialilada (polySia-NCAM) promueve la regeneración del sistema motor. [36] El PSA muestra estabilidad en condiciones de cultivo celular y permite la degradación inducida por enzimas. También se ha descubierto recientemente que el PSA participa en procesos de dirección como la neuritogénesis, la búsqueda de rutas axonales y la migración de neuroblastos. [36] Los animales con PSA genéticamente eliminado expresan un fenotipo letal, que no logra encontrar el camino; Los nervios que conectan los dos hemisferios cerebrales estaban aberrantes o faltaban. [36] Por lo tanto, el PSA es vital para el desarrollo adecuado del sistema nervioso.
El colágeno es el componente principal de la matriz extracelular y se ha utilizado ampliamente en la regeneración y reparación de nervios. Debido a su suave microgeometría y permeabilidad, los geles de colágeno pueden permitir la difusión de moléculas a través de ellos. Las tasas de resorción de colágeno se pueden controlar reticulando el colágeno con compuestos polipoxi. [6] Además, los andamios de colágeno tipo I/III han demostrado una buena biocompatibilidad y son capaces de promover la proliferación de células de Schwann. Sin embargo, los conductos de colágeno llenos de células de Schwann utilizados para cerrar las brechas nerviosas en ratas han mostrado una regeneración nerviosa sorprendentemente infructuosa en comparación con los autoinjertos nerviosos. [6] Esto se debe a que la biocompatibilidad no es el único factor necesario para una regeneración nerviosa exitosa; Otros parámetros como el diámetro interior, la microtopografía interna, la porosidad, el espesor de la pared y la densidad de siembra de células de Schwann deberán examinarse en estudios futuros para mejorar los resultados obtenidos por estos geles de colágeno I/III. [6]
Se ha demostrado que las fibras de seda de araña promueven la adhesión, proliferación y vitalidad celular. Allmeling, Jokuszies et al. demostró que las células de Schwann se adhieren rápida y firmemente a las fibras de seda, creciendo en forma bipolar; Las tasas de proliferación y supervivencia fueron normales en las fibras de seda. [37]
Utilizaron fibras de seda de araña para crear un conducto nervioso con células de Schwann y venas xenogénicas acelularizadas. Las células de Schwann formaron columnas a lo largo de las fibras de seda en un corto período de tiempo, y las columnas eran similares a las bandas de Bungner que crecen in vivo después de una lesión del SNP. [37] La seda de araña no se ha utilizado en ingeniería de tejidos hasta ahora debido a la naturaleza depredadora de las arañas y al bajo rendimiento de seda de las arañas individuales. Se ha descubierto que la especie Nephila clavipes produce seda que es menos inmunogénica que la seda de los gusanos de seda; Tiene una resistencia a la tracción de 4 x 109 N/m, que es seis veces la resistencia a la rotura del acero. [37] Debido a que la seda de araña se degrada proteolíticamente, no hay un cambio en el pH del pH fisiológico durante la degradación. Otras ventajas de la seda de araña incluyen su resistencia a la descomposición de hongos y bacterias durante semanas y el hecho de que no se hincha. Además, la estructura de la seda promueve la adhesión y migración celular. Sin embargo, la recolección de seda sigue siendo una tarea tediosa y la composición exacta varía entre especies e incluso entre individuos de la misma especie dependiendo de la dieta y el medio ambiente. Ha habido intentos de fabricar sintéticamente seda de araña. Se necesitan más estudios para probar la viabilidad de utilizar un conducto nervioso de seda de araña in vitro e in vivo . [37]
Además de las arañas, los gusanos de seda son otra fuente de seda. La proteína de los gusanos de seda Bombyx mori es un núcleo de proteína fibroína rodeada de sericina, que es una familia de proteínas parecidas a pegamentos. La fibroína se ha caracterizado como una cadena pesada con una secuencia hidrófoba y cristalizable repetida: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-X (X significa Ser o Tyr). La sericina circundante es más hidrófila debido a muchos residuos polares, pero todavía tiene algunas porciones de lámina β hidrófobas. Las sedas se han utilizado durante mucho tiempo como suturas debido a su alta resistencia mecánica y flexibilidad, así como a su permeabilidad al agua y al oxígeno. Además, la fibroína de seda se puede manipular y esterilizar fácilmente. Sin embargo, el uso de la seda se detuvo cuando se informaron reacciones inmunológicas indeseables. Recientemente se ha descubierto que la causa de los problemas inmunológicos reside únicamente en la sericina circundante. [38] Desde este descubrimiento, la seda sin sericina se ha utilizado en muchas aplicaciones farmacéuticas y biomédicas. Debido a que es necesario eliminar la sericina alrededor de la fibroína antes de poder utilizar la seda, es necesario desarrollar un procedimiento eficaz para su eliminación, que se conoce como desgomado. Un método de desgomado utiliza una solución acuosa hirviendo de Na 2 CO 3 , que elimina la sericina sin dañar la fibroína. Yang, Chen y cols. demostraron que la fibroína de seda y el extracto fluido de fibroína de seda muestran una buena biocompatibilidad con las células de Schwann, sin efectos citotóxicos sobre la proliferación. [38]
