El sistema de secreción tipo III ( T3SS o TTSS ) es uno de los sistemas de secreción bacterianos utilizados por las bacterias para secretar sus proteínas efectoras en las células del huésped para promover la virulencia y la colonización . [1] [2] Si bien el sistema de secreción tipo III ha sido ampliamente considerado como equivalente al inyectisoma , muchos argumentan que el inyectisoma es solo una parte del sistema de secreción tipo III, que también incluye estructuras como el aparato de exportación flagelar. [3] El T3SS es un complejo proteico en forma de aguja que se encuentra en varias especies de bacterias gramnegativas patógenas .
Descripción general
El término sistema de secreción de tipo III se acuñó en 1993. [4] Este sistema de secreción se distingue de al menos otros cinco sistemas de secreción que se encuentran en las bacterias gramnegativas . Muchas bacterias asociadas a animales y plantas poseen T3SS similares. Estos T3SS son similares como resultado de la evolución convergente y el análisis filogenético respalda un modelo en el que las bacterias gramnegativas pueden transferir el casete del gen T3SS horizontalmente a otras especies. Algunos de los T3SS más investigados son de especies de: [ cita requerida ]
El T3SS está compuesto por aproximadamente 30 proteínas diferentes, lo que lo convierte en uno de los sistemas de secreción más complejos. Su estructura muestra muchas similitudes con los flagelos bacterianos (estructuras extracelulares largas y rígidas utilizadas para la motilidad ). Algunas de las proteínas que participan en el T3SS comparten homología de secuencia de aminoácidos con las proteínas flagelares. Algunas de las bacterias que poseen un T3SS también tienen flagelos y son móviles ( Salmonella , por ejemplo), y otras no ( Shigella , por ejemplo). Técnicamente hablando, la secreción de tipo III se utiliza tanto para secretar proteínas relacionadas con la infección como componentes flagelares. Sin embargo, el término "secreción de tipo III" se utiliza principalmente en relación con el aparato de infección. El flagelo bacteriano comparte un ancestro común con el sistema de secreción de tipo III. [5] [6]
Los T3SS son esenciales para la patogenicidad (la capacidad de infectar) de muchas bacterias patógenas. Los defectos en el T3SS pueden hacer que una bacteria no sea patógena. Se ha sugerido que algunas cepas no invasivas de bacterias gramnegativas han perdido el T3SS porque el sistema, que es costoso en términos de energía, ya no se utiliza. [7] Aunque los antibióticos tradicionales eran eficaces contra estas bacterias en el pasado, constantemente surgen cepas resistentes a los antibióticos . Comprender la forma en que funciona el T3SS y desarrollar medicamentos dirigidos específicamente a él se han convertido en un objetivo importante de muchos grupos de investigación en todo el mundo desde fines de la década de 1990.
Estructura
El sello distintivo del T3SS es la aguja [8] [9] (más generalmente, el complejo de la aguja ( NC ) o el aparato T3SS ( T3SA ); también llamado inyectoma cuando se excluye la ATPasa ; ver más abajo). Las proteínas bacterianas que necesitan ser secretadas pasan del citoplasma bacteriano a través de la aguja directamente al citoplasma del huésped. Tres membranas separan los dos citoplasmas: las membranas dobles (membranas interna y externa) de la bacteria Gram-negativa y la membrana eucariota. La aguja proporciona un paso suave a través de esas membranas altamente selectivas y casi impermeables. Una sola bacteria puede tener varios cientos de complejos de agujas repartidos por su membrana. Se ha propuesto que el complejo de agujas es una característica universal de todos los T3SS de las bacterias patógenas. [10]
El complejo de la aguja comienza en el citoplasma de la bacteria, cruza las dos membranas y sobresale de la célula. La parte anclada en la membrana es la base (o cuerpo basal ) del T3SS. La parte extracelular es la aguja. Una denominada varilla interna conecta la aguja a la base. La aguja en sí, aunque es la parte más grande y prominente del T3SS, está formada por muchas unidades de una sola proteína. Por lo tanto, la mayoría de las diferentes proteínas del T3SS son las que forman la base y las que se secretan al huésped. Como se mencionó anteriormente, el complejo de la aguja comparte similitudes con los flagelos bacterianos. Más específicamente, la base del complejo de la aguja es estructuralmente muy similar a la base flagelar; la aguja en sí es análoga al gancho flagelar, una estructura que conecta la base con el filamento flagelar. [11] [12]
La base está compuesta por varios anillos circulares y es la primera estructura que se construye en un nuevo complejo de agujas. Una vez que se completa la base, sirve como una máquina de secreción para las proteínas externas (la aguja). Una vez que se completa todo el complejo, el sistema pasa a secretar proteínas que están destinadas a ser entregadas a las células huésped. Se supone que la aguja se construye de abajo hacia arriba; las unidades de proteína monomérica de aguja se apilan unas sobre otras, de modo que la unidad en la punta de la aguja es la última en agregarse. La subunidad de la aguja es una de las proteínas T3SS más pequeñas, con un peso de alrededor de 9 kDa . Cada aguja está compuesta por 100 a 150 subunidades.
