Las proteínas solubles de unión al factor sensible a la N -etilmaleimida ( SNAP , o Sec17p en levadura) son una familia de proteínas adaptadoras citosólicas implicadas en la fusión vesicular en las membranas durante el transporte intracelular y la exocitosis. Las SNAP interactúan con las proteínas del complejo SNARE y NSF para desempeñar un papel clave en el reciclaje de los componentes del complejo de fusión. Las SNAP están implicadas en la preparación del complejo de fusión de vesículas durante el ensamblaje, así como en el desmontaje después de un evento de fusión de vesículas. Después de la fusión de la membrana, el complejo de proteínas SNARE de anclaje se desmonta en respuesta a los cambios estéricos que se originan en la ATPasa NSF . La energía proporcionada por NSF se transfiere a través del complejo SNARE y SNAP, lo que permite que las proteínas se desenreden y se reciclen para futuros eventos de fusión. Los mamíferos tienen tres genes SNAP: α-SNAP , β-SNAP y γ-SNAP . Las SNAP α y γ se expresan en todo el cuerpo, mientras que la SNAP β es específica del cerebro. El homólogo de levadura de la SNAP humana es Sec17, cuyo diagrama estructural se incluye en esta página.
La función de las proteínas SNAP se ha relacionado principalmente con el papel que desempeñan en el ensamblaje y desensamblaje del complejo SNARE necesario para los eventos de fusión de vesículas. Según la hipótesis SNARE desarrollada a principios de la década de 1990, las proteínas SNAP se localizan en las membranas y son fundamentales para mediar la fusión de vesículas dependiente de Ca 2+ en estos sitios. Las SNAP se asocian con las proteínas del complejo SNARE ( SNA PRE ceptor ) , una clase de proteína integral de membrana de tipo II, así como con la ATPasa NSF, en gran medida basada en interacciones electrostáticas . [1] [2] La interacción de las SNAP con las SNARE tiene lugar antes de la interacción del complejo con NSF (Sec18 en levadura), lo que sugiere que puede ser necesaria una secuencia para el ensamblaje de cebado. [1] [3] El complejo ensamblado que incluye SNAP, SNARE y NSF se conoce como complejo 20S. Algunas de las primeras proteínas identificadas como receptores de SNAP fueron la sintaxina 1 , SNAP-25 (proteína asociada al sinaptosoma, 25 kDa) y VAMP ( sinaptobrevina ). [4] Estas proteínas contienen regiones transmembrana que se pueden encontrar tanto en vesículas intracelulares como como parte de la maquinaria de tráfico extracelular. La Figura 1 muestra las interacciones de las proteínas SNARE vesiculares y de membrana con NSF y SNAP en el proceso de ensamblaje, fusión y desensamblaje que acompaña a los eventos de fusión de vesículas.
La unión inicial de NSF a SNAP probablemente esté relacionada con las interacciones de los 63 residuos de aminoácidos N-terminales y 37 C-terminales de SNAP con la proteína NSF . [5] La interacción con SNAP estimula la actividad ATPasa de NSF cuando se ensambla en el complejo 20S y, en última instancia, conduce a la hidrólisis de ATP que da como resultado la interrupción del complejo heterooligomérico. [6] Esto tiene el potencial de reducir o bloquear la transmisión sináptica , lo que en última instancia conduce a la pérdida de la señalización aguas abajo. Se incluye más información sobre esto en la sección de toxicología a continuación.
Si bien el ensamblaje del complejo solo puede tener lugar bajo condiciones en las que están presentes los componentes y la membrana , el desensamblaje requiere que el NSF pueda hidrolizar el ATP. [1] Por lo tanto, se ha utilizado agentes quelantes , análogos no hidrolizables de GTP o la aplicación de un agente alquilante N-etilmaleimida (NEM) para demostrar la prevención de la fusión de vesículas in vitro . [4] El bloqueo del ensamblaje del complejo 20S también evita que se produzca la reacción de hidrólisis del ATP en el NSF .
La teoría SNARE de fusión de vesículas describe el mecanismo de acción de las SNARE, SNAP y NSF , pero no explica por completo toda la cinética conocida relacionada con la fusión de vesículas . La teoría fue propuesta por primera vez por James Rothman y sus colaboradores a principios de la década de 1990 y predijo que las SNAP y NSF reconocían complejos emparejados vesícula-SNARE (v-SNARE)/diana-SNARE (t-SNARE) en las membranas y se unían a ellos creando así el complejo 20S. Estos complejos forman estructuras similares para los sistemas sinápticos y vacuolares, incluido el transporte de Golgi.
