En biología molecular , las endonucleasas son enzimas que escinden el enlace fosfodiéster dentro de una cadena de polinucleótidos (es decir, ADN o ARN ). Algunas, como la desoxirribonucleasa I , cortan el ADN de forma relativamente inespecífica (sin tener en cuenta la secuencia), mientras que muchas, normalmente llamadas endonucleasas de restricción o enzimas de restricción , cortan sólo en secuencias de nucleótidos muy específicas. Las endonucleasas se diferencian de las exonucleasas en que escinden los extremos de las secuencias de reconocimiento en lugar de la porción media ( endo ). Sin embargo, algunas enzimas conocidas como " exoendonucleasas " no se limitan a ninguna de las funciones nucleasas y muestran cualidades que son tanto endo como exo. [1] La evidencia sugiere que la actividad de la endonucleasa experimenta un retraso en comparación con la actividad de la exonucleasa. [2]
Las enzimas de restricción son endonucleasas de eubacterias y arqueas que reconocen una secuencia de ADN específica. [3] La secuencia de nucleótidos reconocida para la escisión por una enzima de restricción se denomina sitio de restricción . Normalmente, un sitio de restricción será una secuencia palindrómica de aproximadamente cuatro a seis nucleótidos de longitud. La mayoría de las endonucleasas de restricción escinden la cadena de ADN de manera desigual, dejando extremos monocatenarios complementarios. Estos extremos pueden volver a conectarse mediante hibridación y se denominan "extremos adhesivos". Una vez apareados, los enlaces fosfodiéster de los fragmentos pueden unirse mediante ADN ligasa . Se conocen cientos de endonucleasas de restricción, cada una de las cuales ataca un sitio de restricción diferente. Los fragmentos de ADN escindidos por una misma endonucleasa se pueden unir independientemente del origen del ADN. Este tipo de ADN se denomina ADN recombinante ; ADN formado por la unión de genes en nuevas combinaciones. [4] Las endonucleasas de restricción ( enzimas de restricción ) se dividen en tres categorías, Tipo I, Tipo II y Tipo III, según su mecanismo de acción. Estas enzimas se utilizan a menudo en ingeniería genética para producir ADN recombinante para su introducción en células bacterianas, vegetales o animales, así como en biología sintética . [5] Una de las endonucleasas más famosas es Cas9 .
En última instancia, existen tres categorías de endonucleasas de restricción que contribuyen relativamente a la escisión de secuencias específicas. Los tipos I y III son grandes complejos de múltiples subunidades que incluyen actividades tanto de endonucleasas como de metilasa . El tipo I puede escindir en sitios aleatorios de aproximadamente 1000 pares de bases o más de la secuencia de reconocimiento y requiere ATP como fuente de energía. El tipo II se comporta de manera ligeramente diferente y fue aislado por primera vez por Hamilton Smith en 1970. Son versiones más simples de las endonucleasas y no requieren ATP en sus procesos de degradación. Algunos ejemplos de endonucleasas de restricción de tipo II incluyen Bam HI, Eco RI, Eco RV, Hin dIII y Hae III. El tipo III, sin embargo, escinde el ADN a unos 25 pares de bases de la secuencia de reconocimiento y también requiere ATP en el proceso. [4]
La notación comúnmente utilizada para las endonucleasas de restricción [6] es de la forma " Vwx yZ", donde " Vwx " son, en cursiva, la primera letra del género y las dos primeras letras de la especie donde se puede encontrar esta endonucleasa de restricción. por ejemplo, Escherichia coli , Eco , y Haemophilus influenzae , Hin . A esto le sigue el símbolo "y" opcional, sin cursiva, que indica el tipo o la identificación de la cepa, por ejemplo, Eco R para cepas de E. coli que llevan el factor de transferencia de resistencia a medicamentos RTF-1, [6] Eco B para E .coli cepa B, [7] y Hin d para la cepa d de H. influenzae . [6] Finalmente, cuando un tipo o cepa particular tiene varias endonucleasas de restricción diferentes, estas se identifican con números romanos, así, las endonucleasas de restricción de la cepa d de H. influenzae se denominan Hin dI, Hin dII, Hin dIII, etc. Otro ejemplo : " Hae II" y " Hae III" se refieren a la bacteria Haemophilus aegyptius (cepa no especificada), endonucleasas de restricción número II y número III, respectivamente. [4] : 64–64 Las enzimas de restricción utilizadas en biología molecular generalmente reconocen secuencias diana cortas de aproximadamente 4 a 8 pares de bases. Por ejemplo, la enzima Eco RI reconoce y escinde la secuencia 5' – GAATTC – 3'. [8]