La aguja T3SS mide alrededor de 60−80 nm de longitud y 8 nm de ancho externo. Debe tener una longitud mínima para que otras estructuras bacterianas extracelulares ( adhesinas y la capa de lipopolisacáridos , por ejemplo) no interfieran con la secreción. El orificio de la aguja tiene un diámetro de 3 nm. La mayoría de las proteínas efectoras plegadas son demasiado grandes para pasar a través de la abertura de la aguja, por lo que la mayoría de las proteínas secretadas deben pasar a través de la aguja desplegada , una tarea realizada por la ATPasa en la base de la estructura. [13]
Proteínas T3SS
Diagrama de las subestructuras individuales del complejo de agujas de Salmonella typhimurium
Las proteínas T3SS se pueden agrupar en tres categorías:
Proteínas estructurales : forman la base, el vástago interno y la aguja.
Proteínas efectoras : se secretan en la célula huésped y promueven la infección/suprimen las defensas de la célula huésped.
Chaperonas : unen los efectores en el citoplasma bacteriano, los protegen de la agregación y la degradación y los dirigen hacia el complejo de agujas.
La mayoría de los genes T3SS se encuentran en operones . Estos operones se encuentran en el cromosoma bacteriano en algunas especies y en un plásmido específico en otras. Salmonella , por ejemplo, tiene una región cromosómica en la que se concentran la mayoría de los genes T3SS, la llamada isla de patogenicidad de Salmonella ( SPI ). Shigella , por otro lado, tiene un gran plásmido de virulencia en el que residen todos los genes T3SS. Es importante señalar que muchas islas de patogenicidad y plásmidos contienen elementos que permiten la transferencia horizontal frecuente de genes de la isla/plásmido a una nueva especie.
Las proteínas efectoras que se secretan a través de la aguja deben ser reconocidas por el sistema, ya que flotan en el citoplasma junto con miles de otras proteínas. El reconocimiento se realiza a través de una señal de secreción : una secuencia corta de aminoácidos ubicada al principio (el extremo N ) de la proteína (generalmente dentro de los primeros 20 aminoácidos), que el complejo de la aguja es capaz de reconocer. A diferencia de otros sistemas de secreción, la señal de secreción de las proteínas T3SS nunca se separa de la proteína.
Inducción de secreción
El contacto de la aguja con una célula huésped hace que el T3SS comience a secretar; [14] no se sabe mucho sobre este mecanismo desencadenante (ver más abajo). La secreción también se puede inducir reduciendo la concentración de iones de calcio en el medio de crecimiento (para Yersinia y Pseudomonas ; se hace añadiendo un quelante como EDTA o EGTA ) y añadiendo el colorante aromático rojo Congo al medio de crecimiento (para Shigella ), por ejemplo. Estos métodos y otros se utilizan en laboratorios para inducir artificialmente la secreción de tipo III.
