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Péptido hibridante de colágeno

Esquema de una cadena de CHP (marcada con una etiqueta "X") que se hibrida con cadenas de colágeno desnaturalizadas y forma una triple hélice de colágeno. Durante la progresión de la enfermedad, el desarrollo tisular o el envejecimiento, el colágeno puede degradarse en gran medida por las proteasas colagenolíticas, lo que hace que su triple hélice se despliegue a la temperatura fisiológica debido a la estabilidad térmica reducida. La X puede representar una etiqueta de biotina o fluorescente.

Un péptido hibridante de colágeno ( CHP ) es una secuencia de péptidos sintéticos con típicamente de 6 a 10 unidades repetidas del triplete de aminoácidos Gly-Xaa-Yaa, que imita la secuencia característica de los colágenos naturales . [1] [2] Un péptido CHP generalmente posee un alto contenido de prolina e hidroxiprolina en las posiciones Xaa y Yaa, lo que le confiere una fuerte propensión a formar la conformación de triple hélice única del colágeno . [1] [3] En el estado monocatenario (monomérico), el péptido puede reconocer hebras de colágeno desnaturalizadas en los tejidos formando una triple hélice hibridada con las hebras de colágeno. [2] Esto ocurre a través del ensamblaje de la cadena de triple hélice y el enlace de hidrógeno entre cadenas, de manera similar a los cebadores que se unen a las hebras de ADN fundidas durante la PCR . [4] La unión no depende de una secuencia o epítopo específico del colágeno, lo que permite que los CHP se dirijan a cadenas de colágeno desnaturalizadas de diferentes tipos. [5] [6]

Colágeno, CHP, CMP y CLP

Esquema que muestra la relación entre el CMP y el CHP. Los CMP de triple hélice se pueden calentar (por encima de una temperatura definida) para disociarse en CHP monoméricos; al enfriarse, las cadenas de CHP pueden volver a ensamblarse en una triple hélice con el tiempo.

El colágeno es el componente principal de la matriz extracelular (ECM). [7] La ​​superfamilia del colágeno consta de 28 tipos diferentes de colágeno. [7] Aunque la función y la estructura jerárquica de estos colágenos pueden variar, todos comparten la característica estructural definitoria conocida como triple hélice, [1] donde tres hélices zurdas de tipo poliprolina II (PPII) se ensamblan para formar un motivo helicoidal superenrollado dextrógiro. [1] [8] Los péptidos sintéticos cortos conocidos como péptidos miméticos de colágeno (CMP) o péptidos similares al colágeno (CLP) han desempeñado un papel importante en la elucidación de la estructura 3D de la triple hélice del colágeno , su cinética de plegamiento y estabilidad térmica como pequeños modelos de triple hélice. [3] [9] [10] [11] Los CMP, CLP y CHP son muy similares en términos de sus secuencias de aminoácidos, pero solo cuando los CMP o CLP se calientan por encima de sus temperaturas de fusión, existen en estado disociado, monocatenario y pueden considerarse CHP. [2]

Mecanismo de encuadernación

Los CHP monocatenarios se unen a cadenas de colágeno desnaturalizadas y gelatina de una manera que es única de otros mecanismos de focalización, en el sentido de que reconocen específicamente un motivo estructural único ( triple hélice de colágeno ) para el plegamiento y ensamblaje de la cadena, a diferencia de la unión de epítopos específicos que se observa para los anticuerpos monoclonales (mAbs), por ejemplo. [12] Debido a su mecanismo de focalización único, los CHP tienen una alta especificidad de unión hacia las cadenas de colágeno desnaturalizadas, pero casi no tienen afinidad por el colágeno intacto (triple hélice). [13] Los CHP pueden dirigirse ampliamente a las cadenas de colágeno que han sido desnaturalizadas por procesos térmicos, [13] químicos, [14] mecánicos, [15] o enzimáticos, [13] así como a múltiples tipos de colágeno (p. ej., Col I , II , IV ). [5] [6] Los estudios también mostraron que los CHP y sus conjugados fluoróforos tienen una estabilidad superior en contacto con el suero. [16]

Colágeno desnaturalizado como biomarcador de remodelación y daño tisular

Imagen de fluorescencia de una sección transversal axial del corazón de un ratón el día 14 después de un infarto de miocardio, teñida con Hoechst 33342 (azul) y CHP marcado con biotina (detectado con AlexaFluor647-estreptavidina, rojo). Barra de escala: 1 mm.

