La prueba de sensibilidad a los antibióticos o prueba de susceptibilidad a los antibióticos es la medición de la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos . Se utiliza porque las bacterias pueden tener resistencia a algunos antibióticos. Los resultados de las pruebas de sensibilidad pueden permitir que un médico cambie la elección de antibióticos de una terapia empírica , que es cuando se selecciona un antibiótico en función de la sospecha clínica sobre el sitio de una infección y las bacterias causantes comunes, a una terapia dirigida , en la que la elección del antibiótico se basa en el conocimiento del organismo y sus sensibilidades. [1]
Las pruebas de sensibilidad suelen realizarse en un laboratorio médico y utilizan métodos de cultivo que exponen las bacterias a los antibióticos, o métodos genéticos que prueban si las bacterias tienen genes que confieren resistencia. Los métodos de cultivo a menudo implican la medición del diámetro de las áreas sin crecimiento bacteriano, llamadas zonas de inhibición, alrededor de discos de papel que contienen antibióticos en placas de cultivo de agar que han sido inoculadas uniformemente con bacterias. La concentración inhibitoria mínima , que es la concentración más baja del antibiótico que detiene el crecimiento de las bacterias, se puede estimar a partir del tamaño de la zona de inhibición.
Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos han sido necesarias desde el descubrimiento del antibiótico betalactámico penicilina . Los métodos iniciales eran fenotípicos e implicaban cultivo o dilución. El Etest , una tira impregnada con antibióticos, ha estado disponible desde la década de 1980, y los métodos genéticos como la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han estado disponibles desde principios de la década de 2000. Se están realizando investigaciones para mejorar los métodos actuales haciéndolos más rápidos o más precisos, así como para desarrollar nuevos métodos de prueba, como la microfluídica .
En medicina clínica, los antibióticos se prescriben con mayor frecuencia en función de los síntomas de una persona y las pautas médicas . Este método de selección de antibióticos se llama terapia empírica [1] y se basa en el conocimiento sobre qué bacterias causan una infección y a qué antibióticos las bacterias pueden ser sensibles o resistentes. [ 1] Por ejemplo, una infección simple del tracto urinario podría tratarse con trimetoprima/sulfametoxazol [2] Esto se debe a que Escherichia coli es la bacteria causante más probable y puede ser sensible a esa combinación de antibióticos [2] Sin embargo, las bacterias pueden ser resistentes a varias clases de antibióticos [2] Esta resistencia puede deberse a que un tipo de bacteria tiene resistencia intrínseca a algunos antibióticos [2] debido a la resistencia después de la exposición previa a antibióticos [2] o porque la resistencia puede transmitirse de otras fuentes como plásmidos [3] Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos brindan información sobre qué antibióticos tienen más probabilidades de tener éxito y, por lo tanto, deben usarse para tratar la infección [1]
En algunos países también se realizan pruebas de sensibilidad a los antibióticos a nivel de población como una forma de detección . [4] Esto sirve para evaluar las tasas de base de resistencia a los antibióticos (por ejemplo, con Staphylococcus aureus resistente a la meticilina ), y puede influir en las directrices y las medidas de salud pública . [4]
Una vez que se ha identificado una bacteria después del cultivo microbiológico , se seleccionan los antibióticos para las pruebas de susceptibilidad. [5] Los métodos de prueba de susceptibilidad se basan en la exposición de las bacterias a los antibióticos y la observación del efecto sobre el crecimiento de las bacterias (prueba fenotípica) o la identificación de marcadores genéticos específicos ( prueba genética ). [6] Los métodos utilizados pueden ser cualitativos, lo que significa que un resultado indica si hay o no resistencia; o cuantitativos, utilizando una concentración inhibitoria mínima (CIM) para describir la concentración de antibiótico a la que una bacteria es sensible. [6]
