Transferencia Southern

Técnica de análisis de ADN

Gel de agarosa

Bandeja con una pila compuesta de arriba hacia abajo por un peso, toallas de papel, membrana de nitrocelulosa o nailon , gel, solución salina y una placa de vidrio.

Membrana de Southern blot después de la hibridación y enjuague.

Gel de agarosa de transferencia Southern bajo iluminación ultravioleta .

Autorradiografía Southern blot .

El Southern blot es un método utilizado para la detección y cuantificación de una secuencia de ADN específica en muestras de ADN. Este método se utiliza en biología molecular . Brevemente, el ADN purificado de una muestra biológica (como sangre o tejido) se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos de ADN resultantes se separan por electroforesis utilizando una corriente eléctrica para moverlos a través de un gel o matriz similar a un tamiz, lo que permite que los fragmentos más pequeños se muevan más rápido que los fragmentos más grandes. Los fragmentos de ADN se transfieren fuera del gel o la matriz a una membrana sólida, que luego se expone a una sonda de ADN marcada con una etiqueta radioactiva, fluorescente o química. La etiqueta permite visualizar dentro del Southern blot cualquier fragmento de ADN que contenga secuencias complementarias con la secuencia de la sonda de ADN. ^[1]

El Southern blotting combina la transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis a una membrana de filtro en un proceso llamado blotting , y la posterior detección de fragmentos mediante hibridación de sonda . ^[2]

El método recibe su nombre del biólogo británico Edwin Southern , quien lo publicó por primera vez en 1975. ^[3] Otros métodos de transferencia (es decir, transferencia Western , ^[4] transferencia Northern , transferencia Eastern , transferencia Southwestern ) que emplean principios similares, pero utilizando ARN o proteínas, han sido nombrados posteriormente en honor a las direcciones de la brújula como una especie de juego de palabras con el nombre de Southern. Como la etiqueta es epónima , Southern se escribe con mayúscula, como es convencional para los nombres propios . Los nombres de otros métodos de transferencia pueden seguir esta convención, por analogía. ^[5]

Historia

Southern inventó el Southern blot después de combinar tres innovaciones. La primera son las endonucleasas de restricción, que fueron desarrolladas en la Universidad Johns Hopkins por Tom Kelly y Hamilton Smith . Esas endonucleasas de restricción se utilizan para cortar el ADN en una secuencia específica. Kenneth y Noreen Murray introdujeron esta técnica como Southern. La segunda innovación es la electroforesis en gel que se basa en la separación de mezclas de ADN, ARN o proteínas según el tamaño molecular, que también fue desarrollada en la Universidad Johns Hopkins, por Daniel Nathans y Kathleen Danna en 1971. La tercera innovación es el método de transferencia de transferencia que fue desarrollado por Frederick Sanger , cuando transfirió moléculas de ARN a papel DEAE. El Southern blot se inventó en 1973, pero no se publicó hasta 1975. Aunque se publicó más tarde, la técnica se difundió cuando Southern presentó la técnica Southern blot a un científico del Laboratorio Cold Spring Harbor llamado Michael Mathews dibujándola en un papel. ^[6]

Método

El ADN genómico se digiere con una o más enzimas de restricción y luego los fragmentos de ADN se fraccionan por tamaño mediante electroforesis en gel. Antes de transferir los fragmentos de ADN a una membrana sólida, que puede ser de nailon o de nitrocelulosa, primero se desnaturalizan mediante un tratamiento alcalino. ^[7] Después de que los fragmentos de ADN se inmovilizan en la membrana, se utilizan métodos de prehibridación para reducir la unión de sondas no específicas. Luego, los fragmentos en la membrana se hibridan con sondas de ADN, ARN u oligonucleótidos radiomarcadas o no radiomarcadas que sean complementarias a la secuencia de ADN objetivo. Luego, se utilizan métodos de detección para visualizar el ADN objetivo. ^[8]

