Un experimento de molécula única es un experimento que investiga las propiedades de moléculas individuales . Los estudios de moléculas individuales pueden contrastarse con las mediciones en un conjunto o una colección masiva de moléculas, donde no se puede distinguir el comportamiento individual de las moléculas y solo se pueden medir las características promedio . Dado que muchas técnicas de medición en biología, química y física no son lo suficientemente sensibles para observar moléculas individuales, las técnicas de fluorescencia de moléculas individuales (que han surgido desde la década de 1990 para investigar varios procesos a nivel de moléculas individuales) causaron mucho entusiasmo, ya que proporcionaron muchos detalles nuevos sobre los procesos medidos que no eran accesibles en el pasado. De hecho, desde la década de 1990, se han desarrollado muchas técnicas para investigar moléculas individuales. [2]
Los primeros experimentos con moléculas individuales fueron experimentos de fijación de parche realizados en la década de 1970, pero se limitaron al estudio de los canales iónicos . Hoy en día, los sistemas investigados mediante técnicas de moléculas individuales incluyen el movimiento de la miosina en filamentos de actina en el tejido muscular y los detalles espectroscópicos de entornos locales individuales en sólidos. Las conformaciones de polímeros biológicos se han medido utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). Mediante la espectroscopia de fuerza , las moléculas individuales (o pares de moléculas que interactúan), generalmente polímeros , se pueden estirar mecánicamente y su respuesta elástica se puede registrar en tiempo real.
En la fase gaseosa a presiones ultrabajas, los experimentos con moléculas individuales se han realizado durante décadas, pero en la fase condensada recién desde 1989 con el trabajo de WE Moerner y Lothar Kador. [3] Un año después, Michel Orrit y Jacky Bernard pudieron demostrar también la detección de la absorción de moléculas individuales por su fluorescencia. [4]
Muchas técnicas tienen la capacidad de observar una molécula a la vez, en particular la espectrometría de masas , donde se detectan iones individuales. Además, uno de los primeros medios para detectar moléculas individuales surgió en el campo de los canales iónicos con el desarrollo de la técnica de fijación de parches por parte de Erwin Neher y Bert Sakmann (quienes más tarde ganaron el premio Nobel por sus contribuciones fundamentales). Sin embargo, la idea de medir la conductancia para observar moléculas individuales impuso una seria limitación al tipo de sistemas que se podían observar.
La fluorescencia es un método conveniente para observar una molécula a la vez, debido principalmente a la sensibilidad de los detectores ópticos comerciales, capaces de contar fotones individuales. Sin embargo, espectroscópicamente, la observación de una molécula requiere que la molécula se encuentre en un entorno aislado y que emita fotones al ser excitada, lo que, gracias a la tecnología para detectar fotones individuales mediante el uso de tubos fotomultiplicadores (PMT) o fotodiodos de avalancha (APD), permite registrar eventos de emisión de fotones con gran sensibilidad y resolución temporal.
Más recientemente, la fluorescencia de moléculas individuales ha suscitado un intenso interés en el campo de la imagenología biológica, mediante el marcaje de biomoléculas como proteínas y nucleótidos para estudiar la función enzimática, que no se puede estudiar fácilmente a gran escala debido a los sutiles movimientos dependientes del tiempo en la catálisis y la reorganización estructural. La proteína más estudiada ha sido la clase de enzimas miosina/actina que se encuentran en los tejidos musculares. Mediante técnicas de moléculas individuales se ha observado y caracterizado el mecanismo de paso en muchas de estas proteínas.
En 1997, Katrin Kneipp , H. Kneipp, Y. Wang, LT Perelman y otros [5] demostraron la detección de moléculas individuales con espectroscopia Raman de superficie mejorada (SERS) en el MIT e independientemente por S. Nie y SR Emory en la Universidad de Indiana . [6] El equipo del MIT utilizó excitación Raman sin resonancia y mejora de la superficie con nanoclusters de plata para detectar moléculas individuales de violeta de cresilo , mientras que el equipo de la Universidad de Indiana utilizó excitación Raman de resonancia y mejora de la superficie con nanopartículas de plata para detectar moléculas individuales de rodamina 6G .
Los nanomanipuladores, como el microscopio de fuerza atómica, también son adecuados para experimentos de moléculas individuales de importancia biológica, ya que funcionan en la misma escala de longitud que la mayoría de los polímeros biológicos. Además, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es apropiada para los estudios de moléculas de polímeros sintéticos. AFM proporciona una posibilidad única de visualización en 3D de cadenas de polímeros. Por ejemplo, el modo de golpeteo AFM es lo suficientemente suave para el registro de moléculas de polielectrolitos adsorbidos (por ejemplo, cadenas de 0,4 nm de espesor de poli(2-vinilpiridina)) en un medio líquido. La ubicación de la superposición de dos cadenas corresponde en estos experimentos al doble del espesor de una cadena simple (0,8 nm en el caso del ejemplo mencionado). Con la aplicación de parámetros de escaneo adecuados, la conformación de dichas moléculas permanece inalterada durante horas, lo que permite la realización de experimentos en medios líquidos que tienen varias propiedades. [1] Además, al controlar la fuerza entre la punta y la muestra, se pueden obtener imágenes de alta resolución. [7] [8] También se han utilizado pinzas ópticas para estudiar y cuantificar las interacciones ADN-proteína. [7] [8]
La espectroscopia de fluorescencia de moléculas individuales utiliza la fluorescencia de una molécula para obtener información sobre su entorno, estructura y posición. La técnica permite obtener información que de otro modo no estaría disponible debido al promedio de conjunto (es decir, una señal obtenida al registrar muchas moléculas al mismo tiempo representa una propiedad promedio de la dinámica de las moléculas). Los resultados en muchos experimentos de moléculas individuales son trayectorias de dos estados .