Los datos generados experimentalmente en los últimos años llevan a algunos a cuestionar la integridad del modelo. Aunque se sabía desde la década de 1960 que la entrada de Ca 2+ era responsable de la señalización sináptica, una colaboración en 1992 entre Thomas Südhof y Reinhardt Jahn vinculó el calcio, los complejos SNARE y la señalización sináptica, lo que sugiere que los eventos de fusión de vesículas no estaban limitados por la velocidad de formación del complejo SNARE como se pensaba anteriormente. En ese momento, el modelo del complejo SNARE no podía explicar la rápida liberación de neurotransmisores en las hendiduras sinápticas, ya que se pensaba que la disociación y el reciclaje del complejo limitaban la velocidad de la fusión de vesículas posteriores.
Estudios posteriores demostraron que el paso de hidrólisis del ATP ocurre antes de un evento de fusión mediado por iones de calcio, lo que revela que las proteínas SNAP y NSF inician el desmontaje del complejo 20S antes de que se produzca el evento de acoplamiento directamente en la membrana. La existencia de estas vesículas preparadas por ATP para la fusión en la membrana presináptica se ve facilitada por las interacciones de SNAP y NSF.
Ahora se sabe que el complejo 20S no se disocia inmediatamente después de la hidrólisis del ATP, sino que permanece unido hasta que el Ca 2+ intracelular alcanza niveles significativamente altos para facilitar el acoplamiento. Una corriente despolarizante que conduce a la apertura de canales iónicos dependientes del voltaje permite la entrada de Ca 2+ a la célula, donde la proteína de fijación molecular (una SNARE) llamada sinaptotagmina actúa de manera sensible al Ca 2+ para facilitar la fusión de la vesícula con la membrana hasta una velocidad de una vesícula por 100µs. Por lo tanto, la exocitosis de neurotransmisores regulada por el Ca 2+ tiene una cinética más rápida que la que sería posible con el modelo de reciclaje de SNARE solo. La Figura 1 resume el modelo actualizado de la hipótesis SNARE.
El complejo 20S es un objetivo conocido de las neurotoxinas de Clostridium, incluidas las toxinas botulínicas A, C y E , que bloquean la transmisión sináptica al interrumpir el complejo y evitar la liberación de neurotransmisores en el espacio sináptico. La interrupción de la transmisión sináptica es causada por las toxinas del serotipo B que escinden VAMP-2/sinaptobrevina-2, pero no las proteínas SNARE de tipo 1. Las toxinas botulínicas no interactúan directamente con SNAP, pero afectan indirectamente su capacidad de ensamblarse en el complejo 20S, lo que conduce a una transmisión sináptica deteriorada en la unión neuromuscular. El bloqueo de la liberación de acetilcolina en la placa terminal conduce a la parálisis muscular y, si no se trata, a la muerte. El envenenamiento por toxina botulínica generalmente ocurre a través de la ingestión de material contaminado con la bacteria productora de toxina o la absorción de la toxina a través de la piel.
Los complejos SNARE que contienen SNAP también son objetivos de la toxina del tétanos , que también inhibe la fusión de vesículas y la liberación de neurotransmisores a través del transporte anterógrado de la toxina al SNC. La prevención del ensamblaje del complejo SNARE 20S debido a la escisión de las proteínas sustituyentes impide que las SNAP interactúen con las proteínas receptoras de manera no competitiva.
La expresión de las tres proteínas SNAP en mamíferos depende del tejido, con α-SNAP (33 kD) y γ-SNAP (36 kD) expresadas en todo el cuerpo, y β-SNAP (34 kD) encontrada principalmente en los tejidos cerebrales. [1] α-SNAP y β-SNAP comparten aproximadamente el 83% de homología de secuencia y están codificadas por NAPA y NAPB en los cromosomas 19 y 18 , respectivamente en humanos. [7] La proteína β-SNAP está codificada por NAPB en el cromosoma 20. Se han observado cambios en la expresión temporal en modelos de roedores durante el desarrollo embrionario, pero aún se deben verificar cambios similares en humanos. [1] Los datos de expresión en los primeros años después del descubrimiento del grupo de proteínas en la década de 1990 se confirmaron principalmente mediante el uso de Western blot y permitieron la expresión del ARNm y luego del ADNc . El uso de la localización inmunofluorescente mostró una fuerte asociación de las proteínas con las membranas intracelulares, incluidos el RE y los cuerpos de Golgi , así como las vesículas . [8]
También se ha descubierto que las deleciones en el gen α-SNAP son letales en el útero en modelos de roedores con hyh (hidrocefalia con marcha a saltos) [9], mientras que la hyh debida a mutaciones sin sentido conduce a niveles de expresión un 40 % más bajos. [10] Los efectos de las mutaciones se desarrollan en el útero y se vuelven más graves con el tiempo, lo que finalmente conduce al empeoramiento de la hidrocefalia y la muerte. La expresión reducida de α-SNAP en ratones hyh/hyh también está asociada con la deficiencia de citocinas efectoras de células T CD4. [11]
El homólogo de la levadura (S. cerevisiae ) del gen SNAP conocido como Sec17p tiene un 67% de similitud con el α-SNAP de mamíferos [1] o aproximadamente un 34% de homología con alfa y un 33% con beta. [8] Se ha estudiado en función de su función en la fusión vacuolar de levadura. [2] La letalidad de la mutación doble nula en este animal resalta la importancia de esta clase de proteínas en la comunicación y supervivencia intra e intercelular.
