El superenrollamiento del ADN se refiere a la cantidad de torsión en una hebra de ADN en particular , que determina la cantidad de tensión sobre ella. Una hebra dada puede estar "superenrollada positivamente" o "superenrollada negativamente" (más o menos fuertemente enrollada). La cantidad de superenrollamiento de una hebra afecta una serie de procesos biológicos, como la compactación del ADN y la regulación del acceso al código genético (lo que afecta fuertemente el metabolismo del ADN y posiblemente la expresión génica). Ciertas enzimas, como las topoisomerasas , cambian la cantidad de superenrollamiento del ADN para facilitar funciones como la replicación y la transcripción del ADN . [1] La cantidad de superenrollamiento en una hebra dada se describe mediante una fórmula matemática que la compara con un estado de referencia conocido como ADN de "forma B relajada".
En un segmento de doble hélice "relajado" de ADN-B , las dos hebras se retuercen alrededor del eje helicoidal una vez cada 10,4–10,5 pares de bases de secuencia . Añadir o quitar giros, como hacen algunas enzimas , impone tensión. Si un segmento de ADN sometido a tensión de torsión se cierra en un círculo uniendo sus dos extremos y luego se le permite moverse libremente, adquiere una forma diferente, como un ocho. Esta forma se conoce como superenrollamiento . (La forma nominal "superenrollamiento" se utiliza a menudo para describir la topología del ADN ).
El ADN de la mayoría de los organismos suele estar superenrollado negativamente. Se vuelve superenrollado positivamente de forma temporal cuando se replica o se transcribe. Estos procesos se inhiben (regulan) si no se relaja rápidamente. La forma más simple de un superenrollado es la de un ocho; una cadena de ADN circular asume esta forma para dar cabida a más o menos giros helicoidales. Los dos lóbulos de la figura del ocho aparecerán rotados en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario uno con respecto al otro, dependiendo de si la hélice está sobreenrollada o subenrollada. Por cada giro helicoidal adicional que se dé, los lóbulos mostrarán una rotación más sobre su eje. [2]
Las contorsiones lobulares de un ADN circular, como la rotación de los lóbulos en forma de ocho que se muestran arriba, se denominan writhe . El ejemplo anterior ilustra que twist y writhe son interconvertibles. El superenrollamiento se puede representar matemáticamente mediante la suma de twist y writhe. El twist es el número de vueltas helicoidales en el ADN y el writhe es el número de veces que la doble hélice se cruza sobre sí misma (estas son las superenrollaciones). Las torsiones helicoidales adicionales son positivas y conducen a un superenrollamiento positivo, mientras que la torsión sustractiva causa un superenrollamiento negativo. Muchas enzimas topoisomerasas detectan el superenrollamiento y lo generan o lo disipan a medida que cambian la topología del ADN.
En parte debido a que los cromosomas pueden ser muy grandes, los segmentos en el medio pueden actuar como si sus extremos estuvieran anclados. Como resultado, pueden ser incapaces de distribuir el exceso de torsión al resto del cromosoma o de absorber la torsión para recuperarse de la falta de enrollamiento; en otras palabras, los segmentos pueden volverse superenrollados . En respuesta al superenrollamiento, asumirán una cierta cantidad de torsión, como si sus extremos estuvieran unidos.
El ADN superenrollado forma dos estructuras: un plectonema o un toroide , o una combinación de ambos. Una molécula de ADN superenrollada negativamente producirá una hélice de una sola hélice levógira, el toroide, o una hélice de dos hélices dextrógiras con bucles terminales, el plectonema. Los plectonemas son típicamente más comunes en la naturaleza, y esta es la forma que adoptarán la mayoría de los plásmidos bacterianos . Para moléculas más grandes es común que se formen estructuras híbridas: un bucle en un toroide puede extenderse hasta convertirse en un plectonema. Si todos los bucles de un toroide se extienden, se convierte en un punto de ramificación en la estructura plectonémica. El superenrollamiento del ADN es importante para el empaquetamiento del ADN dentro de todas las células, y también parece desempeñar un papel en la expresión génica. [3] [4]
Basándose en las propiedades de las moléculas intercalantes , es decir, que emiten fluorescencia al unirse al ADN y desenrollarse los pares de bases del ADN, en 2016 se introdujo una técnica de molécula única para visualizar directamente plectonemas individuales a lo largo del ADN superenrollado [5], lo que permitiría estudiar además las interacciones de las proteínas de procesamiento del ADN con el ADN superenrollado. En ese estudio, se utilizó Sytox Orange (un colorante intercalante) para inducir el superenrollamiento en las moléculas de ADN unidas a la superficie.