El quitosano y la quitina pertenecen a una familia de biopolímeros compuestos por subunidades de N-acetil-D-glucosamina y D-glucosamina unidas a β (1–4). [39] El quitosano se forma mediante N-desacetilación alcalina de quitina, que es el segundo polímero natural más abundante después de la celulosa. [14] El quitosano es un polisacárido biodegradable que ha sido útil en muchas aplicaciones biomédicas, como agente quelante, portador de fármacos, membrana y aditivo para el tratamiento del agua. [11] El quitosano es soluble en soluciones acuosas diluidas, pero precipita en un gel a un pH neutro. [11] No favorece bien la unión y proliferación de las células neurales, pero puede mejorarse mediante la unión de péptidos derivados de la ECM. El quitosano también contiene propiedades mecánicas débiles, que son más difíciles de superar. [9]
El grado de acetilación (DA) del quitosano soluble varía del 0% al 60%, dependiendo de las condiciones de procesamiento. [39] Se realizó un estudio para caracterizar cómo la variación de DA afecta las propiedades del quitosano. Se obtuvo DA variable utilizando anhídrido acético o hidrólisis alcalina . Se descubrió que la disminución de la acetilación creaba un aumento en la resistencia a la compresión. [39] La biodegradación se examinó mediante el uso de lisozima, que se sabe que es el principal responsable de degradar el quitosano in vivo al hidrolizar sus enlaces glicosídicos y es liberado por las células fagocíticas después de una lesión nerviosa. Los resultados revelan que hubo una pérdida de masa acelerada con los DA intermedios, en comparación con los DA altos y bajos durante el período estudiado. [39] Cuando las células DRG se cultivaron en quitosano N-acetilado, la viabilidad celular disminuyó al aumentar la DA. Además, el quitosano tiene una densidad de carga creciente al disminuir la DA, lo que es responsable de una mayor adhesión celular. [39] Por lo tanto, controlar la DA del quitosano es importante para regular el tiempo de degradación. Este conocimiento podría ayudar en el desarrollo de un conducto de guía nerviosa a partir de quitosano.
Recientemente se ha demostrado que los andamios de aragonito favorecen el crecimiento de neuronas del hipocampo de rata. Shany et al. (2006) demostraron que las matrices de aragonito pueden favorecer el crecimiento de redes astrocíticas in vitro e in vivo . Por tanto, los andamios de aragonito pueden ser útiles para la reparación y regeneración del tejido nervioso. Se plantea la hipótesis de que el Ca 2+ derivado de aragonito es esencial para promover la adherencia celular y el contacto entre células. Esto probablemente se lleva a cabo con la ayuda de moléculas de adhesión dependientes de Ca 2+ , como las cadherinas. [40] Las matrices cristalinas de aragonito tienen muchas ventajas sobre los hidrogeles. Tienen poros más grandes, lo que permite un mejor crecimiento celular, y el material es bioactivo como resultado de la liberación de Ca 2+ , que promueve la adhesión y supervivencia celular. Además, las matrices de aragonito tienen mayor resistencia mecánica que los hidrogeles, lo que les permite soportar más presión cuando se presionan contra el tejido lesionado. [40]
El alginato es un polisacárido que forma cadenas fácilmente; puede entrecruzarse en sus grupos carboxílicos con cationes multivalentes como Cu 2+ , Ca 2+ o Al 3+ para formar un hidrogel mecánicamente más estable. [41] Los alginatos de calcio forman polímeros que son biocompatibles y no inmunogénicos y se han utilizado en aplicaciones de ingeniería de tejidos. Sin embargo, no pueden soportar el crecimiento orientado longitudinalmente, que es necesario para la reconexión del extremo proximal con su objetivo. Para superar este problema, se han desarrollado hidrogeles capilares anisotrópicos (ACH). Se crean superponiendo soluciones acuosas de alginato de sodio con soluciones acuosas de cationes multivalentes en capas. [41] Después de la formación, los iones electrolitos se difunden en las capas de solución de polímero y un proceso convectivo disipativo hace que los iones precipiten, creando capilares. El proceso convectivo disipativo resulta de la oposición de gradientes de difusión y fricción entre las cadenas de polielectrolitos . [41] Las paredes capilares están revestidas con el alginato metálico precipitado, mientras que el lumen se llena con el agua extruida.
