La toxina del ántrax es una exotoxina de tres proteínas secretada por cepas virulentas de la bacteria Bacillus anthracis , el agente causante del ántrax . La toxina fue descubierta por primera vez por Harry Smith en 1954. [1] La toxina del ántrax está compuesta de una proteína de unión celular, conocida como antígeno protector (PA), y dos componentes enzimáticos, llamados factor de edema (EF) y factor letal (LF). . Estos tres componentes proteicos actúan juntos para impartir sus efectos fisiológicos. Los complejos ensamblados que contienen los componentes de la toxina se endocitan . En el endosoma , los componentes enzimáticos de la toxina se trasladan al citoplasma de una célula diana. Una vez en el citosol, los componentes enzimáticos de la toxina alteran diversas funciones de las células inmunitarias, a saber, la señalización celular y la migración celular. La toxina puede incluso inducir la lisis celular, como se observa en las células de macrófagos . La toxina del ántrax permite que las bacterias evadan el sistema inmunológico , proliferen y, en última instancia, maten al animal huésped. [2] La investigación sobre la toxina del ántrax también proporciona información sobre la generación de conjuntos macromoleculares y sobre la translocación de proteínas , la formación de poros, la endocitosis y otros procesos bioquímicos .
El ántrax es una enfermedad causada por Bacillus anthracis , una bacteria Gram positiva , formadora de esporas y con forma de bastón (Fig. 1). La letalidad de la enfermedad es causada por los dos principales factores de virulencia de la bacteria: (i) la cápsula de ácido poliglutámico , que es antifagocítica , y (ii) la toxina proteica tripartita, llamada toxina del ántrax. La toxina del ántrax es una mezcla de tres componentes proteicos : (i) antígeno protector (PA), (ii) factor de edema (EF) y (iii) factor letal (LF).
La toxina del ántrax es una toxina AB . Cada proteína individual de la toxina del ántrax no es tóxica. No se observan síntomas tóxicos cuando estas proteínas se inyectan individualmente en animales de laboratorio. La coinyección de PA y EF provoca edema , y la coinyección de PA y LF es letal. La primera combinación se llama toxina del edema y la última combinación se llama toxina letal. Por tanto, la manifestación de síntomas fisiológicos requiere PA, en cualquier caso.
El requisito de PA observado en experimentos con modelos animales demuestra un paradigma común para las toxinas bacterianas, llamado paradigma A / B . El componente A es enzimáticamente activo y el componente B es el componente de unión celular. La toxina del ántrax tiene la forma A 2 B , donde las dos enzimas , EF y LF, son los componentes A y PA es el componente B. La PA es necesaria para que los componentes enzimáticos ingresen a la célula. Lo hace mediante la formación de poros que atraviesan la membrana celular, permitiendo la entrada de la toxina, aunque el mecanismo no se comprende completamente. [3] Una vez en el citosol, pueden catalizar reacciones que alteran la fisiología celular normal.
Los componentes proteicos de la toxina del ántrax deben ensamblarse en complejos de holotoxina para funcionar. Para que LF y EF funcionen dentro de una célula diana, deben localizarse en la célula y entrar en su citoplasma. A través de una serie de pasos, PA puede translocar EF y LF al interior de la célula (Fig. 2). Este proceso comienza cuando la forma de PA de 83 kDa, llamada PA83, se une a un receptor de la toxina del ántrax. Hay dos receptores homólogos conocidos, que se unen a PA83, llamados marcador de endotelio tumoral 8 ( TEM8 ) y proteína 2 de morfogénesis capilar ( CMG2 ). [4] Luego, las endoproteasas de membrana de la familia de las furinas escinden un fragmento de 20 kDa (PA20) del extremo amino de PA83. Cuando PA20 se disocia, la porción restante de PA unida al receptor, llamada PA63, puede ensamblarse en un oligómero en forma de anillo heptamérico [5] u octamérico [6] . Este oligómero en forma de anillo a menudo se denomina forma de PA preporo (o precanal), ya que más adelante en la ruta se convertirá en un poro (o canal) de translocasa. La superficie del oligómero preporo, que quedó expuesta tras la liberación del resto PA20, puede unirse entonces a LF y EF. [7] Las formas heptamérica y octamérica del oligómero PA pueden unirse con hasta tres o cuatro moléculas de EF y/o LF, respectivamente. [6] [8] Luego, la célula endocita estos complejos ensamblados y los transporta a un compartimento ácido en la célula. El bajo pH encontrado en el endosoma hace que el precanal PA63 se convierta en un canal selectivo de cationes. EF y LF son impulsados a través del canal por un gradiente de pH, lo que permite que los factores enzimáticos ingresen al citosol . [9]
Una vez en el citosol, EF y LF llevan a cabo sus respectivos procesos inductores de daño. [10]
Por lo tanto, el efecto sinérgico de estas tres proteínas conduce a la muerte celular a través de una cascada de eventos que permiten que las proteínas ingresen a la célula y alteren la función celular.