La inducción de la secreción por señales externas distintas del contacto con las células huésped también tiene lugar in vivo , en organismos infectados. Las bacterias detectan señales como la temperatura , el pH , la osmolaridad y los niveles de oxígeno , y las utilizan para "decidir" si activan su T3SS. Por ejemplo, Salmonella puede replicarse e invadir mejor el íleon que el ciego del intestino animal . Las bacterias pueden saber dónde están gracias a los diferentes iones presentes en estas regiones; el íleon contiene formato y acetato , mientras que el ciego no. Las bacterias detectan estas moléculas, determinan que están en el íleon y activan su maquinaria de secreción. Las moléculas presentes en el ciego, como el propionato y el butirato , proporcionan una señal negativa a las bacterias e inhiben la secreción. El colesterol , un lípido que se encuentra en la mayoría de las membranas celulares eucariotas, es capaz de inducir la secreción en Shigella .
Las señales externas mencionadas anteriormente regulan la secreción directamente o a través de un mecanismo genético. Se conocen varios factores de transcripción que regulan la expresión de los genes T3SS. Algunas de las chaperonas que se unen a los efectores T3SS también actúan como factores de transcripción. Se ha sugerido un mecanismo de retroalimentación: cuando la bacteria no secreta, sus proteínas efectoras se unen a las chaperonas y flotan en el citoplasma. Cuando comienza la secreción, las chaperonas se desprenden de los efectores y estos últimos se secretan y abandonan la célula. Las chaperonas solitarias actúan entonces como factores de transcripción, uniéndose a los genes que codifican sus efectores e induciendo su transcripción y, por lo tanto, la producción de más efectores.
Se han propuesto estructuras similares a los inyectisomas de tipo 3SS para remachar las membranas externas e internas de las bacterias gramnegativas para ayudar a liberar vesículas de membrana externa destinadas a entregar secreciones bacterianas al huésped eucariota u otras células objetivo in vivo. [15]
Infección mediada por T3SS
Los efectores del T3SS entran en el complejo de la aguja por la base y se dirigen hacia el interior de la aguja en dirección a la célula huésped. La forma exacta en que los efectores entran en el huésped es en su mayor parte desconocida. Anteriormente se ha sugerido que la propia aguja es capaz de perforar un agujero en la membrana de la célula huésped; esta teoría ha sido refutada. Ahora está claro que algunos efectores, denominados colectivamente translocadores , se secretan primero y producen un poro o un canal (un translocón ) en la membrana de la célula huésped, a través del cual pueden entrar otros efectores. Las bacterias mutadas que carecen de translocadores pueden secretar proteínas, pero no pueden entregarlas a las células huésped. En general, cada T3SS incluye tres translocadores. Algunos translocadores cumplen una doble función; después de participar en la formación del poro, entran en la célula y actúan como efectores genuinos .
Los efectores del T3SS manipulan las células huésped de varias maneras. El efecto más sorprendente es la promoción de la absorción de la bacteria por la célula huésped. Muchas bacterias que poseen T3SS deben entrar en las células huésped para replicarse y propagar la infección. Los efectores que inyectan en la célula huésped inducen al huésped a engullir la bacteria y prácticamente "comérsela". Para que esto suceda, los efectores bacterianos manipulan la maquinaria de polimerización de actina de la célula huésped. La actina es un componente del citoesqueleto y también participa en la motilidad y en los cambios en la forma celular. A través de sus efectores del T3SS, la bacteria puede utilizar la propia maquinaria de la célula huésped para su propio beneficio. Una vez que la bacteria ha entrado en la célula, puede secretar otros efectores con mayor facilidad y puede penetrar en las células vecinas e infectar rápidamente todo el tejido .