Prang et al. (2006) evaluaron la capacidad de los geles de ACH para promover el recrecimiento axonal dirigido en el SNC de los mamíferos lesionados. Los iones multivalentes utilizados para crear los geles de ACH a base de alginato fueron iones de cobre, cuya difusión en las capas de alginato de sodio creó geles capilares anisotrópicos de estructura hexagonal. [41] Después de la precipitación, todo el gel fue atravesado por capilares orientados longitudinalmente. Los andamios ACH promovieron la supervivencia de los NPC adultos y la regeneración de axones altamente orientada. [41] Este es el primer caso de uso de alginatos para producir geles capilares estructurados anisotrópicos. Se necesitan estudios futuros para estudiar la estabilidad física a largo plazo de las estructuras de ACH, porque la regeneración de los axones del SNC puede tardar muchos meses; sin embargo, además de poder proporcionar soporte a largo plazo, los andamios también deben ser degradables. De todos los biopolímeros biológicos y sintéticos investigados por Prang et al. (2006), sólo los geles a base de agarosa pudieron compararse con la regeneración lineal causada por los andamios de ACH. Los estudios futuros también deberán investigar si los andamios de ACH permiten la reinervación del objetivo in vivo después de una lesión de la médula espinal. [41]
El ácido hialurónico (AH) es un biomaterial ampliamente utilizado debido a su excelente biocompatibilidad y diversidad de funciones fisiológicas. Es abundante en la matriz extracelular (ECM), donde se une a los glicosaminoglicanos (GAG) y proteoglicanos grandes a través de interacciones específicas entre la proteína HA y la HA. El HA también se une a receptores de la superficie celular como el CD44, lo que da como resultado la activación de cascadas de señalización intracelular que regulan la adhesión y la motilidad celular y promueven la proliferación y diferenciación. [42] También se sabe que el HA apoya la angiogénesis porque sus productos de degradación estimulan la proliferación y migración de células endoteliales. Por tanto, la HA desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de los procesos normales necesarios para la supervivencia del tejido. El HA sin modificar se ha utilizado en aplicaciones clínicas como cirugía ocular, cicatrización de heridas y cirugía plástica. [42] El HA se puede reticular para formar hidrogeles. Se implantaron hidrogeles de HA sin modificar o modificados con laminina en una lesión del sistema nervioso central de un adulto y se probó su capacidad para inducir la formación de tejido neural en un estudio realizado por Hou et al. Demostraron la capacidad de favorecer el crecimiento celular interno y la angiogénesis, en además de inhibir la formación de cicatrices gliales. Además, los hidrogeles de HA modificados con laminina pudieron promover la extensión de neuritas. [42] Estos resultados respaldan los geles de HA como un biomaterial prometedor para un conducto de guía nerviosa.
Además del material de soporte y las señales físicas, también se pueden incorporar señales biológicas en un conducto nervioso bioartificial en forma de células. En el sistema nervioso hay muchos tipos diferentes de células que ayudan a apoyar el crecimiento y mantenimiento de las neuronas. Estas células se denominan colectivamente células gliales. Se han investigado las células gliales en un intento de comprender los mecanismos detrás de su capacidad para promover la regeneración de los axones. Se analizan tres tipos de células gliales: células de Schwann, astrocitos y células envolventes olfatorias. Además de las células gliales, las células madre también tienen beneficios potenciales para la reparación y regeneración porque muchas son capaces de diferenciarse en neuronas o células gliales. Este artículo analiza brevemente el uso de células madre adultas, mesenquimales, ectomesenquimales, neurales y progenitoras neurales transdiferenciadas.
Las células gliales son necesarias para apoyar el crecimiento y mantenimiento de las neuronas en el sistema nervioso central y periférico. La mayoría de las células gliales son específicas del sistema nervioso periférico o central. Las células de Schwann se encuentran en el sistema nervioso periférico donde mielinizan los axones de las neuronas. Los astrocitos son específicos del sistema nervioso central; Proporcionan nutrientes, soporte físico y aislamiento para las neuronas. También forman la barrera hematoencefálica. Sin embargo, las células envolventes olfatorias cruzan el límite entre el SNC y el SNP porque guían a las neuronas receptoras olfatorias desde el SNP al SNC.