Existen muchos factores que pueden afectar los resultados de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos, entre ellos, fallas del instrumento, temperatura, humedad y potencia del agente antimicrobiano. Las pruebas de control de calidad (QC) ayudan a garantizar la precisión de los resultados de las pruebas. [7] Organizaciones como la American Type Culture Collection y la National Collection of Type Cultures proporcionan cepas de bacterias con fenotipos de resistencia conocidos que se pueden utilizar para el control de calidad. [8]
Las pruebas basadas en la exposición de bacterias a antibióticos utilizan placas de agar o dilución en agar o caldo. [9] La selección de antibióticos dependerá del organismo cultivado y de los antibióticos que estén disponibles localmente. [5] Para garantizar que los resultados sean precisos, la concentración de bacterias que se agrega al agar o al caldo (el inóculo) debe estandarizarse. Esto se logra comparando la turbidez de las bacterias suspendidas en solución salina o caldo con los estándares de McFarland , soluciones cuya turbidez es equivalente a la de una suspensión que contiene una concentración dada de bacterias. Una vez que se ha alcanzado una concentración apropiada (más comúnmente un estándar de McFarland de 0,5) [10] , que se puede determinar mediante inspección visual o fotometría , el inóculo se agrega al medio de crecimiento . [11] [10]
El método de difusión en disco implica seleccionar una cepa de bacterias, colocarla en una placa de agar y observar el crecimiento bacteriano cerca de discos impregnados con antibióticos. [12] Esto también se denomina método de Kirby-Bauer , [13] aunque también se utilizan métodos modificados. [14] En algunos casos, las muestras de orina o las muestras de hemocultivo positivas se aplican directamente al medio de prueba, evitando el paso preliminar de aislar el organismo. [15] Si el antibiótico inhibe el crecimiento microbiano, se ve un anillo transparente o zona de inhibición alrededor del disco. Las bacterias se clasifican como sensibles, intermedias o resistentes a un antibiótico comparando el diámetro de la zona de inhibición con umbrales definidos que se correlacionan con las CMI. [14] [16]
El agar Mueller-Hinton se utiliza con frecuencia en la prueba de difusión en disco. [14] El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) y el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) proporcionan estándares para el tipo y la profundidad del agar, la temperatura de incubación y el método de análisis de los resultados. [11] La difusión en disco se considera el método más barato y simple de los utilizados para probar la susceptibilidad, y se adapta fácilmente para probar antibióticos o formulaciones recientemente disponibles. [5] Algunas bacterias de crecimiento lento y fastidiosas no se pueden probar con precisión con este método, [5] mientras que otras, como las especies de Streptococcus y Haemophilus influenzae , se pueden probar pero requieren medios de crecimiento especializados y condiciones de incubación. [17]
Los métodos de gradiente, como Etest , utilizan una tira de plástico colocada sobre agar. [5] Se coloca una tira de plástico impregnada con diferentes concentraciones de antibióticos sobre un medio de crecimiento y se observa el medio de crecimiento después de un período de incubación. [5] La concentración inhibitoria mínima se puede identificar en función de la intersección de la zona de inhibición en forma de lágrima con la marca en la tira. [5] Se pueden utilizar múltiples tiras para diferentes antibióticos. [5] Este tipo de prueba se considera una prueba de difusión. [18]
En los métodos de dilución en agar y caldo, las bacterias se colocan en múltiples tubos pequeños con diferentes concentraciones de antibióticos. [14] Si una bacteria es sensible o no se determina mediante inspección visual o métodos ópticos automáticos, después de un período de incubación. [5] La dilución en caldo se considera el estándar de oro para las pruebas fenotípicas. [14] La concentración más baja de antibióticos que inhibe el crecimiento se considera la CMI. [5]