Al igual que en el caso de la espectroscopia de fluorescencia de moléculas individuales, la técnica conocida como registro de canal único se puede utilizar para obtener información cinética específica (en este caso sobre la función del canal iónico) que no está disponible cuando se realiza un registro en conjunto, como el registro de células completas. [9] Específicamente, los canales iónicos alternan entre clases conductoras y no conductoras, que difieren en conformación. Por lo tanto, el estado funcional de los canales iónicos se puede medir directamente con electrónica suficientemente sensible, siempre que se tomen las precauciones adecuadas para minimizar el ruido. A su vez, cada una de estas clases se puede dividir en uno o más estados cinéticos con relación directa a la función subyacente del canal iónico. La realización de este tipo de estudios de moléculas individuales en condiciones que varían sistemáticamente (por ejemplo, concentración y estructura del agonista, ion permeable y/o bloqueador del canal, mutaciones en los aminoácidos del canal iónico), puede proporcionar información sobre la interconversión de varios estados cinéticos del canal iónico. [10] En un modelo mínimo para un canal iónico, hay dos estados : abierto y cerrado. Sin embargo, a menudo se necesitan otros estados para representar con precisión los datos, incluidos múltiples estados cerrados, así como estados inactivos y/o desensibilizados, que son estados no conductores que pueden ocurrir incluso en presencia de estímulos. [9]
Los fluoróforos individuales pueden unirse químicamente a biomoléculas, como proteínas o ADN, y la dinámica de las moléculas individuales puede rastrearse mediante el monitoreo de la sonda fluorescente. Se pueden rastrear los movimientos espaciales dentro del límite de Rayleigh , junto con los cambios en la intensidad de emisión y/o la vida útil radiactiva, que a menudo indican cambios en el entorno local. Por ejemplo, el etiquetado de moléculas individuales ha proporcionado una gran cantidad de información sobre cómo las proteínas motoras de kinesina se mueven a lo largo de las hebras de microtúbulos en las células musculares. La obtención de imágenes de moléculas individuales en células vivas revela información interesante sobre la dinámica de las proteínas en su entorno fisiológico. Se pueden cuantificar varios parámetros biofísicos sobre la dinámica de las proteínas, como el coeficiente de difusión, los desplazamientos cuadráticos medios, el tiempo de residencia, la fracción de moléculas unidas y no unidas y el mecanismo de búsqueda de objetivo de la unión de proteínas a su sitio objetivo en la célula viva. [11]
Artículo principal smFRET .
En la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de una sola molécula , la molécula se marca en (al menos) dos lugares. Se enfoca un haz de láser sobre la molécula que excita la primera sonda. Cuando esta sonda se relaja y emite un fotón, tiene la posibilidad de excitar la otra sonda. La eficiencia de la absorción del fotón emitido desde la primera sonda en la segunda sonda depende de la distancia entre estas sondas. Dado que la distancia cambia con el tiempo, este experimento investiga la dinámica interna de la molécula.
Cuando se observan datos relacionados con moléculas individuales, normalmente se pueden construir propagadores y funciones de densidad de probabilidad de tiempo de salto de primer orden, segundo orden, etc., mientras que a partir de experimentos en masa, normalmente se obtiene la descomposición de una función de correlación. [12] A partir de la información contenida en estas funciones únicas (obtenidas de moléculas individuales), se puede extraer una imagen relativamente clara de la forma en que se comporta el sistema; por ejemplo, su esquema cinético , o su potencial de actividad, o su forma de dimensiones reducidas . [13] [14] En particular, se pueden construir (muchas propiedades de) la vía de reacción de una enzima al monitorear la actividad de una enzima individual. [15] Además, varios autores han descrito aspectos significativos relacionados con el análisis de datos de moléculas individuales, como métodos de ajuste y pruebas para poblaciones homogéneas. [9] Por otra parte, existen varios problemas con el análisis de datos de moléculas individuales, incluida la construcción de un entorno de bajo ruido y puntas de pipeta aisladas, el filtrado de algunos de los componentes no deseados restantes (ruido) encontrados en las grabaciones y el tiempo requerido para el análisis de datos (preprocesamiento, detección de eventos inequívocos, trazado de datos, ajuste de esquemas cinéticos, etc.).
Las técnicas de moléculas individuales han tenido un impacto en la óptica, la electrónica, la biología y la química. En las ciencias biológicas, el estudio de las proteínas y otros mecanismos biológicos complejos se limitaba a experimentos conjuntos que hacían casi imposible la observación directa de su cinética. Por ejemplo, recién después de que se usara la microscopía de fluorescencia de moléculas individuales para estudiar pares de kinesina-miosina en el tejido muscular se comprendió la observación directa de los mecanismos de la marcha. Sin embargo, estos experimentos se han limitado en su mayor parte a estudios in vitro, ya que las técnicas útiles para la obtención de imágenes de células vivas aún no se han desarrollado por completo. Sin embargo, la promesa de la obtención de imágenes in vivo de moléculas individuales [16] trae consigo un enorme potencial para observar directamente biomoléculas en procesos nativos. Estas técnicas suelen estar destinadas a estudios que involucran proteínas de bajo número de copias, muchas de las cuales aún se están descubriendo. Estas técnicas también se han extendido a áreas de estudio de la química, incluido el mapeo de superficies heterogéneas [17] .