Las células de Schwann (SC) son cruciales para la regeneración de los nervios periféricos; desempeñan funciones tanto estructurales como funcionales. Las células de Schwann son las responsables de participar tanto en la degeneración walleriana como en las bandas de Bungner. Cuando se daña un nervio periférico, las células de Schwann alteran su morfología, comportamiento y proliferación para involucrarse en la degeneración walleriana y las bandas de Bungner. [38] En la degeneración walleriana, las células de Schwann crecen en columnas ordenadas a lo largo del tubo endoneural, creando una banda de Bungner (boB) que protege y preserva el canal endoneural. Además, liberan factores neurotróficos que mejoran el recrecimiento junto con los macrófagos. Existen algunas desventajas al utilizar células de Schwann en la ingeniería de tejidos neurales; por ejemplo, es difícil aislar selectivamente las células de Schwann y muestran una escasa proliferación una vez aisladas. Una forma de superar esta dificultad es inducir artificialmente otras células, como las células madre, en fenotipos similares a SC. [43]
Eguchi et al. (2003) han investigado el uso de campos magnéticos para alinear las células de Schwann. Utilizaron un imán superconductor de tipo horizontal, que produce un campo de 8 T en su centro. A las 60 horas de exposición, las células de Schwann se alinearon paralelas al campo; Durante el mismo intervalo, las células de Schwann no expuestas se orientaron de forma aleatoria. Se plantea la hipótesis de que las diferencias en la susceptibilidad al campo magnético de los componentes de la membrana y los elementos del citoesqueleto pueden causar la orientación magnética. [44] Las fibras de colágeno también se expusieron al campo magnético y, en 2 horas, se alinearon perpendicularmente al campo magnético, mientras que las fibras de colágeno formaron un patrón de malla aleatorio sin exposición al campo magnético. Cuando se cultivaron en las fibras de colágeno, las células de Schwann se alinearon a lo largo del colágeno orientado magnéticamente después de dos horas de exposición al campo magnético 8-T. Por el contrario, las células de Schwann se orientaron aleatoriamente sobre las fibras de colágeno sin exposición a campos magnéticos. Por lo tanto, el cultivo en fibras de colágeno permitió que las células de Schwann se orientaran perpendicularmente al campo magnético y mucho más rápido. [44]
Estos hallazgos pueden ser útiles para alinear las células de Schwann en una lesión del sistema nervioso para promover la formación de bandas de Bungner, que son cruciales para mantener el tubo endoneural que guía los axones en crecimiento de regreso a sus objetivos. Es casi imposible alinear las células de Schwann mediante técnicas físicas externas; por tanto, el descubrimiento de una técnica alternativa de alineación es importante. Sin embargo, la técnica desarrollada todavía tiene sus desventajas, concretamente que se necesita una cantidad considerable de energía para mantener el campo magnético durante períodos prolongados.
Se han realizado estudios en un intento de mejorar la capacidad migratoria de las células de Schwann. La migración de las células de Schwann está regulada por integrinas con moléculas de ECM como la fibronectina y la laminina. Además, se sabe que la molécula de adhesión de células neurales ( NCAM ) mejora la motilidad de las células de Schwann in vitro . [45] NCAM es una glicoproteína que se expresa en las membranas celulares axonales y de Schwann. El ácido polisiálico (PSA) se sintetiza en NCAM mediante la polisiailtransferasa (PST) y la sialiltransferasa X (STX). [45] Durante el desarrollo del SNC, la expresión de PSA en NCAM aumenta hasta las etapas posnatales. Sin embargo, en el cerebro adulto el PSA se encuentra sólo en regiones con alta plasticidad . La expresión de PSA no ocurre en las células de Schwann.