También se ha demostrado que los efectores del T3SS alteran el ciclo celular del huésped y algunos de ellos son capaces de inducir la apoptosis . Uno de los efectores del T3SS más investigados es el IpaB de Shigella flexneri . Cumple una doble función, como translocador, creando un poro en la membrana de la célula huésped, y como efector, ejerciendo múltiples efectos perjudiciales sobre la célula huésped. Se ha demostrado que el IpaB induce la apoptosis en los macrófagos (células del sistema inmunitario animal ) después de ser engullidos por ellos. [16] Más tarde se demostró que el IpaB logra esto interactuando con la caspasa 1 , una proteína reguladora importante en las células eucariotas. [17]
Otra clase bien caracterizada de efectores T3SS son los efectores tipo Activador de la Transcripción ( efectores TAL ) de Xanthomonas . Cuando se inyectan en plantas, estas proteínas pueden entrar en el núcleo de la célula vegetal, unirse a secuencias promotoras de la planta y activar la transcripción de genes vegetales que ayudan en la infección bacteriana. [18] Se ha demostrado recientemente que el reconocimiento del ADN del efector TAL comprende un código simple [19] [20] y esto ha mejorado enormemente la comprensión de cómo estas proteínas pueden alterar la transcripción de genes en las células vegetales hospedantes.
Problemas sin resolver
La topología y organización del complejo de agujas de Salmonella . [21]
Desde mediados de los años noventa se han publicado cientos de artículos sobre el T3SS. Sin embargo, quedan por resolver numerosos problemas relacionados con el sistema:
Proteínas T3SS . De las aproximadamente 30 proteínas T3SS que existen en cada organismo, menos de 10 se han detectado directamente mediante métodos bioquímicos . El resto, al ser quizás poco frecuentes, ha resultado difícil de detectar y siguen siendo teóricos (aunque se han realizado estudios genéticos en lugar de bioquímicos sobre muchos genes/proteínas T3SS). La localización de cada proteína tampoco se conoce por completo.
La longitud de la aguja . No se sabe cómo la bacteria "sabe" cuándo una nueva aguja ha alcanzado la longitud adecuada. Existen varias teorías, entre ellas la existencia de una "proteína regla" que de alguna manera conecta la punta y la base de la aguja. La adición de nuevos monómeros a la punta de la aguja debería estirar la proteína regla y, de ese modo, indicar la longitud de la aguja a la base.
Energética . La fuerza que impulsa el paso de las proteínas al interior de la aguja no se conoce por completo. Una ATPasa está asociada a la base del T3SS y participa en la dirección de las proteínas hacia el interior de la aguja; pero no está claro si proporciona la energía para el transporte.
Señal de secreción . Como se mencionó anteriormente, se conoce la existencia de una señal de secreción en las proteínas efectoras. La señal permite al sistema distinguir las proteínas transportadas por el T3SS de cualquier otra proteína. Su naturaleza, requisitos y mecanismo de reconocimiento son poco conocidos, pero recientemente se han desarrollado métodos para predecir qué proteínas bacterianas pueden ser transportadas por el sistema de secreción de tipo III. [22]
Activación de la secreción . La bacteria debe saber cuándo es el momento adecuado para secretar efectores. La secreción innecesaria, cuando no hay ninguna célula huésped en las proximidades, es un desperdicio para la bacteria en términos de energía y recursos. La bacteria es capaz de reconocer de alguna manera el contacto de la aguja con la célula huésped. Cómo lo hace todavía se está investigando, y el método puede depender del patógeno. Algunas teorías postulan un cambio conformacional delicado en la estructura de la aguja al entrar en contacto con la célula huésped; este cambio quizás sirva como señal para que la base comience la secreción. Se ha descubierto un método de reconocimiento en Salmonella , que se basa en detectar el pH citosólico de la célula huésped a través del T3SS codificado por la isla de patogenicidad 2 para activar la secreción de efectores. [23]
Unión de chaperonas . No se sabe cuándo las chaperonas se unen a sus efectores (si durante o después de la traducción ) y cómo se disocian de sus efectores antes de la secreción.
Mecanismos efectores . Aunque desde principios del siglo XXI se ha descubierto mucho sobre las formas en que los efectores del T3SS manipulan al huésped, la mayoría de los efectos y vías siguen siendo desconocidos.
