En clonación molecular y biología , un gen knock-in (abreviatura: KI ) se refiere a un método de ingeniería genética que implica la sustitución uno por uno de información de secuencia de ADN en un locus genético o la inserción de información de secuencia que no se encuentra dentro del locus. . [1] Normalmente, esto se hace en ratones, ya que la tecnología para este proceso es más refinada y existe un alto grado de complejidad de secuencia compartida entre ratones y humanos. [2] La diferencia entre la tecnología knock-in y las técnicas transgénicas tradicionales es que un knock-in implica un gen insertado en un locus específico y, por lo tanto, es una inserción "dirigida". Es lo opuesto a la eliminación genética .
Un uso común de la tecnología knock-in es la creación de modelos de enfermedades. Es una técnica mediante la cual los investigadores científicos pueden estudiar la función de la maquinaria reguladora (por ejemplo, promotores ) que gobierna la expresión del gen natural que se reemplaza. Esto se logra observando el nuevo fenotipo del organismo en cuestión. En este caso se utilizan los BAC y YAC para poder transferir fragmentos grandes.
El knock-in genético se originó como una ligera modificación de la técnica de knockout original desarrollada por Martin Evans , Oliver Smithies y Mario Capecchi . Tradicionalmente, las técnicas knock-in se han basado en la recombinación homóloga para impulsar el reemplazo de genes específicos, aunque se han desarrollado otros métodos que utilizan un sistema mediado por transposones para insertar el gen objetivo. [3] El uso de sitios flanqueantes de loxP que se eliminan tras la expresión de la recombinasa Cre con vectores genéticos es un ejemplo de esto. Las células madre embrionarias con la modificación de interés luego se implantan en un blastocisto viable , que crecerá hasta convertirse en un ratón quimérico maduro con algunas células que tendrán la información genética original del blastocisto y otras células que tendrán las modificaciones introducidas en las células madre embrionarias. La descendencia posterior del ratón quimérico tendrá el gen activado. [4]
La activación genética ha permitido, por primera vez, estudios basados en hipótesis sobre modificaciones genéticas y fenotipos resultantes. Por ejemplo, se pueden inducir mutaciones en el gen p53 humano mediante la exposición al benzo(a)pireno (BaP) y la copia mutada del gen p53 se puede insertar en genomas de ratón. Los tumores de pulmón observados en los ratones knock-in respaldan la hipótesis de la carcinogenicidad del BaP . [5] Los desarrollos más recientes en la técnica knock-in han permitido que los cerdos tengan un gen para la proteína verde fluorescente insertado con un sistema CRISPR/Cas9 , lo que permite inserciones genéticas mucho más precisas y exitosas. [6] La velocidad de activación del gen mediada por CRISPR/Cas9 también permite que se generen modificaciones bialélicas en algunos genes y se observe el fenotipo en ratones en una sola generación, un período de tiempo sin precedentes. [7]
La tecnología knock-in se diferencia de la tecnología knockout en que la tecnología knock-in tiene como objetivo eliminar parte de la secuencia de ADN o insertar información irrelevante de la secuencia de ADN para alterar la expresión de un locus genético específico. La tecnología de activación genética, por otro lado, altera el locus genético de interés mediante una sustitución uno por uno de la información de la secuencia de ADN o mediante la adición de información de secuencia que no se encuentra en dicho locus genético. Por lo tanto, un gen knock-in puede verse como una mutación con ganancia de función y un gen knock-in como una mutación con pérdida de función , pero un gen knock-in también puede implicar la sustitución de un locus genético funcional por un fenotipo mutante que produce cierta pérdida de función. [8]
Debido al éxito de los métodos de activación genética hasta el momento, se pueden vislumbrar muchas aplicaciones clínicas. Ya se ha demostrado que la activación de secciones del gen de la inmunoglobulina humana en ratones les permite producir anticuerpos humanizados que son terapéuticamente útiles. [9] Debería ser posible modificar las células madre en humanos para restaurar la función genética específica en ciertos tejidos, por ejemplo, posiblemente corrigiendo el gen mutante de la cadena gamma del receptor de IL-2 en las células madre hematopoyéticas para restaurar el desarrollo de linfocitos en personas con X. Inmunodeficiencia combinada grave ligada a . [4]
Si bien la tecnología de activación genética ha demostrado ser una técnica poderosa para la generación de modelos de enfermedades humanas y el conocimiento de las proteínas in vivo , aún existen numerosas limitaciones. Muchos de estos se comparten con las limitaciones de la tecnología knockout. En primer lugar, las combinaciones de genes knock-in conducen a una complejidad creciente en las interacciones que los genes insertados y sus productos tienen con otras secciones del genoma y, por lo tanto, pueden provocar más efectos secundarios y fenotipos difíciles de explicar . Además, sólo unos pocos loci, como el locus ROSA26, se han caracterizado lo suficientemente bien como para poder utilizarlos para activaciones genéticas condicionales; haciendo que las combinaciones de reporteros y transgenes en el mismo locus sean problemáticas. La mayor desventaja de utilizar genes knock-in para la generación de modelos de enfermedades humanas es que la fisiología del ratón no es idéntica a la de los humanos y los ortólogos humanos de proteínas expresadas en ratones a menudo no reflejan completamente el papel de un gen en la patología humana. [10] Esto se puede observar en ratones producidos con la mutación de fibrosis ΔF508 en el gen CFTR , que representa más del 70% de las mutaciones en este gen para la población humana y conduce a la fibrosis quística . Si bien los ratones ΔF508 CF presentan los defectos de procesamiento característicos de la mutación humana, no muestran los cambios fisiopatológicos pulmonares observados en los humanos y prácticamente no presentan fenotipo pulmonar. [11] Estos problemas podrían mejorarse mediante el uso de una variedad de modelos animales, y se han generado modelos porcinos (los pulmones de cerdo comparten muchas similitudes bioquímicas y fisiológicas con los pulmones humanos) en un intento de explicar mejor la actividad de la mutación ΔF508. [12]