La hibridación in situ cromogénica ( CISH ) es una técnica citogenética que combina el método de detección de señales cromogénicas de las técnicas de inmunohistoquímica (IHC) con la hibridación in situ . [1] [2] Se desarrolló alrededor del año 2000 como una alternativa a la hibridación in situ fluorescente (FISH) para la detección de la amplificación del oncogén HER-2/neu. [1] La CISH es similar a la FISH en que ambas son técnicas de hibridación in situ utilizadas para detectar la presencia o ausencia de regiones específicas de ADN. [1] Sin embargo, la CISH es mucho más práctica en los laboratorios de diagnóstico porque utiliza microscopios de campo claro en lugar de los microscopios de fluorescencia más costosos y complicados utilizados en la FISH. [1] [3]
El diseño de las sondas para CISH es muy similar al de FISH, con diferencias solo en el etiquetado y la detección. Las sondas FISH generalmente están etiquetadas con una variedad de etiquetas fluorescentes diferentes y solo se pueden detectar con un microscopio de fluorescencia [4] , mientras que las sondas CISH están etiquetadas con biotina o digoxigenina [5] y se pueden detectar con un microscopio de campo claro después de que se hayan aplicado otros pasos de tratamiento. [1]
Las sondas CISH tienen una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos y están diseñadas para dianas de ADN. Son complementarias a la secuencia diana y se unen a ella después de un paso de desnaturalización e hibridación. Solo unas pocas sondas CISH están disponibles comercialmente, por lo que para la mayoría de las aplicaciones deben extraerse, amplificarse, secuenciarse, marcarse y mapearse a partir de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) . [6] Los BAC se desarrollaron durante el Proyecto Genoma Humano , ya que era necesario aislar y amplificar fragmentos cortos de ADN humano para fines de secuenciación. [7] Hoy en día, los BAC se pueden seleccionar y posicionar en el genoma humano utilizando bases de datos públicas como el UCSC Genome Browser. [6] Esto garantiza una complementariedad óptima y especificidad de secuencia. El ADN se extrae de los clones de BAC y se amplifica utilizando una técnica basada en polimerasa, como la PCR con oligonucleótidos degenerados (DOP). [8] A continuación, se secuencian los clones y se verifica su posición en el genoma. [9] El etiquetado de la sonda se puede llevar a cabo mediante un cebado aleatorio o una traducción de mellas para incorporar biotina o digoxigenina . [10]
Para que la CISH funcione de manera óptima, los cromosomas deben estar en interfase o metafase. Las muestras de tejido se adhieren de forma segura a una superficie, que generalmente es un portaobjetos de vidrio, con parafina. [11] Luego, las muestras de tejido deben lavarse y calentarse varias veces para eliminar cualquier parafina antes del paso de hibridación. Después de esto, la muestra debe someterse a una digestión con pepsina para garantizar que el objetivo sea accesible. [11] Como paso final, se agregan 10-20 μL de sonda, la muestra se cubre con un cubreobjetos que se sella con cemento de goma y el portaobjetos se calienta a 97 °C durante 5-10 minutos para desnaturalizar el ADN. [11] Luego, el portaobjetos se coloca en un horno a 37 °C durante la noche para que la sonda pueda hibridar. [11] [12] Al día siguiente, la muestra se lava y se aplica un bloqueador para sitios de unión de proteínas no específicos. [11] Si se va a utilizar peroxidasa de rábano picante (HRP) , la muestra debe incubarse en peróxido de hidrógeno para suprimir la actividad de la peroxidasa endógena. [11] Si se utilizó digoxigenina como etiqueta de sonda, se aplica un anticuerpo primario anti-digoxigenina fluoresceína seguido de un anticuerpo secundario anti-fluoresceína conjugado con HRP. [1] Si se utilizó biotina como etiqueta de sonda, primero se deben bloquear los sitios de unión no específicos utilizando albúmina de suero bovino (BSA) . [11] Luego, se utiliza estreptavidina conjugada con HRP para la detección. [6] [11] Luego, la HRP convierte la diaminobencidina (DAB) en un producto marrón insoluble, que se puede detectar en un microscopio de campo claro con un aumento de 40 a 60 veces. [11] [13] Se puede utilizar una tinción ligera con hematoxilina como contratinción para hacer que el producto sea más visible. [5]