Utilizando este ensayo , se encontró que la secuencia de ADN codifica la posición de las superenrollaciones plectonémicas. [6] Además, se encontró que las superenrollaciones de ADN estaban enriquecidas en los sitios de inicio de la transcripción en procariotas .
El superenrollamiento del ADN es importante para el empaquetamiento del ADN dentro de todas las células. Debido a que la longitud del ADN puede ser miles de veces la de una célula, empaquetar este material genético en la célula o el núcleo (en eucariotas ) es una hazaña difícil. El superenrollamiento del ADN reduce el espacio y permite que el ADN se empaquete. En los procariotas, los superenrollamientos plectonémicos son predominantes, debido al cromosoma circular y a la cantidad relativamente pequeña de material genético. En los eucariotas, el superenrollamiento del ADN existe en muchos niveles tanto de superenrollamientos plectonémicos como solenoidales, siendo el superenrollamiento solenoidal el más eficaz para compactar el ADN. El superenrollamiento solenoidal se logra con histonas para formar una fibra de 10 nm. Esta fibra se enrolla aún más en una fibra de 30 nm y se enrolla sobre sí misma varias veces más.
El empaquetamiento del ADN aumenta considerablemente durante la mitosis cuando los ADN hermanos duplicados se segregan en las células hijas. Se ha demostrado que la condensina , un gran complejo proteico que desempeña un papel central en el ensamblaje de los cromosomas mitóticos, induce superenrollamientos positivos de una manera dependiente de la hidrólisis de ATP in vitro . [7] [8] El superenrollamiento también podría desempeñar un papel importante durante la interfase en la formación y el mantenimiento de los dominios de asociación topológica (TAD). [9]
El superenrollamiento también es necesario para la síntesis de ADN/ARN . Debido a que el ADN debe desenrollarse para que la ADN/ARN polimerasa actúe, se producirán superenrollamientos. La región que se encuentra delante del complejo de la polimerasa se desenrollará; esta tensión se compensa con superenrollamientos positivos delante del complejo. Detrás del complejo, el ADN se reenrolla y habrá superenrollamientos negativos compensatorios . Las topoisomerasas como la ADN girasa (topoisomerasa tipo II) desempeñan un papel en el alivio de parte del estrés durante la síntesis de ADN/ARN. [10]
En muchas especies bacterianas, las barreras a la difusión de superenrollamiento dividen el genoma en una serie de dominios de superenrollamiento (SD) topológicamente aislados. [11] Estos SD desempeñan un papel importante en la organización del nucleoide . Los SD están superenrollados negativamente en promedio, pero a veces también pueden estar superenrollados positivamente. El grado de superenrollamiento puede variar en respuesta a diferentes formas de estrés e influye en la unión de diferentes proteínas asociadas a nucleoides (NAP) que organizan aún más el genoma bacteriano. [12] Por ejemplo, se ha demostrado que los Dps de E. coli se unen al ADN superenrollado mucho más rápidamente que al ADN relajado torsionalmente. [13]
Las proteínas especializadas pueden abrir pequeños segmentos de la molécula de ADN cuando se replica o se transcribe en ARN . Pero un trabajo publicado en 2015 ilustra cómo el ADN se abre por sí solo. [3] [4]
El simple hecho de torcer el ADN puede exponer las bases internas al exterior, sin la ayuda de ninguna proteína. Además, la transcripción en sí misma contorsiona el ADN en las células humanas vivas, apretando algunas partes de la espiral y aflojándola en otras. Ese estrés desencadena cambios en la forma, en particular la apertura de la hélice para que pueda ser leída. Desafortunadamente, estas interacciones son muy difíciles de estudiar porque las moléculas biológicas cambian de forma con mucha facilidad. En 2008 se observó que la transcripción tuerce el ADN, dejando un rastro de ADN subenrollado (o superenrollado negativamente) a su paso. Además, descubrieron que la secuencia de ADN en sí misma afecta la forma en que la molécula responde al superenrollamiento. [3] [4]
Por ejemplo, los investigadores identificaron una secuencia específica de ADN que regula la velocidad de transcripción; a medida que la cantidad de superenrollamiento aumenta o disminuye, disminuye o acelera el ritmo al que la maquinaria molecular lee el ADN. [3] Se plantea la hipótesis de que estos cambios estructurales podrían desencadenar estrés en otras partes a lo largo de su longitud, lo que a su vez podría proporcionar puntos de activación para la replicación o la expresión genética. [3] [4] Esto implica que es un proceso muy dinámico en el que tanto el ADN como las proteínas influyen en cómo actúa y reacciona el otro. [3]