El uso de técnicas de imágenes TEM y FRET se aplicó ampliamente a principios de siglo para resolver el complejo SNARE y se expandió para incluir también las proteínas SNAP. El complejo 20S finalmente forma una varilla de 2,5 nm de ancho por 15 nm de largo que se ensambla a lo largo del eje de dos bobinas enrolladas de proteínas SNARE que interactúan. [4] [12] La unión de SNAP al lado lateral de la varilla del complejo SNARE tiene lugar en la membrana durante el paso de cebado. Esta interacción requiere residuos N-terminales intactos 63 y 37 en la proteína SNARE [12] que pueden interactuar directamente con uno o más dominios alfa-helicoidales de SNAP. También se ha demostrado que la unión de NSF a α-SNAP se ve afectada negativamente por la fosforilación de NSF o el mutante Y83E que muestra propiedades fosfomimáticas. [13] El desenrollado de las estructuras en espiral después de la hidrólisis de ATP por NSF también está acompañado por un cambio conformacional en la sintaxina (SNARE) antes de la fusión de vesículas.
Estos hallazgos estructurales se han confirmado mediante el uso de EM Quick-Freeze/Deep-Etch que también describe el complejo ternario SNARE como un conjunto similar a una varilla alargada alrededor de las proteínas SNARE con unión N-terminal de SNAP. [14]
El homólogo de levadura Sec17, que se muestra en la imagen de arriba, contiene catorce hélices α y tiene dimensiones aproximadas de 85 Å × 35 Å × 35 Å con múltiples residuos conservados a lo largo de la cara de empaquetamiento de la proteína. [5] Recientemente se ha informado en la literatura sobre el bloqueo de la interacción de Sec17/SNAP con SNARE y Sec18/NSF utilizando pequeñas moléculas que se unen a PA (ácido fosfatídico) para prevenir la actividad de cebado y limitar la fusión de vesículas. [3]
El bloqueo del ensamblaje del complejo SNARE y, por lo tanto, la interferencia indirecta con la función de SNAP, tiene una amplia variedad de aplicaciones, como lo demuestra la diversa utilidad terapéutica del Botox, que se puede utilizar para bloquear la fusión de vesículas y la liberación de neurotransmisores. Se ha descubierto que la focalización de los receptores de la proteína SNAP causa enfermedades y tiene una amplia aplicación cuando se la utiliza con terapias.
A continuación se describen publicaciones recientes que indican asociaciones más directas de las SNAP en el curso y desarrollo de enfermedades. Cabe destacar que el papel de las SNAP en los estados patológicos todavía está relacionado principalmente con su interacción como parte de los complejos SNARE. A menudo se observan niveles anormales de múltiples proteínas de tráfico vesicular en conjunto y un efecto compuesto puede provocar una alteración en la señalización.