La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) se considera el estándar de oro para la detección de anomalías cromosómicas porque es muy sensible y tiene una alta resolución. [3] [14] Otras técnicas que se desarrollan para detectar anomalías cromosómicas generalmente se comparan con la sensibilidad y especificidad de la FISH para ver cómo se comparan. [3] [14] Por ejemplo, en comparación con la FISH, se ha demostrado que la CISH tiene una sensibilidad del 97,5 % y una especificidad del 94 % para la detección de la amplificación del gen HER-2/neu. [3] La tasa de concordancia entre la FISH y la CISH fue del 94,8 %, lo que demuestra que la CISH es una técnica comparable a la FISH. [3] La mayoría de las demás fuentes coinciden e informan de un rendimiento casi igual en los ensayos de amplificación genética para la FISH y la CISH. [15] [16] Sin embargo, a veces la CISH muestra una sensibilidad menor para las amplificaciones de bajo nivel. [1]
La CISH tiene algunas ventajas sobre la FISH en los reactivos y el equipo que utiliza. Como se señaló anteriormente, la CISH es mucho más barata y es más fácil de usar porque utiliza microscopios de campo claro en lugar de microscopios de fluorescencia. [1] [3] Además, los reactivos de CISH son más estables que los reactivos de FISH, por lo que es posible almacenar las muestras y examinar la misma muestra varias veces. [3] [14] Los reactivos de FISH se desvanecen con el tiempo debido al fotoblanqueo, por lo que una muestra solo se puede examinar una vez. [3] [14] Además del costoso microscopio de fluorescencia, la FISH también requiere una cámara digital de alta resolución para capturar micrografías de la muestra antes de que la fluorescencia se desvanezca. [14] Otra ventaja de utilizar la microscopía de campo claro es que la muestra de tejido o célula en su conjunto se puede visualizar a través de la CISH, mientras que la morfología celular es difícil de evaluar utilizando la microscopía de fluorescencia en la FISH. [3] [14]
La CISH también se diferencia de la FISH en las sondas que se utilizan, así como en el método en general. Hay muchos tipos diferentes de sondas FISH disponibles, como sondas de repetición, sondas que detectan genes o telómeros específicos y sondas que detectan anomalías cromosómicas. [14] En cambio, hay una variedad limitada de sondas CISH disponibles comercialmente, incluidas las sondas que se unen al centrómero de los cromosomas 3, 7, 8, 9, 10, 11, 17, 18, X e Y, así como sondas específicas de genes para genes relacionados con el cáncer, como HER-2, EGFR, MYC y TOP2A. [14] A pesar de la variedad limitada de sondas CISH disponibles, generalmente son más rentables que las sondas FISH. [14] Con respecto al método general, la FISH se puede realizar mediante marcaje directo (los fluorocromos se unen a las sondas) o marcaje indirecto (las sondas se marcan con biotina o digoxigenina que luego se detectan utilizando estreptavidina o anticuerpos marcados con fluorescencia, respectivamente). [14] La CISH se realiza mediante marcaje indirecto en el que los anticuerpos o la estreptavidina se conjugan con enzimas como HRP o fosfatasa alcalina (AP) . [14]
La CISH y la IHC son similares en el sentido de que ambas se utilizan con el mismo propósito (principalmente para detectar la amplificación de HER-2/neu) y ambas utilizan reacciones enzimáticas (HRP/AP) para medir la amplificación. [13] La CISH y la IHC son diferentes en el sentido de que la IHC mide la expresión de proteínas mientras que la CISH mide la amplificación de ADN. [13] Esta diferencia es particularmente útil para HER-2/neu porque se ha descubierto que la amplificación genética tiene un valor pronóstico mayor que la expresión de proteínas. [17]
Una desventaja de la IHC es que no es posible identificar resultados falsos negativos y falsos positivos. [17] En CISH, si no hay señal para la sonda de referencia, el ensayo ha fallado.