Evolución . Como se mencionó, el T3SS está estrechamente relacionado con el flagelo bacteriano. [24] Hay tres hipótesis en competencia: [25] primero, que el flagelo evolucionó primero y el T3SS se deriva de esa estructura, segundo, que el T3SS evolucionó primero y el flagelo se deriva de él, y tercero, que las dos estructuras se derivan de un ancestro común. Hubo cierta controversia sobre los diferentes escenarios, [5] [25] ya que todos explican la homología de proteínas entre las dos estructuras, así como su diversidad funcional. [26] Sin embargo, la evidencia filogenómica reciente favorece la hipótesis de que el T3SS se derivó del flagelo por un proceso que involucra pérdida inicial de genes y luego adquisición de genes. [27] Un paso clave de este último proceso fue el reclutamiento de secretinas al T3SS, un evento que ocurrió al menos tres veces desde otros sistemas asociados a la membrana.
Nomenclatura de las proteínas T3SS
Flagelo de bacterias Gram negativas. Los anillos de la base son muy similares a los anillos del complejo acicular, aunque no se ha demostrado la existencia de un anillo C en el complejo acicular. El gancho flagelar es homólogo a la aguja T3SS
Desde principios de los años 90 se han ido descubriendo nuevas proteínas T3SS en diferentes especies bacterianas a un ritmo constante. Se han dado abreviaturas independientes para cada serie de proteínas en cada organismo, y los nombres normalmente no revelan mucho sobre la función de la proteína. Algunas proteínas descubiertas independientemente en diferentes bacterias han demostrado posteriormente ser homólogas ; sin embargo, los nombres históricos se han mantenido en su mayoría, un hecho que podría causar confusión. Por ejemplo, las proteínas SicA, IpgC y SycD son homólogas de Salmonella , Shigella y Yersinia , respectivamente, pero la última letra (el "número de serie") en su nombre no lo demuestra.
A continuación se presenta un resumen de los nombres de las series de proteínas más comunes en varias especies que contienen T3SS. Tenga en cuenta que estos nombres incluyen proteínas que forman la maquinaria T3SS, así como las proteínas efectoras secretadas :
Yersinia
Yop : proteína externa de Yersinia
Ysc : Secreción de Yersinia (componente)
Ypk : proteína quinasa de Yersinia
Salmonela
Spa : Presentación superficial del antígeno
Sic : chaperona de invasión de salmonella
Sorbo : proteína de invasión de Salmonella
Prg : gen reprimido por PhoP
Inv : Invasión
Org : Gen regulado por oxígeno
Ssp : proteína secretada por Salmonella
Iag : gen asociado a la invasión
Shigella
Ipg : gen del plásmido de invasión
Ipa : Antígeno plasmídico de invasión
Mxi : Expresión de membrana de Ipa
Spa : Presentación superficial del antígeno
Osp : proteína externa de Shigella
Escherichia
Tir : Receptor de intimina translocado
Sep : Secreción de proteínas de E. coli
Esc : Secreción de Escherichia (componente)
Esp : Proteína de secreción de Escherichia
Ces : Acompañante de la secreción de E. coli
Pseudomonas
Hrp : Respuesta hipersensible y patogenicidad
Hrc : Respuesta hipersensible conservada (o Hrp conservada)
Rizobio
Nop : proteína de nodulación
Rhc : Rhizobium conservado
En varias especies:
Vir : Virulencia
"Protochlamydia amoebophila"
"Sodalis glossinidius" [28]
A continuación de esas abreviaturas se encuentra una letra o un número. Las letras suelen indicar un "número de serie", ya sea el orden cronológico de descubrimiento o el orden físico de aparición del gen en un operón . Los números, en el caso más raro, indican el peso molecular de la proteína en kDa . Ejemplos: IpaA, IpaB, IpaC; MxiH, MxiG, MxiM; Spa9, Spa47.