Casi la mitad de los genes de la bacteria E. coli que se reprimen durante el choque frío se reprimen de manera similar cuando la girasa se bloquea con el antibiótico novobiocina. [14] Además, durante los choques fríos, la densidad de nucleoides aumenta y la proteína girasa y el nucleoide se colocalizan (lo que es consistente con una reducción en la relajación del ADN). Esto es evidencia de que la reducción del superenrollamiento negativo del ADN es uno de los principales mecanismos responsables del bloqueo de la transcripción de la mitad de los genes que conducen el programa de respuesta transcripcional al choque frío de las bacterias. Con base en esto, se ha propuesto un modelo estocástico de este proceso. Este modelo se ilustra en la figura, donde las reacciones 1 representan la transcripción y su bloqueo debido al superenrollamiento. Mientras tanto, las reacciones 2 a 4 modelan, respectivamente, la traducción y la degradación de ARN y proteínas. [14]
En la naturaleza, el ADN circular siempre se aísla como una hélice sobre hélice de orden superior, conocida como superhélice . En los debates sobre este tema, el giro de Watson-Crick se denomina enrollamiento "secundario" y las superhélices, enrollamiento "terciario". El esquema de la derecha indica una doble hélice de Watson-Crick "relajada" o "circular abierta" y, junto a ella, una superhélice dextrógira. La estructura "relajada" de la izquierda no se encuentra a menos que el cromosoma esté mellado; la superhélice es la forma que se encuentra habitualmente en la naturaleza.
A los efectos de los cálculos matemáticos, una superhélice dextrógira se define como aquella que tiene un número "negativo" de vueltas superhelicoidales, y una superhélice levógira se define como aquella que tiene un número "positivo" de vueltas superhelicoidales. En el dibujo (mostrado a la derecha), tanto el devanado secundario ( es decir, "Watson–Crick") como el devanado terciario ( es decir, "superhelicoidal") son dextrógiros, por lo tanto, las supertorsiones son negativas (-3 en este ejemplo).
Se supone que la superhelicidad es resultado de un enrollamiento insuficiente, lo que significa que hay una deficiencia en el número de giros secundarios de Watson-Crick. Un cromosoma de este tipo se tensará, al igual que un resorte metálico macroscópico se tensa cuando se lo enrolla demasiado o se lo desenrolla. En el ADN que se tensa de esta manera, aparecerán supergiros.
El superenrollamiento del ADN se puede describir numéricamente por cambios en el número de enlace Lk . El número de enlace es la propiedad más descriptiva del ADN superenrollado. Lk o , el número de vueltas en el plásmido/molécula de ADN relajado (tipo B), se determina dividiendo los pares de bases totales de la molécula por el pb /vuelta relajado que, según la referencia, es 10,4; [15] 10,5; [16] [17] 10,6. [18]
Lk es el número de cruces que una sola hebra hace con otra, a menudo visualizado como el número de giros Watson-Crick que se encuentran en un cromosoma circular en una proyección plana (generalmente imaginaria). Este número está físicamente "bloqueado" en el momento del cierre covalente del cromosoma y no se puede alterar sin que se rompa la hebra.
La topología del ADN se describe mediante la siguiente ecuación en la que el número de enlace es equivalente a la suma de Tw , que es el número de giros o vueltas de la doble hélice, y Wr , que es el número de espirales o "retorcimientos". Si hay una molécula de ADN cerrada, la suma de Tw y Wr , o el número de enlace, no cambia. Sin embargo, puede haber cambios complementarios en Tw y Wr sin cambiar su suma:
Tw , llamada "giro", es el número de giros de Watson-Crick en el cromosoma cuando no está restringido a permanecer en un plano. Ya hemos visto que el ADN nativo suele ser superhelicoidal. Si uno recorre el cromosoma superhelicoidalmente retorcido, contando los giros secundarios de Watson-Crick, ese número será diferente del número contado cuando el cromosoma está restringido a permanecer en un plano. En general, se espera que el número de giros secundarios en el cromosoma nativo, superretorcido, sea el número "normal" de enrollamiento de Watson-Crick, es decir, un único giro helicoidal de 10 pares de bases por cada 34 Å de longitud de ADN.
Wr , llamado "writhe", es el número de giros superhelicoidales. Dado que el ADN circular biológico suele estar subenrollado, Lk generalmente será menor que Tw , lo que significa que Wr normalmente será negativo.