Lavdas et al. (2006) investigaron si la expresión sostenida de PSA en células de Schwann mejora su migración. Las células de Schwann se transdujeron con un vector retroviral que codifica STX para inducir la expresión de PSA. Las células de Schwann que expresan PSA obtuvieron una motilidad mejorada, como se demostró en un ensayo de puenteo de brechas y después del injerto en cultivos de cortes de cerebro anterior posnatales. [45] La expresión de PSA no alteró la diferenciación molecular y morfológica. Las células de Schwann que expresan PSA pudieron mielinizar los axones del SNC en cortes cerebelosos, lo que normalmente no es posible in vivo . Es de esperar que estas células de Schwann que expresan PSA puedan migrar por todo el SNC sin pérdida de capacidad mielinizante y puedan resultar útiles para la regeneración y mielinización de los axones en el sistema nervioso central. [45]
Los astrocitos son células gliales que abundan en el sistema nervioso central. Son cruciales para el soporte metabólico y trófico de las neuronas; Además, los astrocitos proporcionan amortiguación de iones y eliminación de neurotransmisores. Los axones en crecimiento son guiados por señales creadas por los astrocitos; por lo tanto, los astrocitos pueden regular la búsqueda de caminos de las neuritas y, posteriormente, los patrones en el cerebro en desarrollo. [40] La cicatriz glial que se forma después de una lesión en el sistema nervioso central está formada por astrocitos y fibroblastos ; es el obstáculo más importante para la regeneración. La cicatriz glial consta de astrocitos hipertrofiados, tejido conectivo y MEC. Dos objetivos de la ingeniería de tejidos neurales son comprender la función de los astrocitos y desarrollar el control sobre el crecimiento de los astrocitos. Los estudios de Shany et al. (2006) han demostrado que las tasas de supervivencia de los astrocitos aumentan en matrices de aragonito 3D en comparación con cultivos celulares 2D convencionales. La capacidad de los procesos celulares para extenderse a través de curvas y poros permite la formación de múltiples capas celulares con configuraciones 3D complejas.
Las tres formas distintas por las cuales las células adquirieron una forma 3D son: [40]
En el cultivo celular convencional, el crecimiento se restringe a un plano, lo que provoca la formación de una monocapa en la que la mayoría de las células entran en contacto con la superficie; sin embargo, la curvatura 3D de la superficie de aragonito permite que se desarrollen múltiples capas y que los astrocitos muy separados entren en contacto entre sí. Es importante promover la formación de procesos similares a las condiciones 3D in vivo , porque la morfología del proceso astrocítico es esencial para guiar la direccionalidad de los axones en regeneración. [40] La topografía de aragonita proporciona una alta relación superficie-volumen y carece de bordes, lo que conduce a una reducción del efecto de borde del cultivo. [40] Se permiten matrices cristalinas como la aragonita mencionada aquí para la promoción de una formación de tejido 3D compleja que se aproxima a las condiciones in vivo .
El sistema olfativo primario de los mamíferos ha conservado la capacidad de regenerarse continuamente durante la edad adulta. [46] Las neuronas receptoras olfativas tienen una vida útil promedio de 6 a 8 semanas y, por lo tanto, deben ser reemplazadas por células diferenciadas de las células madre que se encuentran dentro de una capa en la base del epitelio cercano. Las nuevas neuronas receptoras olfativas deben proyectar sus axones a través del SNC hasta un bulbo olfativo para ser funcionales. El crecimiento axonal está guiado por la composición glial y la citoarquitectura del bulbo olfatorio, además de la presencia de células envolventes olfatorias (OEC). [46]
Se postula que las OEC se originan en la placoda olfativa , lo que sugiere un origen de desarrollo diferente al de otras microglías similares del sistema nervioso.
Otro concepto interesante es que las OEC se encuentran en las porciones del sistema nervioso central y periférico del sistema olfatorio primario, es decir, el epitelio y el bulbo olfatorio. [46]
Las OEC son similares a las células de Schwann en que proporcionan una regulación positiva del receptor p75 de NGF de baja afinidad después de una lesión; sin embargo, a diferencia de las células de Schwann, producen niveles más bajos de neurotrofinas . Varios estudios han demostrado que las OEC pueden favorecer la regeneración de los axones lesionados, pero estos resultados a menudo no se pueden reproducir. [46] Independientemente, los OEC se han investigado a fondo en relación con las lesiones de la médula espinal, la esclerosis lateral amiotrófica y otras enfermedades neurodegenerativas. Los investigadores sugieren que estas células poseen una capacidad única para remielinizar las neuronas lesionadas. [47]
Las OEC tienen propiedades similares a las de los astrocitos , [48] y se ha identificado que ambos son susceptibles a la infección viral. [47] [48]
Las células madre se caracterizan por su capacidad de autorrenovarse durante un tiempo prolongado y aún mantener la capacidad de diferenciarse a lo largo de uno o más linajes celulares. Las células madre pueden ser unipotentes, multipotentes o pluripotentes, lo que significa que pueden diferenciarse en uno, varios o todos los tipos de células, respectivamente. [49] Las células madre pluripotentes pueden convertirse en células derivadas de cualquiera de las tres capas germinales embrionarias. [49] Las células madre tienen la ventaja sobre las células gliales porque pueden proliferar más fácilmente en cultivo. Sin embargo, sigue siendo difícil diferenciar preferentemente estas células en diversos tipos de células de manera ordenada. [4] Otra dificultad con las células madre es la falta de una definición bien definida de células madre más allá de las células madre hematopoyéticas (HSC). Cada 'tipo' de célula madre tiene más de un método para identificar, aislar y expandir las células; Esto ha causado mucha confusión porque todas las células madre de un "tipo" (neural, mesenquimatosa, retiniana) no necesariamente se comportan de la misma manera en condiciones idénticas.