Existen sistemas automatizados que replican los procesos manuales, por ejemplo, mediante el uso de imágenes y análisis de software para informar la zona de inhibición en las pruebas de difusión, o dispensando muestras y determinando los resultados en pruebas de dilución. [14] Los instrumentos automatizados, como los sistemas VITEK 2, BD Phoenix y Microscan, son la metodología más común para AST. Las especificaciones de cada instrumento varían, pero el principio básico implica la introducción de una suspensión bacteriana en paneles preformulados de antibióticos. Los paneles se incuban y la inhibición del crecimiento bacteriano por el antibiótico se mide automáticamente utilizando metodologías como la turbidimetría , la espectrofotometría o la detección de fluorescencia . [19] Un sistema experto correlaciona las MIC con los resultados de susceptibilidad, [20] y los resultados se transmiten automáticamente al sistema de información del laboratorio para su validación y presentación de informes. Si bien estas pruebas automatizadas requieren menos mano de obra y están más estandarizadas que las pruebas manuales, su precisión puede ser comparativamente pobre para ciertos organismos y antibióticos, [21] por lo que la prueba de difusión en disco sigue siendo útil como método de respaldo. [22]
Las pruebas genéticas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la micromatriz de ADN y la amplificación isotérmica mediada por bucle , se pueden utilizar para detectar si las bacterias poseen genes que confieren resistencia a los antibióticos. [9] [23] Un ejemplo es el uso de PCR para detectar el gen mecA para Staphylococcus aureus resistente a betalactámicos . [9] Otros ejemplos incluyen ensayos para probar los genes de resistencia a la vancomicina vanA y vanB en especies de Enterococcus , y la resistencia a los antibióticos en Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli . [9] Estas pruebas tienen la ventaja de ser directas y rápidas, en comparación con los métodos observables, [9] y tienen una alta probabilidad de detectar un hallazgo cuando hay uno para detectar. [24] Sin embargo, si se detectan genes de resistencia no siempre coincide con el perfil de resistencia observado con el método fenotípico. [9] Las pruebas también son caras y requieren personal específicamente capacitado. [25]
La reacción en cadena de la polimerasa es un método para identificar genes relacionados con la susceptibilidad a los antibióticos. [26] En el proceso de PCR, el ADN de una bacteria se desnaturaliza y las dos hebras de la doble hélice se separan. Los cebadores específicos de un gen buscado se agregan a una solución que contiene el ADN, y se agrega una ADN polimerasa junto con una mezcla que contiene moléculas que serán necesarias (por ejemplo, nucleótidos e iones ). [25] Si el gen relevante está presente, cada vez que se ejecuta este proceso, la cantidad del gen objetivo se duplicará. [25] Después de este proceso, la presencia de los genes se demuestra a través de una variedad de métodos que incluyen electroforesis , transferencia Southern y otros métodos de análisis de secuenciación de ADN . [25]
Los microarrays y chips de ADN utilizan la unión de ADN complementario a un gen objetivo o una secuencia de ácido nucleico. [9] La ventaja de esto es que se pueden evaluar múltiples genes simultáneamente. [9]
En un estudio publicado en septiembre de 2024, mediante el uso de nanopartículas magnéticas con un péptido beta-2-glicoproteína I que imita una proteína plasmática, se podrían recuperar patógenos microbianos de manera selectiva de muestras de hemocultivos en cuestión de horas. Se utilizan imanes para extraer el complejo péptido-bacteria, seguido de pruebas genéticas. [27]
La espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) es otro método de prueba de susceptibilidad. [6] Esta es una forma de espectrometría de masas de tiempo de vuelo , en la que las moléculas de una bacteria se someten a una desorción láser asistida por matriz . [26] Luego, las partículas ionizadas se aceleran y se registran los picos espectrales, lo que produce un perfil de expresión, que es capaz de diferenciar cepas bacterianas específicas después de compararlas con perfiles conocidos. [26] Esto incluye, en el contexto de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos, cepas como E. coli productora de beta-lactamasa . [9] MALDI-TOF es rápido y automatizado. [9] Sin embargo, existen limitaciones para las pruebas en este formato; los resultados pueden no coincidir con los resultados de las pruebas fenotípicas, [9] y la adquisición y el mantenimiento son costosos. [25]