Si el ADN está subenrollado, estará bajo tensión, exactamente como un resorte de metal se tensa cuando se lo desenrolla con fuerza, y la aparición de supergiros permitirá que el cromosoma alivie su tensión al adoptar supergiros negativos, que corrigen el subenrollamiento secundario de acuerdo con la ecuación topológica anterior.
La ecuación topológica muestra que existe una relación uno a uno entre los cambios en Tw y Wr . Por ejemplo, si se elimina un giro secundario "Watson-Crick", entonces debe haberse eliminado simultáneamente un supergiro dextrógiro (o, si el cromosoma está relajado, sin supergiros, entonces debe haberse agregado un supergiro dextrógiro).
El cambio en el número de enlace, Δ Lk , es el número real de vueltas en el plásmido/molécula, Lk , menos el número de vueltas en el plásmido/molécula relajado Lk o :
Si el ADN está superenrollado negativamente, . El superenrollamiento negativo implica que el ADN está subenrollado.
Una expresión estándar independiente del tamaño de la molécula es la "diferencia de enlace específica" o "densidad superhelicoidal", denotada σ , que representa el número de vueltas agregadas o eliminadas en relación con el número total de vueltas en la molécula/plásmido relajado, lo que indica el nivel de superenrollamiento.
La energía libre de Gibbs asociada con el enrollamiento se da mediante la siguiente ecuación [19]
La diferencia en la energía libre de Gibbs entre el ADN circular superenrollado y el ADN circular desenrollado con N > 2000 pb se aproxima mediante:
o, 16 cal/pb.
Dado que el número de enlace L del ADN superenrollado es el número de veces que las dos hebras están entrelazadas (y ambas hebras permanecen covalentemente intactas), L no puede cambiar. El estado de referencia (o parámetro) L 0 de un dúplex de ADN circular es su estado relajado. En este estado, su torsión W = 0. Dado que L = T + W , en un estado relajado T = L . Por lo tanto, si tenemos un dúplex de ADN circular relajado de 400 pb, L ~ 40 (asumiendo ~10 pb por vuelta en el ADN-B). Entonces T ~ 40 .
Las superenrollaciones negativas favorecen el desenrollado local del ADN, lo que permite procesos como la transcripción , la replicación del ADN y la recombinación . También se cree que la superenrollación negativa favorece la transición entre el ADN-B y el ADN-Z , y modera las interacciones de las proteínas de unión al ADN implicadas en la regulación genética . [20]
Se han propuesto algunos modelos estocásticos para tener en cuenta los efectos de la acumulación de superenrollamiento positivo (PSB) en la dinámica de la expresión génica (por ejemplo, en la expresión génica bacteriana), que difieren, por ejemplo, en el nivel de detalle. En general, el detalle aumenta cuando se añaden procesos afectados por el superenrollamiento y que lo afectan. A medida que se produce esta adición, aumenta la complejidad del modelo.
Por ejemplo, en [21] se proponen dos modelos de diferente complejidad. En el más detallado, los eventos se modelaron a nivel de nucleótido, mientras que en el otro los eventos se modelaron solo en la región promotora y, por lo tanto, se requirió tener en cuenta muchos menos eventos.
Ejemplos de modelos estocásticos que se centran en los efectos de PSB en la actividad de un promotor se pueden encontrar en:. [22] [23] En general, tales modelos incluyen un promotor, Pro, que es la región del ADN que controla la transcripción y, por lo tanto, cuya actividad/bloqueo se ve afectado por PSB. También se incluyen moléculas de ARN (el producto de la transcripción), ARN polimerasas (RNAP) que controlan la transcripción y girasas (G) que regulan PSB. Finalmente, debe haber un medio para cuantificar PSB en el ADN (es decir, el promotor) en un momento dado. Esto se puede hacer teniendo algún componente en el sistema que se produce con el tiempo (por ejemplo, durante los eventos de transcripción) para representar superenrollamientos positivos, y que se elimina por la acción de las girasas. La cantidad de este componente se puede establecer para afectar la tasa de transcripción.
Las propiedades topológicas del ADN circular son complejas. En los textos estándar, estas propiedades se explican invariablemente en términos de un modelo helicoidal para el ADN, pero en 2008 se observó que cada topoisómero, negativo o positivo, adopta una distribución única y sorprendentemente amplia de conformaciones tridimensionales. [4]
Cuando se determina el coeficiente de sedimentación, s , del ADN circular en un amplio rango de pH , se observan las siguientes curvas. Aquí se muestran tres curvas que representan tres especies de ADN. De arriba a abajo son: "Forma IV" (verde), "Forma I" (azul) y "Forma II" (roja).