En todos los T3SS aparecen varios elementos clave: el monómero de la aguja, el vástago interno de la aguja, las proteínas anulares, los dos translocadores, la proteína de la punta de la aguja, la proteína gobernante (que se cree que determina la longitud de la aguja; véase más arriba) y la ATPasa , que proporciona energía para la secreción. La siguiente tabla muestra algunas de estas proteínas clave en cuatro bacterias que contienen T3SS:
Métodos empleados en la investigación de T3SS
Aislamiento de complejos de agujas T3SS
El aislamiento de estructuras de membrana hidrofóbicas , frágiles y grandes de las células ha sido un desafío durante muchos años. Sin embargo, a fines de la década de 1990, se desarrollaron varios enfoques para el aislamiento de NC de T3SS. En 1998, se aislaron los primeros NC de Salmonella typhimurium . [29]
Para el aislamiento, las bacterias se cultivan en un gran volumen de medio de crecimiento líquido hasta que alcanzan la fase logarítmica . A continuación, se centrifugan ; el sobrenadante (el medio) se descarta y el pellet (las bacterias) se resuspende en un tampón de lisis que normalmente contiene lisozima y, a veces, un detergente como LDAO o Triton X-100 . Este tampón desintegra la pared celular . Después de varias rondas de lisis y lavado, las bacterias abiertas se someten a una serie de ultracentrifugaciones . Este tratamiento enriquece las grandes estructuras macromoleculares y descarta los componentes celulares más pequeños. Opcionalmente, el lisado final se somete a una purificación adicional mediante gradiente de densidad de CsCl .
Un enfoque adicional para una purificación adicional utiliza la cromatografía de afinidad . Las proteínas T3SS recombinantes que llevan una etiqueta de proteína (una etiqueta de histidina , por ejemplo) se producen por clonación molecular y luego se introducen ( transforman ) en las bacterias investigadas. Después del aislamiento inicial de NC, como se describió anteriormente, el lisado pasa a través de una columna recubierta con partículas con alta afinidad a la etiqueta (en el caso de las etiquetas de histidina: iones de níquel ). La proteína etiquetada se retiene en la columna y, con ella, todo el complejo de agujas. Se pueden lograr altos grados de pureza utilizando estos métodos. Esta pureza es esencial para muchos ensayos delicados que se han utilizado para la caracterización de NC.
Los efectores de tipo III se conocían desde principios de los años 90, pero la forma en que se introducían en las células huésped era un completo misterio. La homología entre muchas proteínas flagelares y del T3SS llevó a los investigadores a sospechar la existencia de una estructura externa del T3SS similar a los flagelos. La identificación y el posterior aislamiento de la estructura en forma de aguja permitió a los investigadores:
caracterizar en detalle la estructura tridimensional del NC y a través de esto sacar conclusiones sobre el mecanismo de secreción (por ejemplo, que el ancho estrecho de la aguja requiere el despliegue de los efectores antes de la secreción),
analizar los componentes proteicos del NC, esto mediante el sometimiento de agujas aisladas a análisis proteómico (ver más abajo),
asignar roles a varios componentes NC, esto mediante la eliminación de genes T3SS, aislando los NC de las bacterias mutadas y examinando los cambios que causaron las mutaciones.
Microscopía, cristalografía y RMN de estado sólido
Al igual que con casi todas las proteínas, la visualización de NCs T3SS solo es posible con microscopía electrónica . Las primeras imágenes de NCs (1998) mostraron estructuras de agujas que sobresalían de la pared celular de bacterias vivas y NCs aislados, planos y bidimensionales. [29] En 2001, las imágenes de NCs de Shigella flexneri se analizaron digitalmente y se promediaron para obtener una primera estructura semi-3D del NC. [8] La estructura helicoidal de NCs de Shigella flexneri se resolvió a una resolución de 16 Å utilizando difracción de fibra de rayos X en 2003, [30] y un año después se publicó una estructura 3D de 17 Å de NCs de Salmonella typhimurium . [31] Los avances y enfoques recientes han permitido imágenes 3D de alta resolución del NC, [32] [33] aclarando aún más la compleja estructura del NC.