En el caso de sobreexpresión proteica/amplificación génica baja y alta, la CISH y la IHC muestran una concordancia de más del 86 % y más del 89 %, respectivamente. [18] Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales son mejores que los anticuerpos policlonales para la detección tanto en IHC como en CISH, ya que se unen de manera más específica, lo que conduce a una mayor tasa de concordancia. [18]
En el caso de la sobreexpresión de proteínas media/amplificación génica, la concordancia varía, pero es mayor cuando se utilizan anticuerpos monoclonales que cuando se utilizan anticuerpos policlonales. [18] La concordancia variable se debe al hecho de que la amplificación génica no se correlaciona estrictamente con la expresión de proteínas y que la heterogeneidad tumoral puede dificultar la detección de la sobreexpresión de proteínas en un tejido. [18]
La CISH se aplica con frecuencia para evaluar la amplificación de genes, como el estado de HER-2/neu en muestras de cáncer de mama. [2] [19] La amplificación de HER-2/neu se asocia con una mayor mortalidad, una mayor tasa de recurrencia y un mal pronóstico en el cáncer de mama. [20] El anticuerpo monoclonal trastuzumab es un bloqueador de receptores que ha demostrado ser clínicamente muy eficaz en tumores con sobreexpresión de HER-2/neu. [21] Por lo tanto, es crucial determinar el estado del receptor antes de comenzar el tratamiento del cáncer. [21]
La CISH también se utiliza para la detección de reordenamientos y fusiones cromosómicas, como la fusión del dominio de la tirosina quinasa ALK con el promotor y la región 5' de EML4 en el cáncer de pulmón. Los tumores ALK-positivos son un subgrupo clínicamente relevante, ya que pueden tratarse de manera muy eficaz con el inhibidor de ALK crizotinib. [22] [23]
Además de los cánceres, se ha demostrado que la CISH también es útil para detectar infecciones por el virus del papiloma humano. [24]
La SISH utiliza un método similar al CISH, pero el producto final es un precipitado de plata en lugar de un producto marrón. [25] En este método, una sonda marcada con dinitrofenol (DNP) se une a la secuencia diana. [25] Luego se añade un anticuerpo primario anti-DNP seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP. [25] Posteriormente se añaden acetato de plata, hidroquinona y peróxido de hidrógeno al anticuerpo secundario y la HRP cataliza la polimerización de plata en presencia de peróxido de hidrógeno. [25] En consecuencia, el metal plata se deposita en los núcleos de la célula. [25] La amplificación de HER-2/neu se ve como puntos negros. [25]
DuoCISH es una variación de CISH que aborda la necesidad de dos sondas diferentes en el mismo portaobjetos. [26] Es una técnica bien establecida para la detección de la amplificación de HER-2/neu, aunque a veces se informa que es menos eficaz que FISH. [27] En esta técnica, una sonda se une a la referencia que, en el caso de la detección de la amplificación de HER-2/neu, es CEN17 (el centrómero del cromosoma 17), mientras que la otra sonda se une a la secuencia objetivo que es HER-2/neu. [26] [27] DuoCISH combina FISH y CISH en el sentido de que convierte las señales de las sondas FISH en sustratos cromogénicos. [26] [27] Funciona según el principio de que el colorante azul de cianina es un sustrato para HRP y el colorante rojo es un sustrato para AP. Por ejemplo, las señales de isotiocianato de fluoresceína verde (FITC) se convierten en precipitados cromogénicos azules a través de un anticuerpo anti-FITC conjugado con HRP, y las señales de Texas Red se convierten en precipitados cromogénicos rojos a través de un anticuerpo anti-Texas Red conjugado con AP. [26] [27] Una ventaja de DuoCISH es que es posible distinguir entre aneuploidía cromosómica y amplificación genética, ya que el gen de referencia también se amplificará en la aneuploidía pero no en la detección de amplificación genética. [26] [27]