Las células madre adultas no son capaces de proliferar y diferenciarse con tanta eficacia in vitro como lo son in vivo . Las células madre adultas pueden provenir de muchas ubicaciones tisulares diferentes, pero es difícil aislarlas porque están definidas por el comportamiento y no por marcadores de superficie. Aún no se ha desarrollado un método para distinguir claramente entre las células madre y las células diferenciadas que las rodean. Sin embargo, todavía se pueden utilizar marcadores de superficie hasta cierto punto para eliminar la mayoría de las células diferenciadas no deseadas. La plasticidad de las células madre es la capacidad de diferenciarse a través de los límites de la línea germinal embrionaria. Sin embargo, la presencia de plasticidad ha sido muy cuestionada. Algunos afirman que la plasticidad es causada por la heterogeneidad entre las células o por eventos de fusión celular. Actualmente, las células se pueden diferenciar entre líneas celulares con rendimientos que oscilan entre el 10% y el 90%, según las técnicas utilizadas. [49] Es necesario realizar más estudios para estandarizar el rendimiento con transdiferenciación. La transdiferenciación de células madre multipotentes es un medio potencial para obtener células madre que no están disponibles o no se obtienen fácilmente en el adulto. [4]
Las células madre mesenquimales son células madre adultas que se encuentran en la médula ósea; son capaces de diferenciarse en linajes de origen mesodérmico. Algunos ejemplos de tejido que forman son hueso , cartílago , grasa y tendón . Las MSC se obtienen mediante aspiración de médula ósea. Muchos factores promueven el crecimiento de las MSC, entre ellos: el factor de crecimiento derivado de plaquetas , el factor de crecimiento epidérmico β y el factor de crecimiento similar a la insulina-1 . Además de sus vías de diferenciación normales, las MSC pueden transdiferenciarse a lo largo de linajes no mesenquimales como astrocitos, neuronas y células mielinizantes del SNP. Las MSC son potencialmente útiles para estrategias de regeneración nerviosa porque: [50]
Keilhoff y cols. (2006) realizaron un estudio comparando la capacidad de regeneración nerviosa de MSC no diferenciadas y transdiferenciadas con células de Schwann en injertos de músculo desvitalizados que unen una brecha de 2 cm en el nervio ciático de rata. Todas las células eran autólogas. Las MSC transdiferenciadas se cultivaron en una mezcla de factores para promover la formación de células similares a células de Schwann. Las MSC indiferenciadas no demostraron capacidad regenerativa, mientras que las MSC transdiferenciadas mostraron cierta capacidad regenerativa, aunque no alcanzó la capacidad de las células de Schwann. [50]
La dificultad de aislar las células de Schwann y posteriormente inducir su proliferación es un gran obstáculo. Una solución es inducir selectivamente células como las células madre ectomesenquimales (EMSC) en fenotipos similares a las células de Schwann. Las EMSC son células de la cresta neural que migran desde la cresta neural craneal hacia el primer arco branquial durante el desarrollo temprano del sistema nervioso periférico. [43] Los EMSC son multipotentes y poseen una capacidad de autorrenovación. Se pueden considerar células progenitoras de Schwann porque están asociadas con el ganglio de la raíz dorsal y el desarrollo del nervio motor. La diferenciación de EMSC parece estar regulada por programas genéticos intrínsecos y señales extracelulares en el entorno circundante. [43] Las células de Schwann son la fuente de factores neurotrópicos y neurotróficos esenciales para la regeneración de los nervios y un andamio para guiar el crecimiento. Nie, Zhang et al. realizó un estudio que investiga los beneficios de cultivar EMSC dentro de conductos PLGA. La adición de foskolina y BPE a un cultivo de EMSC provocó la formación de procesos celulares alargados, que es común a las células de Schwann in vitro . [43] Por lo tanto, la foskolina y el BPF pueden inducir la diferenciación en fenotipos similares a las células de Schwann. BPE contiene las citocinas GDNF , factor de crecimiento de fibroblastos básico y factor de crecimiento derivado de plaquetas , que provocan la diferenciación y proliferación de células gliales y de Schwann mediante la activación de MAP quinasas . Cuando se implantaron en los conductos PLGA, las EMSC mantuvieron una supervivencia a largo plazo y promovieron la regeneración de los nervios periféricos a través de un espacio de 10 mm, lo que generalmente demuestra poca o ninguna regeneración. Dentro de los injertos había axones mielinizados y se formaron láminas basales dentro de la mielina. Estas observaciones sugieren que las EMSC pueden promover la mielinización de fibras nerviosas regeneradas dentro del conducto.