Las bacterias se marcan como sensibles, resistentes o con resistencia intermedia a un antibiótico según la concentración inhibitoria mínima (CIM), que es la concentración más baja del antibiótico que detiene el crecimiento de las bacterias. La CIM se compara con los valores umbral estándar (llamados "puntos de corte") para una bacteria y un antibiótico determinados. [28] Los puntos de corte para el mismo organismo y antibiótico pueden diferir según el sitio de la infección: [29] por ejemplo, el CLSI generalmente define a Streptococcus pneumoniae como sensible a la penicilina intravenosa si las CIM son ≤0,06 μg/ml, intermedio si las CIM son de 0,12 a 1 μg/ml y resistente si las CIM son ≥2 μg/ml, pero para los casos de meningitis , los puntos de corte son considerablemente más bajos. [30] A veces, si un antibiótico se marca como resistente también se basa en características bacterianas que están asociadas con métodos conocidos de resistencia, como el potencial de producción de betalactamasa . [28] [20] Se pueden observar patrones específicos de resistencia a fármacos o resistencia a múltiples fármacos , como la presencia de una beta lactamasa de espectro extendido . [28] Dicha información puede ser útil para el médico, que puede cambiar el tratamiento empírico a un tratamiento personalizado que se dirija solo a la bacteria causante. [1] [9] Los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos realizadas durante un período de tiempo determinado se pueden compilar, generalmente en forma de tabla, para formar un antibiograma. [31] [32] Los antibiogramas ayudan al médico a seleccionar la mejor terapia antimicrobiana empírica en función de los patrones de resistencia local hasta que estén disponibles los resultados de las pruebas de laboratorio. [32]
La terapia antibiótica ideal se basa en la determinación del agente causal y su sensibilidad a los antibióticos. El tratamiento empírico suele iniciarse antes de que estén disponibles los informes microbiológicos de laboratorio. Esto puede ser para infecciones comunes o relativamente menores según las pautas clínicas (como la neumonía adquirida en la comunidad ), o para infecciones graves, como la sepsis o la meningitis bacteriana , en las que el tratamiento tardío conlleva riesgos sustanciales. [1] La eficacia de los antibióticos individuales varía con el sitio anatómico de la infección, la capacidad del antibiótico para llegar al sitio de la infección y la capacidad de las bacterias para resistir o inactivar el antibiótico. [34]
Las muestras para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos se recogen idealmente antes de iniciar el tratamiento. [1] Se puede tomar una muestra del sitio de una infección sospechada; como una muestra de cultivo de sangre cuando se sospecha que hay bacterias presentes en el torrente sanguíneo ( bacteriemia ), una muestra de esputo en el caso de una neumonía o una muestra de orina en el caso de una infección del tracto urinario . A veces se pueden tomar múltiples muestras si la fuente de una infección no está clara. [1] Estas muestras se transfieren al laboratorio de microbiología donde se agregan a medios de cultivo , en o sobre los cuales crecen las bacterias hasta que estén presentes en cantidades suficientes para que se realicen la identificación y las pruebas de sensibilidad. [35] [28]
Cuando se completa la prueba de sensibilidad a los antibióticos, se informará sobre los organismos presentes en la muestra y a qué antibióticos son susceptibles. [28] Aunque la prueba de sensibilidad a los antibióticos se realiza en un laboratorio ( in vitro ), la información proporcionada sobre esto a menudo es clínicamente relevante para los antibióticos en una persona ( in vivo ). [36] A veces, se debe tomar una decisión sobre si algunas bacterias son la causa de una infección o simplemente bacterias comensales o contaminantes, [28] como Staphylococcus epidermidis [37] y otras infecciones oportunistas . Otras consideraciones pueden influir en la elección de los antibióticos, incluida la necesidad de penetrar en un sitio infectado (como un absceso ) o la sospecha de que una o más causas de una infección no se detectaron en una muestra. [1]
Desde el descubrimiento del antibiótico betalactámico penicilina , las tasas de resistencia a los antimicrobianos han aumentado. [38] Con el tiempo, los métodos para probar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos se han desarrollado y cambiado. [25]
En la década de 1920, Alexander Fleming desarrolló el primer método de prueba de susceptibilidad. El "método de canal" que desarrolló era un método de difusión, que implicaba la difusión de un antibiótico a través de un canal hecho de agar. [25] En la década de 1940, varios investigadores, incluidos Pope, Foster y Woodruff, Vincent y Vincent, utilizaron discos de papel en su lugar. [25] Todos estos métodos implican únicamente la prueba de susceptibilidad a la penicilina. [25] Los resultados eran difíciles de interpretar y no eran confiables, debido a que los resultados eran imprecisos y no estaban estandarizados entre laboratorios. [25]