El mecanismo de acción de la toxina del ántrax es el resultado de las estructuras moleculares de las tres proteínas de la toxina en combinación con biomoléculas de la célula huésped. Las interacciones moleculares son evidentes al realizar un análisis detallado de las estructuras de PA, EF, LF y los receptores celulares ( ANTXR1 y ANTXR2 ). Las estructuras de las moléculas de la toxina (figs. 3 a 5), el receptor y los complejos de las moléculas proporcionaron información sobre las acciones sinérgicas de estas proteínas. Los análisis de los sitios de unión y los cambios conformacionales aumentaron los estudios estructurales, aclarando las funciones de cada dominio de PA, LF y EF, como se describe brevemente en la Tabla 1.
La estructura de la AP fue la primera en determinarse (Fig. 3). [11] Esta estructura y la de su receptor celular arrojan mucha luz sobre la especificidad del reconocimiento y la unión. [12] Esta especificidad de la PA y el receptor CMG2 (similar a las integrinas tipo I) se debe a interacciones a través de un sitio de adhesión dependiente de iones metálicos (MIDAS), un surco hidrófobo y una proyección en horquilla β. Todo esto contribuye a una estrecha interacción en la que gran parte de la superficie proteica de CMG2 (y TEM8) está enterrada. [13]
Petosa et al. resolvió la estructura de un heptámero PA63 a 4,5 Å (0,45 nm). [11] La estructura que resolvieron era la de un preporo no unido a membrana, la conformación del heptámero antes de que el complejo extienda un barril β a través de la membrana plasmática para transportar LF y EF al citosol.
La heptamerización y la formación de poros se ven impedidas estéricamente por el fragmento PA20, pero cuando se retira de la parte superior del monómero, el preporo se forma rápidamente. La formación de heptámeros no provoca cambios importantes en la conformación de cada monómero individual, pero al unirse, quedan enterrados más de 15400 Ų (154 nm 2 ) de superficie proteica. Esta superficie enterrada consta principalmente de grupos laterales polares o cargados de los dominios 1 y 2. [11]
PA también forma una estructura precanal octamérica. [6] Se demostró que la forma octamérica es más termoestable que la forma heptamérica y, por lo tanto, el oligómero octamérico puede persistir en el plasma del huésped durante una infección por ántrax. [6]
Durante la oligomerización de PA63, las moléculas de EF y/o LF se unen rápida y simultáneamente al precanal de PA. Esta unión se produce porque después de eliminar el dominio PA20, se descubre una gran superficie hidrofóbica en el dominio 1 de PA63. El dominio 1 proporciona una gran superficie que interactúa con el extremo N de EF y LF, [14] que es casi completamente homólogo para los primeros ~36 residuos y similar en estructura terciaria para los primeros ~250 residuos. [15] Los estudios sobre la región de unión de LF y EF demostraron que una gran superficie contacta con el dominio 1 de dos moléculas de PA63 adyacentes cuando están en la conformación de heptámero. [16] Esta gran área de unión explica por qué estudios anteriores solo pudieron unir hasta tres moléculas en un heptámero PA63. La estructura cocristalina del octámero de PA en complejo con LF N-terminal reveló que la interacción de unión es, de hecho, dos sitios discontinuos. [14] Un sitio, denominado subsitio C-terminal, se asemeja a un "punto caliente" clásico con puentes salinos e interacciones electrostáticas previstas. El otro sitio, denominado subsitio de abrazadera alfa, es una hendidura profunda que une de manera no específica la hélice alfa N-terminal y la hebra beta corta de LF, guiando el extremo N del sustrato hacia la luz del precanal PA. De esta manera, la abrazadera alfa ayuda en la translocación de proteínas, uniéndose de manera no específica y posteriormente desplegando la estructura secundaria a medida que se despliega desde el sustrato. [17] El sitio de unión LF/EF ahora se utiliza para la administración de terapias a través de proteínas de fusión.