Insertar neuronas en un conducto nervioso bioartificial parece el método más obvio para reemplazar los nervios dañados; sin embargo, las neuronas no pueden proliferar y, a menudo, tienen una vida corta en cultivo. Por lo tanto, las células progenitoras neurales son candidatas más prometedoras para reemplazar las neuronas dañadas y degeneradas porque se renuevan a sí mismas, lo que permite la producción in vitro de muchas células con un mínimo de material donante. [31] Para confirmar que las nuevas neuronas formadas a partir de células progenitoras neurales son parte de una red funcional, se requiere la presencia de formación de sinapsis. Un estudio de Ma, Fitzgerald et al. es la primera demostración de la sinapsis funcional y la formación de redes neuronales derivadas de células progenitoras y tallo neural murino en una matriz de colágeno 3D. Las células progenitoras neurales se expandieron y diferenciaron espontáneamente en neuronas excitables y formaron sinapsis; además, conservaron la capacidad de diferenciarse en los tres linajes de tejido neural. [31] También se demostró que no sólo se producía un reciclaje activo de vesículas sinápticas, sino que también se formaban conexiones excitadoras e inhibidoras capaces de generar potenciales de acción de forma espontánea. [31] Por lo tanto, las células progenitoras neurales son una fuente viable y relativamente ilimitada para crear neuronas funcionales.
Las células madre neuronales (NSC) tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en linajes neuronales y gliales. Se han desarrollado muchos métodos de cultivo para dirigir la diferenciación de NSC; sin embargo, la creación de biomateriales para dirigir la diferenciación de NSC se considera una tecnología clínicamente más relevante y utilizable. [ cita necesaria ] Un enfoque para desarrollar un biomaterial para dirigir la diferenciación de NSC es combinar componentes de la matriz extracelular (ECM) y factores de crecimiento. Un estudio muy reciente de Nakajima, Ishimuro et al. examinaron los efectos de diferentes pares moleculares que consisten en un factor de crecimiento y un componente de la ECM en la diferenciación de las NSC en astrocitos y células neuronales. Los componentes de la ECM investigados fueron laminina-1 y fibronectina, que son componentes naturales de la ECM, y ProNectin F plus (Pro-F) y ProNectin L (Pro-L), que son componentes artificiales de la ECM, y poli(etilenimina) (PEI). Los factores neurotróficos utilizados fueron el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos -2 (FGF-2), el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina-3 (NT-3) y el factor neurotrófico ciliar (CNTF). Las combinaciones de pares se inmovilizaron en matrices celulares, en las que se cultivaron las NSC. Después de 2 días en cultivo, las células se tiñeron con anticuerpos contra nestina , β- tubulina III y GFAP , que son marcadores de NSC, células neuronales y astrocitos, respectivamente. [51] Los resultados proporcionan información valiosa sobre combinaciones ventajosas de componentes de ECM y factores de crecimiento como método práctico para desarrollar un biomaterial para dirigir la diferenciación de NSC. [51]
Actualmente, los factores neurotróficos se están estudiando intensamente para su uso en conductos nerviosos bioartificiales porque son necesarios in vivo para dirigir el crecimiento y la regeneración de los axones. En los estudios, los factores neurotróficos normalmente se utilizan junto con otras técnicas, como señales biológicas y físicas creadas mediante la adición de células y topografías específicas. Los factores neurotróficos pueden o no estar inmovilizados en la estructura de andamio, aunque se prefiere la inmovilización porque permite la creación de gradientes permanentes y controlables. En algunos casos, como en los sistemas neuronales de administración de fármacos , están ligeramente inmovilizados de modo que puedan liberarse selectivamente en momentos y cantidades específicas. La administración de fármacos es el siguiente paso más allá de la adición básica de factores de crecimiento a los conductos de guía nerviosa.