La dilución se ha utilizado como método para cultivar e identificar bacterias desde la década de 1870, y como método para probar la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos desde 1929, también por Alexander Fleming. [25] La forma de determinar la susceptibilidad cambió de cuán turbia era la solución, al pH (en 1942), a los instrumentos ópticos. [25] El uso de pruebas de "macrodilución" basadas en tubos más grandes ha sido reemplazado por kits de "microdilución" más pequeños. [5]
En 1966, la Organización Mundial de la Salud confirmó el método Kirby-Bauer como el método estándar para las pruebas de susceptibilidad; es simple, rentable y puede probar múltiples antibióticos. [25]
El Etest fue desarrollado en 1980 por Bolmström y Eriksson, y el MALDI-TOF se desarrolló en la década de 2000. [25] Desde entonces y en el transcurso de esa década, se ha desarrollado una serie de sistemas automatizados. [25] La PCR fue la primera prueba genética disponible y se publicó por primera vez como método para detectar la susceptibilidad a los antibióticos en 2001. [25]
Se están desarrollando pruebas en el punto de atención para acelerar el tiempo de las pruebas y ayudar a los médicos a evitar recetar antibióticos innecesarios al estilo de la medicina de precisión . [39] Las técnicas tradicionales suelen tardar entre 12 y 48 horas, [6] aunque pueden tardar hasta cinco días. [28] En cambio, las pruebas rápidas que utilizan diagnósticos moleculares se definen como "factibles en un turno de trabajo de 8 horas". [6] El progreso ha sido lento debido a una serie de razones, entre ellas el coste y la regulación. [40]
Las investigaciones adicionales se centran en las deficiencias de los métodos de prueba actuales. Además del tiempo que lleva informar sobre los métodos fenotípicos, son laboriosos, tienen una portabilidad difícil y son difíciles de usar en entornos con recursos limitados, y existe la posibilidad de contaminación cruzada. [25]
A partir de 2017, los diagnósticos de resistencia en el punto de atención estaban disponibles para Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), Mycobacterium tuberculosis (TB) resistente a la rifampicina y enterococos resistentes a la vancomicina (VRE) a través de GeneXpert de la empresa de diagnóstico molecular Cepheid . [41]
Se está explorando la PCR cuantitativa, con el objetivo de determinar el porcentaje de una bacteria detectada que posee un gen de resistencia. [9] También se está explorando la secuenciación del genoma completo de bacterias aisladas, y es probable que esté más disponible a medida que los costos disminuyan y la velocidad aumente con el tiempo. [9]
Los métodos adicionales explorados incluyen la microfluídica , que utiliza una pequeña cantidad de líquido y una variedad de métodos de prueba, como ópticos, electroquímicos y magnéticos. [9] Estos ensayos no requieren mucho líquido para ser probados, son rápidos y portátiles. [9]
Se ha explorado el uso de colorantes fluorescentes. [9] Estos implican proteínas marcadas dirigidas a biomarcadores , secuencias de ácidos nucleicos presentes dentro de las células que se encuentran cuando la bacteria es resistente a un antibiótico. [9] Un aislado de bacterias se fija en posición y luego se disuelve. Luego, el aislado se expone a un colorante fluorescente, que será luminiscente al observarlo. [9]
También se están explorando mejoras en las plataformas existentes, incluidas mejoras en los sistemas de imágenes que pueden identificar más rápidamente la MIC en muestras fenotípicas; o el uso de enzimas bioluminiscentes que revelan el crecimiento bacteriano para hacer que los cambios sean más fácilmente visibles. [25]
Una vez que los resultados de microbiología han ayudado a identificar el patógeno etiológico y/o se dispone de datos de susceptibilidad a los antimicrobianos, se debe hacer todo lo posible para limitar el espectro de antibióticos. Este es un componente de importancia crítica de la terapia con antibióticos porque puede reducir el costo y la toxicidad y prevenir la aparición de resistencia a los antimicrobianos en la comunidad.
Los métodos más comunes utilizados son el método de prueba de susceptibilidad por difusión en disco (también conocido como Kirby-Bauer)
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