Las endonucleasas de restricción son de varios tipos. Una endonucleasa de restricción normalmente requiere un sitio de reconocimiento y un patrón de escisión (típicamente de bases de nucleótidos: A, C, G, T). Si el sitio de reconocimiento está fuera de la región del patrón de escisión, entonces la endonucleasa de restricción se denomina Tipo I. Si la secuencia de reconocimiento se superpone con la secuencia de escisión, entonces la enzima de restricción endonucleasa de restricción es de Tipo II. [ cita necesaria ]
Las endonucleasas desempeñan un papel en muchos aspectos de la vida biológica. A continuación se muestran un par de ejemplos de procesos en los que las endonucleasas desempeñan un papel crucial.
Las endonucleasas desempeñan un papel en la reparación del ADN. La endonucleasa AP , específicamente, cataliza la incisión del ADN exclusivamente en los sitios AP y, por lo tanto, prepara el ADN para la escisión posterior, la síntesis de reparación y la ligadura del ADN. Por ejemplo, cuando se produce depurinación, esta lesión deja un azúcar desoxirribosa al que le falta una base. [9] La endonucleasa AP reconoce este azúcar y esencialmente corta el ADN en este sitio y luego permite que continúe la reparación del ADN. [10] Las células de E. coli contienen dos endonucleasas AP: endonucleasa IV (endoIV) y exonucleasa III (exoIII), mientras que en eucariotas, solo hay una endonucleasa AP. [11]
La reparación del ADN en la que las dos hebras complementarias están unidas mediante un enlace cruzado covalente entre hebras requiere múltiples incisiones para desconectar las hebras y eliminar el daño. Se requieren incisiones en ambos lados del entrecruzamiento y en ambas hebras del ADN dúplex. En las células madre embrionarias de ratón, una etapa intermedia de reparación entrecruzada implica la producción de roturas de doble hebra. [12] MUS81 / EME1 es una endonucleasa de estructura específica implicada en la conversión de enlaces cruzados entre cadenas en roturas de doble cadena de una manera dependiente de la replicación del ADN. [12] Después de la introducción de una rotura de doble hebra, se requieren pasos adicionales para completar el proceso de reparación. Si un entrecruzamiento no se repara adecuadamente, puede bloquear la replicación del ADN . [ cita necesaria ]
La exposición del bacteriófago (fago) T4 a la irradiación ultravioleta induce dímeros de timina en el ADN del fago. El gen del fago T4 denV codifica la endonucleasa V que cataliza los pasos iniciales en la reparación de estos dímeros de timina inducidos por los rayos UV. [13] La endonucleasa V primero escinde el enlace glicosílico en el lado 5' de un dímero de pirimidina y luego cataliza la escisión del enlace fosfodiéster del ADN que originalmente unía los dos nucleótidos del dímero. Los pasos posteriores en el proceso de reparación implican la eliminación de los restos del dímero y la síntesis de reparación para llenar el espacio de una sola hebra resultante utilizando la hebra intacta como plantilla. [ cita necesaria ]
Durante la apoptosis, la endonucleasa apoptótica DFF40 se activa para iniciar el desensamblaje celular controlado. Esta desintegración se caracteriza por la escisión del ADN genómico en fragmentos específicos. La función precisa de las endonucleasas en este contexto es escindir el ADN en sitios específicos, generando fragmentos con longitudes definidas. Luego, estos fragmentos se empaquetan en cuerpos apoptóticos, lo que garantiza una eliminación ordenada y eficiente de la célula moribunda sin causar inflamación ni daño a las células vecinas. [14]