A lo largo de los años se han cristalizado numerosas proteínas T3SS, entre ellas proteínas estructurales del NC, efectores y chaperonas. La primera estructura de un monómero complejo en forma de aguja fue la estructura de RMN de BsaL de "Burkholderia pseudomallei" y, posteriormente, la estructura cristalina de MixH de Shigella flexneri , que se resolvieron en 2006. [34] [35]
En 2012, una combinación de producción de agujas de tipo salvaje recombinantes, RMN de estado sólido , microscopía electrónica [36] y modelado Rosetta reveló las interfaces supramoleculares y, en última instancia, la estructura atómica completa de la aguja T3SS de Salmonella typhimurium . [37] Se demostró que las subunidades PrgI de 80 residuos forman un ensamblaje helicoidal dextrógiro con aproximadamente 11 subunidades por dos vueltas, similar al del flagelo de Salmonella typhimurium . El modelo también reveló un dominio amino-terminal extendido que se ubica en la superficie de la aguja, mientras que el extremo carboxilo terminal altamente conservado apunta hacia el lumen. [37]
Proteómica
Se han empleado varios métodos para identificar el conjunto de proteínas que componen el T3SS. Los complejos de agujas aislados se pueden separar con SDS-PAGE . Las bandas que aparecen después de la tinción se pueden escindir individualmente del gel y analizarse mediante secuenciación de proteínas y espectrometría de masas . Los componentes estructurales de las NC se pueden separar entre sí (la parte de la aguja de la parte de la base, por ejemplo), y mediante el análisis de esas fracciones se pueden deducir las proteínas que participan en cada una de ellas. Alternativamente, las NC aisladas se pueden analizar directamente mediante espectrometría de masas, sin electroforesis previa , para obtener una imagen completa del proteoma de las NC .
Estudios genéticos y funcionales
Los investigadores han manipulado el T3SS de muchas bacterias. La observación de la influencia de las manipulaciones individuales puede utilizarse para obtener información sobre el papel de cada componente del sistema. Algunos ejemplos de manipulaciones son:
Sobreexpresión de uno o más genes T3SS (en otras palabras: producción in vivo de una proteína T3SS en cantidades mayores que las habituales).
Cambios puntuales o regionales en genes o proteínas del T3SS. Esto se hace para definir la función de aminoácidos o regiones específicas en una proteína.
Introducción de un gen o una proteína de una especie bacteriana en otra (ensayo de complementación cruzada). Esto se hace con el fin de comprobar si existen diferencias y similitudes entre dos SST3.
La manipulación de los componentes del T3SS puede influir en varios aspectos de la función y patogenicidad bacteriana. Ejemplos de posibles influencias:
La capacidad de las bacterias intracelulares de migrar entre células huésped.
Capacidad de las bacterias para matar células hospedadoras. Se puede medir con varios métodos, por ejemplo, mediante el ensayo de liberación de LDH , en el que se identifica la enzima LDH que se libera de las células muertas midiendo su actividad enzimática.
Capacidad de un T3SS de secretar una proteína específica o de secretarla en absoluto. Para comprobarlo, se induce la secreción en bacterias que crecen en un medio líquido. A continuación, las bacterias y el medio se separan por centrifugación y, a continuación, se analiza la fracción del medio (el sobrenadante) para detectar la presencia de proteínas secretadas. Para evitar que se secrete una proteína que se secreta normalmente, se puede unir artificialmente una molécula grande a ella. Si la proteína que no se secreta permanece "atascada" en la parte inferior del complejo de agujas, se bloquea eficazmente la secreción.
Capacidad de las bacterias para ensamblar un complejo de agujas intacto. Las NC se pueden aislar de bacterias manipuladas y examinar al microscopio. Sin embargo, los cambios menores no siempre se pueden detectar al microscopio.
Capacidad de las bacterias de infectar animales vivos o plantas. Incluso si se demuestra in vitro que las bacterias manipuladas pueden infectar células huésped, no se puede dar por sentada su capacidad de mantener una infección en un organismo vivo.
Los niveles de expresión de otros genes. Esto se puede analizar de varias maneras, en particular mediante transferencia Northern y RT-PCR . Los niveles de expresión de todo el genoma se pueden analizar mediante microarrays . Se descubrieron muchos factores de transcripción de tipo III y redes reguladoras utilizando estos métodos.
Herramientas de predicción de péptidos señal de tipo III
T3 eficaz
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