Muchos biomateriales utilizados para conductos de guía nerviosa son materiales biomiméticos . Los materiales biomiméticos son materiales que se han diseñado de tal manera que provocan respuestas celulares específicas mediadas por interacciones con péptidos unidos a andamios de proteínas de la ECM; esencialmente, la incorporación de péptidos de unión a células en biomateriales mediante modificación química o física. [52]
El sinergismo suele ocurrir cuando se combinan dos elementos; es una interacción entre dos elementos que provoca un efecto mayor que los efectos combinados de cada elemento por separado. La sinergia es evidente en la combinación de material de andamio y topografía con terapias celulares, factores neurotróficos y materiales biomiméticos. La investigación de la sinergia es el siguiente paso después de que las técnicas individuales hayan demostrado ser exitosas por sí solas. Las combinaciones de estos diferentes factores deben estudiarse cuidadosamente para optimizar los efectos sinérgicos.
Se planteó la hipótesis de que las interacciones entre factores neurotróficos podrían alterar las concentraciones óptimas de cada factor. Si bien la supervivencia celular y el mantenimiento del fenotipo son importantes, el énfasis de la evaluación estuvo en la extensión de las neuritas. Se presentó in vitro una combinación de NGF , factor neurotrófico derivado de la línea celular glial ( GDNF ) y factor neurotrófico ciliar ( CNTF ) a cultivos de ganglios de la raíz dorsal . Se utilizó un factor de cada familia neurotrófica. [53] Se determinó que no existe una diferencia entre la concentración óptima individual y la concentración óptima combinatoria; sin embargo, alrededor del día 5 o 6 las neuritas dejaron de extenderse y comenzaron a degradarse. Se planteó la hipótesis de que esto se debía a la falta de un nutriente crítico o de gradientes adecuados; Estudios previos han demostrado que los factores de crecimiento pueden optimizar mejor la extensión de las neuritas cuando se presentan en gradientes. [53] Los estudios futuros sobre combinaciones de factores neurotróficos deberán incluir gradientes.
Las moléculas de adhesión celular (CAM) y los factores neurotróficos integrados en matrices biocompatibles es un concepto relativamente nuevo que se está investigando. [54] Las CAM de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF), que incluyen L1/NgCAM y neurofascina, son particularmente prometedoras porque se expresan en el sistema nervioso en desarrollo en neuronas o células de Schwann. Se sabe que sirven como señales de orientación y median en la diferenciación neuronal. Sin embargo, los factores neurotróficos como el NGF y el factor de diferenciación del crecimiento 5 (GDF-5) están bien establecidos como promotores de la regeneración in vivo . Un estudio reciente de Niere, Brown et al. investigó los efectos sinérgicos de la combinación de L1 y neurofascina con NGF y GDF-5 en neuronas DRG en cultivo; esta combinación mejoró el crecimiento de neuritas. Se demostró una mejora adicional combinando L1 y neurofascina en una proteína de fusión artificial, lo que mejora la eficiencia ya que los factores no se administran individualmente. [54] No sólo se pueden utilizar diferentes señales, sino que incluso se pueden fusionar en una única señal "nueva".
No se ha explorado el efecto de la presentación de múltiples tipos de estímulos, como señales químicas, físicas y biológicas, sobre la diferenciación de las células progenitoras neurales. Se llevó a cabo un estudio en el que se presentaron tres estímulos diferentes a las células progenitoras del hipocampo de rata adulta (AHPC): astrocitos posnatales tipo 1 de rata (biológicos), laminina (químicos) y sustrato con micromodelos (físicos). [55] Más del 75% de los AHPC se alinearon dentro de los 20° de las ranuras en comparación con el crecimiento aleatorio en los sustratos sin patrón. [55] Cuando las AHPC se cultivaron en sustratos con micromodelos con astrocitos, el crecimiento estuvo influenciado por los astrocitos que se habían alineado con los surcos; es decir, las AHPC extendieron procesos a lo largo de los filamentos del citoesqueleto astrocítico. Sin embargo, la alineación no fue tan significativa como la observada por los AHPC en cultivo solo con el sustrato micropatrón. Para evaluar los diferentes fenotipos expresados como resultado de la diferenciación, las células se tiñeron con anticuerpos para β-tubulina de clase III (TuJI), proteína que interactúa con el receptor (RIP) y proteína ácida fibrilar glial (GFAP), que son marcadores de neuronas tempranas, oligodendrocitos y astrocitos, respectivamente. La mayor cantidad de diferenciación se observó con AHPC cultivadas en sustratos modelados con astrocitos. [55]
{{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace ){{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace )