La uracilo-ADN glicosilasa (también conocida como UNG o UDG ) es una enzima cuya función más importante es prevenir la mutagénesis eliminando el uracilo de las moléculas de ADN mediante la ruptura del enlace N-glucosídico e iniciando la vía de reparación por escisión de bases (BER).
El gen humano codifica una de varias uracilo-ADN glicosilasas. El uso alternativo del promotor y el empalme de este gen conduce a dos isoformas diferentes: la UNG1 mitocondrial y la UNG2 nuclear. [5] Una función importante de las uracilo-ADN glicosilasas es prevenir la mutagénesis eliminando el uracilo de las moléculas de ADN mediante la escisión del enlace N-glicosídico e iniciando la vía de reparación por escisión de bases (BER). Las bases de uracilo se producen a partir de la desaminación de la citosina o la incorporación incorrecta de residuos dUMP . Después de que se produce una mutación, la amenaza mutagénica del uracilo se propaga a través de cualquier paso posterior de replicación del ADN . [6] Una vez descomprimidos, los pares de guanina y uracilo no coincidentes se separan, y la ADN polimerasa inserta bases complementarias para formar un par guanina-citosina (GC) en una cadena hija y un par adenina -uracilo (AU) en la otra. [7] La mitad de todo el ADN de la progenie derivado de la plantilla mutada hereda un cambio de GC a AU en el sitio de la mutación. [7] UDG escinde el uracilo en pares AU y GU para evitar la propagación del desajuste de bases a los procesos de transcripción y traducción posteriores . [7] Con alta eficiencia y especificidad, esta glicosilasa repara entre 100 y 500 bases dañadas diariamente en la célula humana. [8] Las células humanas expresan de cinco a seis tipos de ADN glicosilasas , todas las cuales comparten un mecanismo común de eversión y escisión de bases como medio de reparación del ADN. [9]
La UDG está formada por una lámina β paralela de cuatro cadenas rodeada por ocho hélices α . [10] El sitio activo comprende cinco motivos altamente conservados que catalizan colectivamente la escisión del enlace glucosídico : [11] [12]
La escisión del enlace glucosídico sigue un mecanismo de “pellizco-empuje-tracción” que utiliza los cinco motivos conservados. [10]
Pinch : UDG escanea el ADN en busca de uracilo mediante la unión no específica a la cadena y la creación de un pliegue en la estructura principal, posicionando así la base seleccionada para la detección. Los bucles Pro-rich y Gly-Ser forman contactos polares con los fosfatos 3' y 5' que flanquean la base examinada. [11] Esta compresión de la estructura principal del ADN , o "pinch", permite un contacto cercano entre UDG y la base de interés. [10]
Empuje : para evaluar completamente la identidad del nucleótido, el bucle de intercalación penetra o empuja dentro del surco menor del ADN e induce un cambio conformacional para voltear el nucleótido fuera de la hélice. [13] La compresión de la cadena principal favorece la eversión del nucleótido ahora extrahelicoidal, que está posicionado para el reconocimiento por el motivo de unión al uracilo. [10] El acoplamiento de la intercalación y la eversión ayuda a compensar la interrupción de las interacciones favorables de apilamiento de bases dentro de la hélice de ADN. Leu 272 llena el vacío dejado por el nucleótido volteado para crear interacciones de dispersión con las bases vecinas y restaurar la estabilidad del apilamiento. [11]
Pull : Ahora accesible al sitio activo, el nucleótido interactúa con el motivo de unión del uracilo. La forma del sitio activo complementa la estructura evertida del uracilo, lo que permite una alta especificidad del sustrato. Las purinas son demasiado grandes para caber en el sitio activo, mientras que las interacciones desfavorables con otras pirimidinas desalientan la unión a sustratos alternativos. [9] La cadena lateral de Tyr 147 interfiere estéricamente con el grupo metilo C5 de timina , mientras que un enlace de hidrógeno específico entre el carbonilo O2 del uracilo y Gln 144 discrimina contra un sustrato de citosina, que carece del carbonilo necesario. [9] Una vez que se reconoce el uracilo, la escisión del enlace glucosídico procede de acuerdo con el mecanismo a continuación.
La posición de los residuos que activan el nucleófilo de agua y protonan el grupo saliente de uracilo es ampliamente debatida, aunque el mecanismo más comúnmente seguido emplea el circuito activador de agua detallado en la estructura de la enzima. [12] [14] Independientemente de la posición, las identidades de los residuos de ácido aspártico e histidina son consistentes en los estudios catalíticos. [10] [11] [12] [14] [15]
La uracilo N -glicosilasa (UNG) se utiliza para eliminar los productos remanentes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la PCR. Este método modifica los productos de la PCR de tal manera que en una nueva reacción, cualquier producto residual de las amplificaciones de PCR anteriores será digerido y se evitará que se amplifique, pero las verdaderas plantillas de ADN no se verán afectadas. [16] La PCR sintetiza abundantes productos de amplificación en cada ronda, pero la contaminación de rondas posteriores de PCR con cantidades traza de estos productos, llamada contaminación remanente, produce resultados falsos positivos. La contaminación remanente de alguna PCR anterior puede ser un problema significativo, debido tanto a la abundancia de productos de PCR como a la estructura ideal del material contaminante para la reamplificación. Sin embargo, la contaminación por arrastre se puede controlar mediante los dos pasos siguientes: (i) incorporando dUTP en todos los productos de PCR (sustituyendo dUTP por dTTP, o incorporando uracilo durante la síntesis de cebadores; y (ii) tratando todas las reacciones de inicio completamente preensambladas posteriores con uracilo ADN glicosilasa (UDG), seguido de la inactivación térmica de la UDG. La UDG escinde la base de uracilo de la cadena principal de fosfodiéster del ADN que contiene uracilo, pero no tiene efecto sobre el ADN natural (es decir, que contiene timina). Los sitios apirimidínicos resultantes bloquean la replicación por las ADN polimerasas y son muy lábiles a la hidrólisis ácido/base. Debido a que la UDG no reacciona con dTTP, y también se inactiva por desnaturalización térmica antes de la PCR real, la contaminación por arrastre de las PCR se puede controlar de manera efectiva si los contaminantes contienen uracilos en lugar de timinas. [6]
La uracilo N -glicosilasa también se utilizó en un estudio para detectar evidencia de actividad metabólica continua de bajo nivel y reparación de ADN en bacterias antiguas. [17] La supervivencia a largo plazo de las bacterias puede ocurrir ya sea a través de la formación de endosporas (en la que la bacteria entra en letargo total, sin que se produzca actividad metabólica en absoluto y, por tanto, no hay reparación de ADN), o bien a través de la reducción de la actividad metabólica a una tasa muy baja, justo la suficiente para llevar a cabo la reparación continua de ADN y evitar el agotamiento de otras moléculas inestables (como el ATP ), en la que el microbio puede reparar el daño a su ADN pero también continúa consumiendo lentamente nutrientes. [17] Las secuencias de ADN de bacterias en permafrost se amplificaron mediante PCR. Una serie de ejecuciones amplificó las secuencias de ADN tal como están (para detectar todo el ADN bacteriano vivo en las muestras), mientras que la otra serie buscó específicamente ADN que había estado experimentando una reparación continua; para ello, el ADN se trató con UNG para eliminar los uracilos. Esto impidió la amplificación del ADN no reparado de dos maneras: en primer lugar, los sitios abásicos generados por la eliminación de uracilos impidieron que la ADN polimerasa utilizada en la PCR avanzara más allá del sitio del daño, mientras que estos sitios abásicos también debilitaron directamente el ADN y lo hicieron más propenso a fragmentarse al calentarse. [17] De esta manera, los investigadores pudieron mostrar evidencia de reparación de ADN en curso en bacterias Gram positivas con alto contenido de GC de hasta 600.000 años de antigüedad. [17]
La uracilo N glicosilasa también se ha utilizado en un método para clonar fragmentos de ADN amplificados por PCR. En este método, los cebadores utilizados en la PCR se sintetizan con residuos de uracilo en lugar de timina. Cuando estos cebadores se incorporan a fragmentos amplificados por PCR, la secuencia de cebadores se vuelve susceptible a la digestión con uracilo N glicosilasa y produce extremos 3' salientes que se pueden unir a un ADN vector preparado adecuadamente. Las moléculas quiméricas resultantes se pueden transformar en células competentes con alta eficiencia, sin necesidad de ligamiento in vitro. [18]
Se ha demostrado que la uracilo-ADN glicosilasa interactúa con RPA2 . [19]