1. Aislamiento de ADN: El ADN a estudiar se aísla de diversos tejidos. La fuente de ADN más adecuada es el tejido sanguíneo, aunque también se puede aislar de diferentes tejidos (pelo, semen, saliva, etc.).
2. Digestión del ADN: Las endonucleasas de restricción se utilizan para cortar las cadenas de ADN de alto peso molecular en fragmentos más pequeños. Esto se hace añadiendo la cantidad deseada de ADN, que puede modificarse según la sonda utilizada y la complejidad del ADN, con la enzima de restricción, el tampón enzimático y agua purificada. A continuación, todo se incuba a 37 °C durante la noche.
3. Electroforesis en gel: los fragmentos de ADN se someten a electroforesis en un gel de agarosa para separarlos por tamaño. Si algunos de los fragmentos de ADN tienen un tamaño superior a 15 kb , antes de realizar la transferencia, el gel puede tratarse con un ácido, como HCl diluido . Esto despurina los fragmentos de ADN, rompiéndolos en trozos más pequeños, lo que permite una transferencia más eficiente del gel a la membrana.
4. Desnaturalización: si se utilizan métodos de transferencia alcalina, el gel de ADN se coloca en una solución alcalina (que normalmente contiene hidróxido de sodio ) para desnaturalizar el ADN bicatenario. La desnaturalización en un entorno alcalino puede mejorar la unión de los residuos de timina del ADN con carga negativa a los grupos amino de la membrana con carga positiva, separándolos en cadenas de ADN individuales para su posterior hibridación con la sonda (véase más adelante), y destruye cualquier ARN residual que pueda estar todavía presente en el ADN. Sin embargo, la elección de métodos de transferencia alcalinos en lugar de neutros suele ser empírica y puede dar lugar a resultados equivalentes. ^{[ cita requerida ]}
5. Transferencia: Se coloca una lámina de membrana de nitrocelulosa (o, alternativamente, nailon ) encima (o debajo, dependiendo de la dirección de la transferencia) del gel. Se aplica presión constantemente al gel (ya sea mediante succión o colocando una pila de toallas de papel y un peso encima de la membrana y el gel), para asegurar un contacto bueno y parejo entre el gel y la membrana. Si se transfiere por succión, se utiliza un tampón SSC 20X para asegurar un sellado y evitar que el gel se seque. Luego se utiliza la transferencia del tampón por acción capilar desde una región de alto potencial hídrico a una región de bajo potencial hídrico (generalmente papel de filtro y pañuelos de papel) para mover el ADN del gel a la membrana; las interacciones de intercambio iónico unen el ADN a la membrana debido a la carga negativa del ADN y la carga positiva de la membrana. Se pueden utilizar cinco métodos para transferir fragmentos de ADN a la membrana sólida y son: ^[8]
   1. Transferencia capilar ascendente: este método transfiere el fragmento de ADN hacia arriba desde el gel hasta la membrana, donde el flujo del líquido o del tampón será ascendente.
   2. Transferencia capilar descendente: este método se realiza colocando el gel sobre la superficie de la membrana (generalmente una membrana cargada de nailon) y los fragmentos de ADN se transferirán en dirección descendente con el flujo del tampón alcalino.
   3. Transferencia simultánea a dos membranas: Este método se utiliza para transferir fragmentos de ADN de alta concentración simultáneamente desde el gel a dos membranas.
   4. Transferencia electroforética: Este método suele utilizar grandes corrientes eléctricas lo que dificulta transferir el ADN de manera eficiente debido a la temperatura del buffer utilizado, por lo que estas máquinas pueden estar equipadas con máquinas de enfriamiento o usarse en un área fría.
   5. Transferencia al vacío: Este método utiliza un tampón de la cámara superior para transferir el ADN del gel a la membrana de nitrocelulosa o nailon, el gel se coloca directamente sobre la membrana y la membrana se coloca sobre una pantalla porosa en la cámara de vacío.
6. Inmovilización: Luego, la membrana se hornea en un horno al vacío o en un horno normal a 80 °C durante 2 horas (condiciones estándar; membrana de nitrocelulosa o nailon) o se expone a radiación ultravioleta (membrana de nailon) para unir permanentemente el ADN transferido a la membrana.
7. Hibridación: después de eso, una sonda de hibridación (un solo fragmento de ADN con una secuencia particular cuya presencia en el ADN objetivo se debe determinar) se expone a la membrana. El ADN de la sonda se marca para que pueda detectarse, generalmente incorporando radiactividad o marcando la molécula con un tinte fluorescente o cromogénico . En algunos casos, la sonda de hibridación puede estar hecha de ARN, en lugar de ADN. Para asegurar la especificidad de la unión de la sonda al ADN de la muestra, los métodos de hibridación más comunes utilizan ADN de esperma de salmón o arenque para bloquear la superficie de la membrana y el ADN objetivo, formamida desionizada y detergentes como SDS para reducir la unión no específica de la sonda.
8. Detección: después de la hibridación, el exceso de sonda se lava de la membrana (normalmente utilizando un tampón SSC ) y el patrón de hibridación se visualiza en una película de rayos X mediante autorradiografía en el caso de una sonda radiactiva o fluorescente, o mediante el desarrollo de color en la membrana si se utiliza un método de detección cromogénico.