La "Forma I" (curva azul) es la nomenclatura tradicional utilizada para la forma nativa del ADN circular dúplex, tal como se recupera de virus y plásmidos intracelulares. La Forma I está cerrada covalentemente y, por lo tanto, cualquier bobinado plectonémico que pueda estar presente queda bloqueado. Si se introducen una o más muescas en la Forma I, se hace posible la rotación libre de una hebra con respecto a la otra y se observa la Forma II (curva roja).
La Forma IV (curva verde) es el producto de la desnaturalización alcalina de la Forma I. Su estructura es desconocida, excepto que es persistentemente dúplex y extremadamente densa.
Entre pH 7 y pH 11,5, el coeficiente de sedimentación s , para la Forma I, es constante. Luego desciende y, a un pH justo por debajo de 12, alcanza un mínimo. Con nuevos aumentos del pH, s vuelve a su valor anterior. Sin embargo, no se detiene allí, sino que continúa aumentando implacablemente. A pH 13, el valor de s ha aumentado a casi 50, dos o tres veces su valor a pH 7, lo que indica una estructura extremadamente compacta.
Si se reduce el pH, el valor s no se restablece. En cambio, se ve la curva verde superior. El ADN, ahora en el estado conocido como Forma IV, sigue siendo extremadamente denso, incluso si el pH se restablece al rango fisiológico original. Como se dijo anteriormente, la estructura de la Forma IV es casi totalmente desconocida y no hay una explicación aceptada actualmente para su extraordinaria densidad. Todo lo que se sabe acerca de la estructura terciaria es que es dúplex, pero no tiene enlaces de hidrógeno entre bases.
Se considera que estos comportamientos de las Formas I y IV se deben a las propiedades peculiares del ADN dúplex que se ha cerrado covalentemente en un círculo de doble cadena. Si la integridad covalente se interrumpe incluso por una sola muesca en una de las cadenas, todo este comportamiento topológico cesa y se ve la curva inferior de la Forma II (Δ). Para la Forma II, las alteraciones en el pH tienen muy poco efecto en s . Sus propiedades físicas son, en general, idénticas a las del ADN lineal. A pH 13, las cadenas de la Forma II simplemente se separan, al igual que las cadenas de ADN lineal. Las cadenas simples separadas tienen valores de s ligeramente diferentes , pero no muestran cambios significativos en s con mayores aumentos en el pH.
Una explicación completa de estos datos queda fuera del alcance de este artículo. En resumen, las alteraciones en s se producen debido a cambios en la superhelicidad del ADN circular. Estos cambios en la superhelicidad se ilustran esquemáticamente mediante cuatro pequeños dibujos que se han superpuesto estratégicamente a la figura anterior.
En resumen, se cree que las alteraciones de s que se observan en la curva de titulación de pH anterior se deben a cambios en el enrollamiento superhelicoidal del ADN en condiciones de aumento del pH. Hasta un pH de 11,5, el supuesto "enrollamiento insuficiente" produce un supergiro dextrógiro ("negativo"). Pero a medida que aumenta el pH y la estructura helicoidal secundaria comienza a desnaturalizarse y desenrollarse, el cromosoma (si podemos hablar antropomórficamente) ya no "quiere" tener el enrollamiento completo de Watson-Crick, sino que "quiere", cada vez más, estar "enrollado insuficientemente". Como hay cada vez menos tensión que aliviar mediante el enrollamiento superhelicoidal, las superhélices desaparecen progresivamente a medida que aumenta el pH. A un pH justo por debajo de 12, todo incentivo para la superhelicidad ha expirado y el cromosoma aparecerá como un círculo relajado y abierto.
A un pH aún más alto, el cromosoma, que ahora se está desnaturalizando en serio, tiende a desenrollarse por completo, lo que no puede hacer (porque L k está unido covalentemente). En estas condiciones, lo que antes se consideraba un "enrollamiento insuficiente" se ha convertido en realidad en un "enrollamiento excesivo". Una vez más hay tensión, y una vez más se alivia (al menos en parte) por la superhelicidad, pero esta vez en la dirección opuesta ( es decir, levógira o "positiva"). Cada supergiro terciario levógiro elimina un único giro secundario Watson-Crick dextrógiro , ahora indeseable .
La titulación finaliza a pH 13, donde aparece la Forma IV.