En un estudio de marcadores neuroendocrinos en cáncer colorrectal , se encontró que la expresión de α-SNAP y β-SNAP era mayor en células indiferenciadas en comparación con los controles, y se asoció con una enfermedad más agresiva. [15] De manera similar, también se encontró que la expresión de otras proteínas de tráfico de vesículas, incluidas la sinaptofisina , SNAP-25 (SNARE) , VAMP2 y sintaxina-1 , tenían varios niveles de aumento en carcinomas indiferenciados de células pequeñas . [11]
Se ha informado previamente de anomalías en la señalización y el tráfico de proteínas en células cancerosas basándose en interacciones del complejo SNARE para α-SNAP dentro de la implicación de su papel como regulador negativo de la autofagia y la vía MAPK a través de la desfosforilación. [16] Se ha informado que el agotamiento de α-SNAP afecta la integridad del cuerpo de Golgi y el ensamblaje de proteínas de fusión de vesículas en las uniones de señalización, mientras que la sobreexpresión retrasa la apoptosis en células HeLa. [16]
La asociación de α-SNAP con las proteínas v-SNARE (vesícula), t-SNARE (diana) con sinatxina-1 forma el complejo 7S SNARE en neuronas centrales utilizadas en el transporte de vesículas. [10] Se ha documentado que la regulación negativa de alfa SNAP aumenta la susceptibilidad a las convulsiones en modelos de roedores. En el mismo estudio se ha observado una disminución de la expresión de alfa SNAP en pacientes con epilepsia del lóbulo temporal, así como en el modelo de rata epiléptica . [17] También se observó una acumulación de los complejos 7S en la sinapsis del hipocampo en modelos de roedores crónicos para la epilepsia . [18] El mecanismo sospechoso puede implicar la preparación del complejo SNARE-SNAP-NSF para aumentar la fusión de vesículas en las membranas, sin embargo, el mecanismo exacto por el cual ocurre la regulación positiva del complejo 7S no se entiende bien.
En un estudio sobre el desarrollo cerebral fetal, se encontró que los niveles de β-SNAP eran comparables entre muestras tomadas de individuos con síndrome de Down (SD) y no afectados. La presencia de α-SNAP en comparación solo se observó en la mitad de las muestras con SD . [19] [7] La reducción de α-SNAP junto con otros cambios observados en la expresión de proteínas pueden indicar una sinaptogénesis alterada desde una etapa muy temprana del desarrollo.
Las proteínas de fusión de vesículas evaluadas en un estudio de un modelo de roedores con enfermedad de Huntington (HD) encontraron niveles más altos de α-SNAP en el hipocampo y una menor expresión en el cuerpo estriado de ratones HD en comparación con los controles. [20] Es notable que muchas otras proteínas involucradas en la fusión de vesículas también experimentaron una disminución de la expresión en el cuerpo estriado junto con un aumento de la expresión en el hipocampo y los efectos contribuyentes aún no pudieron deconvolucionarse. La interacción del gen huntingtina mutante y las proteínas de fusión de vesículas también pueden ser potencialmente responsables del desarrollo sináptico alterado o la degeneración observada en la enfermedad. [7]
Se observó una regulación positiva de α-SNAP en ratones con la proteína gamma 14-3-3 inactivada, lo que sugiere una relación entre la progresión pero no la patogénesis de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) . Los niveles elevados de proteínas 14-3-3 se utilizan con fines diagnósticos para confirmar la ECJ, pero según la literatura, es posible que no desempeñen un papel causal en la enfermedad. [21] [7]
La interacción de α-SNAP con los receptores AMPA para glutamato puede ser un objetivo potencial para mejorar la plasticidad sináptica a través del mecanismo de estabilización en las membranas donde están presentes las SNAP. [7] Además, α-SNAP ha sido implicado en la exocitosis de surfactante y acrosómica en células alveolares y espermatozoides respectivamente, aunque el mecanismo exacto aún está por identificar. Las isoformas de la proteína SNAP no son un objetivo farmacológico en la actualidad y pueden resultar difíciles de atacar ya que cumplen principalmente una función de andamiaje. La insuficiencia en la expresión está indicada en una serie de condiciones neurodegenerativas e inmunológicas donde la estrategia de tratamiento principal puede centrarse en la terapia génica como opción de reemplazo.
El potencial de aplicación en la terapia clínica incluye el desarrollo de reguladores específicos para β-SNAP para el tratamiento de patologías del sistema nervioso central, incluida la epilepsia. [1] El uso de polifosfatos de inositol para inhibir las interacciones de β-SNAP y sinaptogamina también puede bloquear la liberación de neurotransmisores y puede ser potencialmente útil en regulaciones más amplias de las redes sinápticas.
Agentes de moléculas pequeñas que pueden usarse para bloquear la actividad del complejo SNARE a través de la interacción con SNAP y que se han usado in vitro [3] , pero su uso práctico puede extenderse también a sistemas in vivo. En cánceres colorrectales donde se observaron niveles elevados de α-SNAP , se puede emplear la tecnología de ARNi para reducir la sobreexpresión [7] , pero la novedad de esta tecnología puede ser limitada hasta que se obtenga más experiencia con la plataforma y se demuestre claramente su seguridad.
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