Interpretación de resultados

La hibridación de la sonda con un fragmento de ADN específico en la membrana del filtro indica que este fragmento contiene una secuencia de ADN que es complementaria a la sonda. El paso de transferencia del ADN desde el gel de electroforesis a una membrana permite una fácil unión de la sonda de hibridación marcada al ADN fraccionado por tamaño. También permite la fijación de los híbridos diana-sonda, necesarios para el análisis por autorradiografía u otros métodos de detección. Los Southern blots realizados con ADN genómico digerido con enzimas de restricción se pueden utilizar para determinar el número de secuencias (p. ej., copias de genes) en un genoma . Una sonda que se hibrida solo con un único segmento de ADN que no ha sido cortado por la enzima de restricción producirá una única banda en un Southern blot, mientras que es probable que se observen múltiples bandas cuando la sonda se hibrida con varias secuencias muy similares (p. ej., las que pueden ser el resultado de la duplicación de secuencia). Para mejorar la especificidad y reducir la hibridación de la sonda con secuencias que son menos del 100% idénticas, se pueden cambiar los parámetros de hibridación (por ejemplo, aumentando la temperatura de hibridación o disminuyendo el contenido de sal). La membrana de nailon es más duradera y tiene una mayor capacidad de unión a los fragmentos de ADN que la membrana de nitrocelulosa, por lo que los fragmentos de ADN estarán más fijados a la membrana incluso cuando la membrana se incuba a altas temperaturas. Además, en comparación con la membrana de nitrocelulosa que requiere un tampón de alta fuerza iónica para unir los fragmentos de ADN a la membrana, las membranas cargadas de nailon utilizan tampones con una fuerza iónica muy baja para transferir incluso pequeños fragmentos de ADN de aproximadamente 50 pb a la membrana; por lo general, el ADN que se va a transferir se separa mediante un gel de poliacrilamida. En el paso de transferencia, el método más eficiente para transferir el ADN del gel a la membrana es la transferencia al vacío, ya que transfiere el ADN de manera más rápida y cuantitativa. ^[8]

Aplicaciones

1. La transferencia Southern blotting se puede utilizar para la clonación basada en homología basada en la secuencia de aminoácidos del producto proteico del gen diana. Los oligonucleótidos se diseñan de modo que sean complementarios a la secuencia diana. Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente, se radiomarcan y se utilizan para examinar una biblioteca de ADN u otras colecciones de fragmentos de ADN clonados. Las secuencias que se hibridan con la sonda de hibridación se analizan más a fondo, por ejemplo, para obtener la secuencia de longitud completa del gen diana.
2. Mediante esta técnica se puede estudiar el reordenamiento cromosómico o genético normal. ^[7]
3. Se puede utilizar para encontrar secuencias similares en otras especies o en el genoma disminuyendo la especificidad de la hibridación. ^[7]
4. En una mezcla que tiene diferentes tamaños de ADN digerido, se utiliza para identificar el fragmento de restricción de un tamaño específico. ^[7]
5. Es útil para identificar cambios que ocurren en los genes, incluidas inserciones, reordenamientos, eliminaciones y mutaciones puntuales que afectan los sitios de restricción. ^[7]
6. Además, se utiliza para identificar una región específica que utiliza muchas enzimas de restricción diferentes en un mapeo de restricción. También se utiliza para determinar qué sitio de reconocimiento se ha alterado debido a un polimorfismo de un solo nucleótido que cambia una enzima de restricción específica. ^[7]
7. El Southern blotting también se puede utilizar para identificar sitios metilados en genes particulares. Particularmente útiles son las nucleasas de restricción MspI y HpaII , las cuales reconocen y escinden dentro de la misma secuencia. Sin embargo, HpaII requiere que una C dentro de ese sitio esté metilada, mientras que MspI escinde solo ADN no metilado en ese sitio. Por lo tanto, cualquier sitio metilado dentro de una secuencia analizada con una sonda particular será escindido por la primera enzima, pero no por la segunda. ^[9]
8. Se puede utilizar en la identificación personal a través de huellas dactilares y en el diagnóstico de enfermedades. ^[10]