Tras la formación del preporo y la unión de LF y/o EF, el heptámero migra a una balsa lipídica donde se endocitosa rápidamente. La endocitosis ocurre como resultado de una serie de eventos. Esto comienza cuando se palmitoila CMG2 o TEM8, lo que inhibe la asociación del receptor con las balsas lipídicas. Esto inhibe la endocitosis del receptor antes de que se escinda PA83 y antes de que LF o EF puedan asociarse con el heptámero. La reasociación del receptor con los microdominios ricos en colesterol y glicosfigolípidos ( balsas lipídicas ) se produce cuando PA63 se une al receptor y se heptameriza. Una vez que el receptor y la PA regresan a la balsa lipídica, la ubiquitina ligasa Cb1 E3 ubiquitina la cola citoplasmática del receptor, indicando al receptor y a las proteínas toxinas asociadas la endocitosis. Se requieren dinamina y Eps15 para que se produzca esta endocitosis, lo que indica que la toxina del ántrax ingresa a la célula a través de la vía dependiente de clatrina . [18]
Como se analizó, cada molécula interactúa con varias otras para inducir la endocitosis de la toxina del ántrax. Una vez dentro, el complejo se transfiere a un compartimento ácido, donde el heptámero, todavía en la conformación previa al poro que no atraviesa la membrana, se prepara para la translocación de EF y LF al citosol. [19]
A primera vista, la secuencia primaria de la PA no se parece a la de una proteína que atraviesa la membrana. Un gráfico de hidrofobicidad carece de patrones que sean comunes a posibles dominios que atraviesan la membrana. Las estructuras de otras proteínas de membrana multiméricas (como la toxina diftérica ) proporcionan la respuesta a cómo la PA logra atravesar la membrana. Se cree que la PA actúa como estas proteínas de membrana multiméricas que forman barriles β hechos de tramos de aminoácidos polares y no polares de cada monómero. [11]
La formación del poro del barril β se facilita con una caída del pH. Para formar el barril cuando el pH baja, el dominio 2 de PA63 debe sufrir el mayor cambio de conformación. Al examinar la estructura del dominio 2 (Fig. 7), se puede ver que este dominio contiene un motivo en clave griega (la porción dorada en la Fig. 7). En la Fig. 8 se muestra un esquema general de un motivo en clave griega. Adjunto a la clave griega en el dominio 2 hay un gran bucle desordenado. La necesidad de este bucle en la formación de poros se demuestra mediante el uso de mutagénesis y proteólisis del bucle con quimotripsina. Mediciones electrofisiológicas adicionales de sustituciones de cisteína colocan los aminoácidos de este bucle dentro de la luz del poro insertado en la membrana. El bucle desordenado en el dominio 2 también tiene un patrón de aminoácidos hidrófobos e hidrófilos alternos, que es un patrón conservado en las porciones de las porinas que atraviesan la membrana. El único problema es que el bucle no es lo suficientemente grande como para atravesar una membrana en un barril β. Esta inserción de membrana solo podría ocurrir con cambios conformacionales adicionales. Se produce un gran cambio conformacional donde se despliega el motivo en clave griega, formando una horquilla β que se proyecta hacia abajo en la membrana y forma un barril β con los otros 6 monómeros del complejo (figuras 9a y 9b). El poro final tiene un diámetro de 12 Å (1,2 nm), lo que se ajusta al valor teórico de este modelo. [11]
Este modelo requeriría grandes cambios conformacionales en el dominio 2 junto con la ruptura de muchos enlaces de hidrógeno a medida que el motivo de clave griega se desprende del centro del dominio. Petosa et al. propuso un modelo de cómo ocurre esto. [11] La inserción de los motivos de la clave griega PA en la membrana se produce cuando se acidifica el heptámero. En las bicapas artificiales, esto ocurre cuando el pH desciende de 7,4 a 6,5, lo que sugiere que el desencadenante de la inserción implica una titulación de histidinas. De hecho, esto se ajusta a la secuencia de PA, ya que el dominio 2 contiene varias histidinas (que se muestran como asteriscos en la figura 9a). En el bucle desordenado se encuentran tres residuos de histidina, uno de los cuales se encuentra con una histidina de clave griega dentro de un grupo de aminoácidos polares. Este grupo (que incluye las dos histidinas, tres argininas y un glutamato) está incrustado en la parte superior del motivo en clave griega, por lo que es fácil ver que la protonación de estas histidinas alteraría el grupo. Además, otra histidina se encuentra en la base del motivo en clave griega junto con varios residuos hidrofóbicos (en el segmento verde en las figuras 7 y 9a). A pH 7,4 este segmento está ordenado, pero cuando los cristales crecen a pH 6,0, se desordena. Esta transición de orden a desorden es el paso inicial de la inserción de la membrana de PA.