El recambio controlado de colágeno es crucial para el desarrollo embrionario, la morfogénesis de órganos, así como el mantenimiento y la reparación de tejidos. [17] Sin embargo, los cambios en la homeostasis del colágeno están asociados con numerosas enfermedades y condiciones patológicas. La degradación excesiva del colágeno puede estar asociada con la metástasis del cáncer , el envejecimiento de la piel , la artritis y la osteoporosis . [17] Los CHP pueden dirigirse a los tejidos que experimentan remodelación en función de su capacidad para unirse a las hebras de colágeno degradadas y desplegadas a través de la formación de una triple hélice. Como fracción de focalización, los CHP ofrecen un gran potencial en histopatología , diagnóstico y administración de fármacos para una amplia gama de enfermedades.

La mayoría de los métodos para la evaluación de la desnaturalización del colágeno en estados patológicos son indirectos, como la detección de la actividad de la metaloproteinasa de matriz (MMP) o la cuantificación de fragmentos de péptidos de colágeno en orina, suero o líquido sinovial . [18] [19] [20] Al utilizar métodos convencionales para dirigirse directamente al colágeno, los investigadores han tenido que confiar en péptidos de unión al colágeno seleccionados por visualización de fagos , [21] derivados de proteínas de unión al colágeno, [22] o anticuerpos generados contra colágenos. Desafortunadamente, estos compuestos no pueden dirigirse a colágenos desnaturalizados que no están estructurados y no presentan un epítopo 3D definido. Además, los anticuerpos que se informó que distinguen fragmentos de colágeno degradados específicos solo pueden reconocer uno o unos pocos tipos de colágeno. [2] [23] Por el contrario, los CHP, en principio, pueden unirse a todos los tipos de colágenos desnaturalizados. [4] [5] [6]

Aplicaciones

Tinción de tejidos

Imagen de fluorescencia de una sección sagital de un embrión de ratón de 18 dpc teñido dos veces con CHP biotinilado (detectado por AlexaFluor647-estreptavidina, naranja) y un anticuerpo anti-colágeno I (detectado por IgG anti-conejo de burro marcado con AlexaFluor555 H&L, cian). mx, maxilar; md, hueso mandibular; bp, hueso basilesfenoides; bo, hueso basioccipital; vc, columna vertebral; rb, costilla; h, hueso de la cadera; d, huesos digitales. Barra de escala: 3 mm.

Los CHP marcados con fluoróforos o biotina se utilizan como agente de tinción para detectar la degradación y desnaturalización del colágeno mediante aplicaciones de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica . [5] Los CHP pueden teñir secciones de tejido congelado , secciones fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE), [5] así como tejidos frescos. [14] [15] Los CHP se pueden aplicar a muestras de tejido de múltiples especies y una variedad de enfermedades, como infarto de miocardio , artritis , nefritis y fibrosis . [5]

Imágenes in vivo

Los CHP también se pueden marcar con fluoróforos de infrarrojo cercano para obtener imágenes fluorescentes in vivo . [13] [24]

Identificación de colágeno

Los CHP se pueden utilizar para visualizar muchos tipos diferentes de bandas de colágeno en geles SDS-PAGE . [6] El colágeno se desnaturaliza mediante el calentamiento en presencia de SDS antes de cargar el gel. Las bandas de colágeno se visualizan a través de la hibridación de CHP-colágeno cuando los geles se tiñen con CHP marcados con fluorescencia. [6]

Detección de daños mecánicos al tejido conectivo

El colágeno ofrece resistencia mecánica a los tejidos que soportan cargas en el cuerpo, como tendones, ligamentos y huesos. A medida que se aplican fuerzas a estos tejidos, la triple hélice de colágeno puede dañarse y desenrollarse, y las CHP permiten la detección a nivel molecular del daño mecánico en dichos tejidos conectivos. [15] [25]

Referencias

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