Limitaciones

1. En comparación con otras pruebas, el Southern blot es una técnica compleja que tiene múltiples pasos y estos pasos requieren equipos y reactivos que son costosos. ^[10]
2. Se necesitan ADN de alta calidad y en grandes cantidades. ^[10]
3. El Southern blotting es un método que consume mucho tiempo y solo puede estimar el tamaño del ADN, ya que es un método semicuantitativo. ^[10]
4. No se puede utilizar para detectar mutaciones a nivel de par de bases. ^[10]

Véase también

• Electroforesis en gel de ácidos nucleicos
• Fragmento de restricción
• Huella genética
• Mancha norte
• Western blot
• Mancha oriental
• mancha del suroeste
• mancha noroeste

Referencias

1. "Glosario hablado de términos genéticos | NHGRI". www.genome.gov . Institutos Nacionales de Salud . Consultado el 24 de enero de 2023 . Este artículo incorpora texto de esta fuente, que se encuentra en el dominio público .
2. "Mancha del Sur".
3. Southern, Edwin Mellor (5 de noviembre de 1975). "Detección de secuencias específicas entre fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel". Journal of Molecular Biology . 98 (3): 503–517. doi :10.1016/S0022-2836(75)80083-0. ISSN  0022-2836. PMID  1195397. S2CID  20126741.
4. Towbin; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). "Transferencia electroforética de proteínas desde geles de poliacrilamida a láminas de nitrocelulosa: procedimiento y algunas aplicaciones". PNAS . 76 (9): 4350–4. Bibcode :1979PNAS...76.4350T. doi : 10.1073/pnas.76.9.4350 . PMC 411572 . PMID  388439. 
5. Burnette, W. Neal (abril de 1981). "Western Blotting: transferencia electroforética de proteínas desde geles de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio a nitrocelulosa no modificada y detección radiográfica con anticuerpos y proteína A radioyodada". Analytical Biochemistry . 112 (2): 195–203. doi :10.1016/0003-2697(81)90281-5. ISSN  0003-2697. PMID  6266278.
6. Tofano, Daidree; Wiechers, Ilse R.; Cook-Deegan, Robert (15 de agosto de 2006). "Edwin Southern, transferencia de ADN y tecnología de microarrays: un estudio de caso del papel cambiante de las patentes en la biología molecular académica". Genómica, sociedad y política . 2 (2). doi : 10.1186/1746-5354-2-2-50 . ISSN  1746-5354. PMC 5424904 . 
7. Glenn, Gary; Andreou, Lefkothea-Vasiliki (1 de enero de 2013), "Capítulo cinco: análisis de ADN mediante Southern Blotting", en Lorsch, Jon (ed.), DNA, vol. 529, Academic Press, págs. 47–63, doi :10.1016/b978-0-12-418687-3.00005-7, ISBN 9780124186873, PMID  24011036 , consultado el 4 de enero de 2023
8. Green, Michael R.; Sambrook, Joseph (julio de 2021). "Análisis de ADN mediante Southern Blotting". Protocolos de Cold Spring Harbor . 2021 (7): pdb.top100396. doi : 10.1101/pdb.top100396 . ISSN  1940-3402. PMID:  34210774. S2CID  : 235710916.
9. Bioquímica, 3.ª edición, Matthews, Van Holde et al., Addison Wesley Publishing, pág. 977
10. Sapkota, Anupama (3 de junio de 2021). "Southern Blot: definición, principio, pasos, resultados, aplicaciones". Notas sobre microbios . Consultado el 4 de enero de 2023 .

Enlaces externos

• OpenWetWare