La PA se endocita como un heptámero soluble unido a sus receptores, con LF o EF unidos al heptámero como carga. El primer paso después de la endocitosis es la acidificación de la vesícula endocitosa. La acidificación juega dos papeles en la vida útil de la toxina. En primer lugar, ayuda a relajar el fuerte control del receptor CMG2 o TEM8 sobre la PA, facilitando la formación de poros (los diferentes receptores permiten la inserción a un pH ligeramente diferente). [13] En segundo lugar, la caída del pH provoca que un bucle desordenado y un motivo en clave griega en el dominio PA 2 se doblen fuera del preporo del heptámero y se inserten a través de la pared de la vesícula ácida, lo que lleva a la formación de poros (Figuras 7). –9).
Santelli et al. Explicaron más sobre el proceso después de determinar la estructura cristalina del complejo PA/CMG2. [13] La estructura de este complejo muestra la unión de CMG2 tanto por el dominio 2 como por el 4 de PA. Esta interacción demuestra menos libertad para desplegar la clave griega. Un análisis más detallado muestra que siete de las nueve histidinas en PA están en la interfaz dominio 2/dominio 4. La protonación de estas histidinas hace que los dominios se separen lo suficiente como para permitir que la clave griega salga y ayude a formar la horquilla β involucrada en la inserción. Además, cuando la PA se une a CMG2, la inserción ya no se produce a un pH de 6,5, como ocurre cuando se inserta en una membrana artificial. En cambio, requiere un pH de 5,0 para su inserción en las células naturales. Se explicó que esta diferencia era el resultado del bolsillo al lado del motivo MIDAS en CMG2. Este bolsillo contiene una histidina enterrada en la parte inferior donde se une el dominio 2. Esta histidina se protona a un pH más bajo y agrega mayor estabilidad a la PA. Esta estabilidad adicional evita que la llave griega pueda moverse hasta que se cumplan condiciones más ácidas. Todas estas histidinas trabajan en conjunto para evitar que el heptámero se inserte prematuramente antes de que ocurra la endocitosis.
Santelli y sus colegas (Fig. 10) también construyeron una estructura hipotética de la estructura PA/CMG2 insertada en la membrana. Este modelo muestra que el barril β tiene aproximadamente 70 Å (7 nm) de largo, 30 Å (3 nm) de los cuales atraviesan la membrana y el espacio de 40 Å (4 nm) en realidad se llena con el resto de la porción extracelular de el receptor CMG2 (~100 residuos). CMG2 proporciona soporte adicional al poro.
Varios estudios recientes demuestran cómo el poro PA63 permite que EF y LF entren al citoplasma cuando su luz es tan pequeña. La luz del poro PA63 tiene sólo 15 Å (1,5 nm) de ancho, que es mucho más pequeña que el diámetro de LF o EF. La translocación ocurre a través de una serie de eventos que comienzan en el endosoma a medida que se acidifica. LF y EF son sensibles al pH y, a medida que éste desciende, sus estructuras pierden estabilidad. Por debajo de un pH de 6,0 (el pH en un endosoma), tanto LF como EF se convierten en glóbulos fundidos desordenados . Cuando una molécula está en esta conformación, el extremo N se libera y se introduce en el poro mediante el gradiente de protones y el potencial transmembrana positivo. Un anillo de siete fenilalaninas en el lado del poro del endosoma de la boca (pinza de fenilalanina) ayuda en el despliegue de LF o EF al interactuar con los residuos hidrofóbicos que se encuentran en LF o EF. Luego, el gradiente de protones comienza a unir la proteína a través del poro. El mecanismo de cordones es impulsado por el gradiente, pero requiere la abrazadera de fenilalanina para un movimiento de trinquete. Los primeros 250 residuos de EF y LF tienen una secuencia alterna irregular de residuos básicos, ácidos e hidrófobos. La interacción entre la pinza de fenilalanina y el estado de protonación provoca un efecto de trinquete que impulsa la proteína hasta que una cantidad suficiente ha cruzado hacia el citoplasma para arrastrar el resto a través del poro a medida que el extremo N se repliega. [20]