La endonucleasa flap 1 (FEN1) y la endonucleasa Dna2 son parte integral de la replicación del ADN en la cadena rezagada y participan en procesos cruciales como la eliminación del cebador y el procesamiento del fragmento de Okazaki . Las endonucleasas participan activamente en el procesamiento de estos fragmentos escindiendo los enlaces fosfodiéster entre ellos. Este proceso es parte integral de la síntesis y unión perfecta de los fragmentos de Okazaki, lo que contribuye a la continuidad general de la cadena de ADN recién replicada. [15] [16]
Las endonucleasas, más concretamente la endoribonucleasa , desempeñan un papel crucial en el procesamiento del ARN, un paso fundamental en la expresión génica. Este proceso implica la escisión precisa de moléculas de ARN precursoras, guiada por endonucleasas, para generar ARN funcionales esenciales para diversas funciones celulares. Las endonucleasas escinden selectivamente los ARN precursores en sitios específicos, definiendo los límites de los segmentos de ARN funcionales durante el procesamiento del ARN. El resultado del procesamiento del ARN es la producción de moléculas de ARN funcionales, como los ARN de transferencia (ARNt) y los ARN ribosómicos (ARNr) . Las endonucleasas contribuyen a la precisión de este proceso, asegurando la formación de especies de ARN maduras y funcionales.
Las endonucleasas como la RNasa P y la tRNasa Z (ELAC2) transforman los ARNt precursores en ARNt maduros y funcionales, cruciales para una traducción precisa durante la síntesis de proteínas. [17] En la biogénesis de los ribosomas, las endonucleasas de la familia RNasa III , como DROSHA , desempeñan un papel en el procesamiento de los ARNr precursores, contribuyendo al ensamblaje de ribosomas funcionales. [18]
DICER y DROSHA, también de la familia RNasa III, desempeñan un papel en el procesamiento de pre-miARN a miARN funcional. [19]
La endonucleasa DNase1L2 también contribuye de manera destacada a la eliminación de ADN durante la formación del cabello y las uñas. Este proceso es esencial para la maduración de las estructuras del cabello y las uñas y es crucial para la transformación de las células en estructuras duraderas y queratinizadas , asegurando la fuerza e integridad del cabello y las uñas. [20]
Se pueden encontrar endonucleasas de restricción que escinden el ADNds (ADN bicatenario) estándar, o el ADNss (ADN monocatenario) estándar, o incluso el ARN. [ cita necesaria ] Esta discusión está restringida al dsDNA; sin embargo, la discusión se puede extender a lo siguiente:
Además, actualmente se están realizando investigaciones para construir endonucleasas de restricción sintéticas o artificiales, especialmente con sitios de reconocimiento que sean únicos dentro de un genoma. [ cita necesaria ]
Las endonucleasas de restricción o las enzimas de restricción normalmente se escinden de dos maneras: patrones con extremos romos o con extremos pegajosos. Un ejemplo de endonucleasa de restricción de tipo I. [4] : 64
Además, existen endonucleasas no específicas de ADN/ARN , como las que se encuentran en Serratia marcescens , que actúan sobre ADNds, ADNss y ARN. [ cita necesaria ]
A continuación se muestran tablas de endonucleasas procarióticas y eucariotas comunes. [21]
El xeroderma pigmentosa es una enfermedad rara, autosómica recesiva, causada por una endonucleasa específica de los rayos UV defectuosa. Los pacientes con mutaciones no pueden reparar el daño en el ADN causado por la luz solar. [26]
La anemia falciforme es una enfermedad causada por una mutación puntual. La secuencia alterada por la mutación elimina el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción MstII que reconoce la secuencia de nucleótidos. [27]
Las mutaciones de la endonucleasa de empalme del ARNt causan hipoplasia pontocerebelosa. Las hipoplasias pontocerebelosas (PCH) representan un grupo de trastornos neurodegenerativos autosómicos recesivos causados por mutaciones en tres de las cuatro subunidades diferentes del complejo de endonucleasa de empalme de ARNt. [28]
